腈水解酶的特性與應(yīng)用進展研究

肖婧　常雁紅　羅暉

摘要 腈水解酶是一種能將腈類物質(zhì)水解為相應(yīng)羧酸的酶，具有廣泛的底物適應(yīng)性，并且能高效催化單一的反應(yīng)，擁有優(yōu)良的選擇性。它在有機合成、降解腈類化合物以及環(huán)境治理等方面中表現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛力。該研究論述了腈水解酶的來源、特性以及其應(yīng)用方面的進展研究。

關(guān)鍵詞 腈水解酶；催化特性；固定化；應(yīng)用進展

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）20-019-04

Abstract Nitrile hydratase is a kind of material can be hydrolyzed to the corresponding carboxylic acid nitriles enzyme.It has a broad substrate adaptability，and can catalyze the reaction of single，has excellent selectivity to show potential application in organic synthesis，degradation of nitrile compounds and environmental governance aspect.This paper discusses the source，nitrilase characteristics as well as its application research progress.

Key words Nitrilase； Catalytic characteristics； Immobilization； Application progress

1 腈水解酶概述

1.1 簡介

腈水解酶（EC 3.5.5.1）又稱腈酶，屬于腈代謝酶系中的一種，是重要的工業(yè)用酶，也是重要的生物催化劑。它能夠水解碳氮肽鍵來生產(chǎn)更加有價值的相對應(yīng)的羧酸[1-2]。腈的化學(xué)水解通常需要高溫強堿性或酸性的條件，易產(chǎn)生不必要的副產(chǎn)物和大量的無機廢物。而利用腈水解酶催化水解生成羧酸，是通過一步反應(yīng)進行的，體現(xiàn)出優(yōu)越的高選擇性、高效率以及環(huán)境經(jīng)濟性，為降解腈類物質(zhì)提供了一個“綠色”的選擇。到目前為止，腈水解酶被廣泛用于精細化學(xué)品、醫(yī)藥中間體的生產(chǎn)以及腈污染物的生物修復(fù)。

1.2 來源

1.2.1 天然腈水解酶的來源。

在自然界中，幾乎所有的真菌、植物以及動物等有機體的體內(nèi)都會產(chǎn)生脂肪腈或芳香腈如氰脂、蓖麻堿和苯乙腈等。這些腈類化合物不僅能夠提供生物必須儲備氮源，而且能夠起到保護作用，免受其他生物的侵害[3]。

1935年，有學(xué)者提出某些植物組織自身能將腈類化合物轉(zhuǎn)化成羧酸。這些酸類物質(zhì)對植物生長有利，從而論證某些有機羧酸、酰胺等腈類衍生物有助于植物的生長。20世紀60年代，Thimann等得到一種類似化學(xué)法能夠水解腈或酰胺的酶。它是從大麥葉子中提取、純化的。該酶能將3吲哚乙腈水解成為吲哚3乙酸，故將其命名為吲哚乙腈水解酶[4]。隨著研究的不斷深入，他們發(fā)現(xiàn)這種吲哚乙腈水解酶不僅能水解3吲哚乙腈，而且對其他20余種脂肪族和芳香族的腈類化合物都具有催化活性，例如該酶水解底物3氰基吡啶的活力比水解3吲哚乙腈高接近10倍。因此，Thiman等給這種酶賦予一個新的名稱——腈水解酶。

歷史上第一次發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)腈水解酶的微生物菌種的是Hook和Robinson。他們在假單胞菌（Pseudomonas）中利用蓖麻堿天然腈篩選所得到的。該菌水解3氰基吡啶的能力提高1倍[5]。之后，又有許多研究者從微生物和植物中用特定的方法篩選出各種產(chǎn)腈水解酶。目前為止，發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)腈水解酶的有機生物體主要有假單胞菌屬（Pseudomonas）、枯草芽孢桿菌屬（Bacillus）、紅球菌屬（Rhodococcus）、不動桿菌（Acinetobacter）、臭鼻桿菌（Klebsiella ozaenae）、糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）、黑曲霉菌（Aspergillus niger）、鐮刀菌（Fusarium solani）[6-8]?？梢?，腈水解酶主要分布在細菌中。

1.2.2 新型腈水解酶的來源。

傳統(tǒng)用作降解腈化物的腈水解酶大部分均為野生型菌株，但是其收益率和催化特性較低，通常不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，因此利用重組表達酶是一個不錯的途徑[8-10]。由于大腸桿菌的繁殖增長速度快，遺傳特征明顯，大腸桿菌是小規(guī)模的重組酶表達的最常用的宿主細胞。然而，在自然界中所發(fā)現(xiàn)的微生物中的腈水解酶99%以上是不能夠被培養(yǎng)的，可培養(yǎng)獲得的微生物占總數(shù)的不足1%，同時腈水解酶在應(yīng)用上的局限性也阻礙其發(fā)展，故尋找新型腈水解酶且能夠提高其應(yīng)用性能的研究受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。宏基因組學(xué)技術(shù)通過提取特定環(huán)境樣品中的微生物總基因組、構(gòu)建小片段文庫，從中篩選和挖掘功能基因。隨著后基因組時代的到來，基因挖掘技術(shù)也逐步受到重視。該技術(shù)主要根據(jù)實際需要，有針對性地選取某個具有代表性的探針酶為模板，在數(shù)據(jù)庫中進行對比和搜索，深入挖掘具有序列或結(jié)構(gòu)同源性的酶基因，尤其是從未獲得表征或報道的基因，進而可通過設(shè)計特異性引物從目標物種擴增該編碼基因且重組表達。Kaplan等[11]從粗糙鏈孢霉、產(chǎn)黃青霉、小麥赤霉病念珠和玫瑰色紅球菌中，利用基因挖掘技術(shù)，培養(yǎng)出新型腈水解酶，并且能夠用于3氰基吡啶、4氰基吡啶和溴苯腈等工業(yè)上重要底物的轉(zhuǎn)化。由于基因數(shù)據(jù)資源相當豐富，宏基因組技術(shù)和基因組挖掘成為新興領(lǐng)域，在未知基因組數(shù)據(jù)庫中的信息和自然環(huán)境不可培養(yǎng)微生物中為尋找更多有應(yīng)用價值的新型腈水解酶提供了前所未有的機遇。

2 腈水解酶催化特性

2.1 催化機理 按微生物對腈的分解性質(zhì)，可分為腈水解酶和腈水合酶兩種酶[12]。腈水解酶直接催化水解腈類化合物，一步直接生成相應(yīng)的羧酸和氨（RCN+2H2O→RCOOH+NH3↑）[13]，然而腈水合酶催化水解腈類化合物生成相應(yīng)的酰胺（RCN+H2O→RCONH2），接著酰胺在酰胺酶的作用下水解生成羧酸和氨[14]。因此，在對腈類化合物作用機理中，腈水解酶和腈水合酶/酰胺酶雙酶有顯著區(qū)別。根據(jù)氨基酸的同源性，腈水解酶屬于腈水解酶超家族。一種新型的谷氨酸賴氨酸半胱氨酸（GluLysCys）的催化三聯(lián)體被認為是腈水解酶的活性位點，也是整個腈水解酶超家族中的催化殘基部分。它分布在αββα三明治型酶蛋白折疊上[15]。由于底物能和位于催化三聯(lián)體半胱氨酸上的巰基反應(yīng)形成共價鍵，生成巰基酶共價結(jié)合的中間體，從而直接形成羧酸。腈水解酶的活性部位[16]沒有金屬離子，所以大部分金屬離子和金屬離子螯合劑如乙二胺四乙酸、檸檬酸、聚乙烯酸等不會影響酶的活性，但有些能夠與巰基反應(yīng)[17]的離子如銀離子與汞離子等對酶活力有很強的抑制作用。

2.2 游離腈水解酶的催化特性

正是由于腈水解酶擁有優(yōu)異的化學(xué)性質(zhì)、區(qū)域選擇性以及立體選擇性，目前已受到越來越多學(xué)者的研究和關(guān)注[18]。腈水解酶具有催化效率高、操作溫和可控、經(jīng)濟成本低、環(huán)境污染小等優(yōu)點，是降解腈類物質(zhì)的一種“綠色”的選擇。通過利用腈水解酶來水解腈類物質(zhì)，能夠獲得很多化學(xué)法難以得到或產(chǎn)率較低的有機羧酸類產(chǎn)物，因此腈水解酶的研究與應(yīng)用具有巨大的潛力[19]。

然而，許多已知的腈水解酶具有穩(wěn)定性差的劣勢。首先是腈水解酶的溫度穩(wěn)定性。許多研究表明，腈水解酶對高溫的耐受性弱。在低溫條件下，酶的活性會隨著溫度的增加而增強，其穩(wěn)定性基本不變；但是，當溫度高于最適宜的溫度時，酶的結(jié)構(gòu)會被破壞，酶活反而下降[20]。李恒等[21]用惡臭假單胞菌腈水解酶進行研究，發(fā)現(xiàn)腈水解酶在4、30、50 ℃下半衰期分別為240、150和1 h。其次是腈水解酶的pH穩(wěn)定性。在酶促反應(yīng)中，緩沖液的pH在一定程度會影響腈水解酶活性。腈水解酶催化水解有機腈類化合物應(yīng)當在適宜的pH范圍內(nèi)反應(yīng)。絕大多數(shù)腈水解酶的最適pH為7。過堿或過酸的條件都會對酶的結(jié)構(gòu)造成破壞，影響其催化活性。這阻礙了腈水解酶的工業(yè)應(yīng)用。有學(xué)者研究將游離的腈水解酶進行固定化，可以大大提高其穩(wěn)定性[22-26]。

2.3 固定化腈水解酶的催化特性

由于腈水解酶在非常態(tài)條件下極其不穩(wěn)定，游離酶不耐受攪拌器的高剪切力，難以從反應(yīng)混合物過濾或離心恢復(fù)，因此有必要將腈水解酶進行固定化。酶或細胞的固定化不僅有利于提高酶的底物耐受性、熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性以及儲藏穩(wěn)定性，保護酶或細胞免受有毒物質(zhì)侵害，而且有利于產(chǎn)物的后續(xù)分離和反應(yīng)連續(xù)處理等，減少游離酶或細胞恢復(fù)所消耗的昂貴過程[27]。細胞固定化的常規(guī)方法有微膠囊化、交聯(lián)、吸附和包埋。到目前為止，關(guān)于固定化腈水解酶的報道很少，主要有采用殼聚糖固定化細菌、瓊脂、海藻酸鈉、二氧化硅、硅膠、聚丙烯酰胺和聚乙烯醇（PVA）。

Liu等[28]利用固定化重組大腸桿菌腈水解酶轉(zhuǎn)化亞氨基二乙腈合成亞氨基二乙酸，其固定化酶的熱穩(wěn)定性、pH耐受性的范圍都比游離酶的要廣泛，在4 ℃儲存30 d保持90%的酶活，而且其操作穩(wěn)定性在重復(fù)利用9次之后仍保持35%的酶活。利用Streptomyces sp.MTCC 7546 細胞固定化后催化0.1 mol/L丙烯腈，連續(xù)使用 25 次，仍保持65%的初始酶活[29]。Zhen等[30]將Arthrobacter nitroguajacolicus ZJUTB 0699菌種的腈水解酶利用海藻酸鈣包埋固定化后催化丙烯腈，在重復(fù)使用11次之后仍保持接近100%的初始酶活。張代暉等[31]將氨基與環(huán)氧基作為固定化載體，優(yōu)化固定化條件，得出的結(jié)果是除了固定化的最適反應(yīng)溫度、pH以及熱穩(wěn)定性都優(yōu)于游離酶，而且在催化過程中底物苯甘氨腈發(fā)生自消旋立體選擇性強，固定化酶所表現(xiàn)出來的催化效率高、產(chǎn)物構(gòu)型單一等優(yōu)良的性質(zhì)能夠滿足工業(yè)催化的需求。

3 腈水解酶的應(yīng)用進展研究

3.1 在有機合成中的應(yīng)用

目前，利用腈水解酶合成有機羧酸的催化過程具有效率高、選擇性強以及反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，在工業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用與關(guān)注。

瑞士Lonza公司是最早采用腈水解酶催化的方法在工業(yè)上生產(chǎn)B 族維生素煙酸，最近又研究篩選出一種新型的腈水解酶菌種。其工藝原理是，利用腈水解酶和煙酰胺脫氫酶的共同作用，將底物2氰基吡啶與2氰基吡嗪分別降解為合成藥物中間體5羥基吡啶2甲酸與5羥基吡嗪2甲酸，其反應(yīng)選擇性強，轉(zhuǎn)化率接近100%，對比傳統(tǒng)物理化學(xué)方法有極大的優(yōu)勢[32]。

一種重要的有機酸（R）扁桃酸在醫(yī)藥上廣泛用于環(huán)扁桃酸酯、頭孢羥唑、羥芐唑、匹莫林等藥物合成中間體[33]。德國BASF公司的工藝原理是：第一步是苯甲醛和氫氰酸反應(yīng)生成外消旋扁桃腈，其次是優(yōu)化反應(yīng)條件，再者經(jīng)過腈水解酶選擇性拆分，最后得到產(chǎn)物（R）扁桃酸。

另一種重要的工業(yè)化學(xué)品羥基乙酸，又名乙醇酸（glycolic acid），是最簡單的α羥基酸。羥基乙酸在化妝品、黏合劑、金屬清洗、生物降解材料、染色、紡織等方面都有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。馬金偉等從重組質(zhì)粒pETNit出發(fā)，利用不同濃度的錳離子對腈水解酶基因進行易錯PCR，并構(gòu)建隨機突變庫。根據(jù)腈水解酶催化羥基乙腈可導(dǎo)致反應(yīng)體系pH降低的特性，建立了簡便的突變酶篩選方法。經(jīng)過三輪的隨機突變和篩選，從5 000多個克隆中篩選得到一株活性提高的突變菌BL21（DE3）/pETNit Mut3，其催化羥基乙腈的活力達到原始重組菌的5.3倍。

Zhang[2]等利用Acidovorax facilis通過一個關(guān)鍵氨基酸Phe168的定向改造，使得其產(chǎn)腈水解酶活性大大提高，進一步生產(chǎn)1（cyanocyclohexyl） 乙酸，產(chǎn)率達到90%。Rustler等[34]通過熒光假單胞菌合成腈水解酶轉(zhuǎn)化扁桃腈和苯基甘氨腈。

Zhu等[35]利用惡臭假單胞菌cgmcc3830通過表征和功能克隆產(chǎn)芳香腈水解酶，高效地轉(zhuǎn)化氰基吡啶。最近，Kaplan等已從黑曲霉菌和滕倉赤霉菌克隆和異源表達出真菌腈水解酶，能夠直接地轉(zhuǎn)化2氰基吡啶和3氰基吡啶。

3.2 在紡織品改性中的應(yīng)用

腈水解酶催化在紡織品的改性方面具有很大的優(yōu)勢，其催化過程條件溫和，反應(yīng)可控性強，減少能量的消耗，節(jié)約能源。腈水解酶不但能改善紡織物的外觀，還能使其手感變得更加舒適，而且作為一種酶，也是一種蛋白質(zhì)，無毒，可降解，比醇、醛、酸、酯等化工原料更環(huán)保。腈綸分子結(jié)構(gòu)很獨特，呈不規(guī)則的螺旋形構(gòu)象。腈水解酶酶對腈綸上腈基的水解只是纖維表面，不影響纖維主體構(gòu)造，因此可以保留腈綸原有柔軟蓬松的物理機械性能，也不用擔心被腈水解酶水解后紡織物的抗撕抗拉性下降[3]。

王寧等[36]為提高腈水解酶對腈綸纖維的生物酶改性效果，根據(jù)“相似者相容”的原理，選用有機溶劑預(yù)處理方法。利用有機溶劑對腈綸纖維表面產(chǎn)生的膨化、塑化作用，提高腈水解酶的水解能力，最大化地提高腈綸纖維的表面改性效果。試驗結(jié)果驗證了利用苯甲醇預(yù)處理和腈水解酶催化后的腈綸纖維的吸濕性和抗靜電性的能力測試上均得到較大幅度的提高。

3.3 在抗腈類農(nóng)藥作物的應(yīng)用

農(nóng)藥在治理農(nóng)業(yè)和林業(yè)的病蟲害過程中起至關(guān)重要的作用，但是過度使用農(nóng)藥以及農(nóng)藥殘留會給農(nóng)林作物帶來嚴重的危害，造成環(huán)境污染。現(xiàn)在利用微生物生物修復(fù)技術(shù)來降解農(nóng)藥殘留是學(xué)者研究的熱點。這是因為與物理化學(xué)的降解方式相比，利用微生物降解速度快，成本低，操作簡單，不會產(chǎn)生二次污染，成為解決農(nóng)藥問題的經(jīng)濟、安全、有效的方法[37]。目前，最新的研究方向是利用基因工程手段改造腈水解酶菌種，增加其適應(yīng)環(huán)境的能力，從根本上提高微生物降解效率[38]。

氯苯腈、溴苯腈以及碘苯腈都是常用的除草劑。它們在土壤和植物里殘留時間很長。如果不對這些殘留的除草劑等農(nóng)藥進行降解處理，那么會嚴重影響農(nóng)林作物的生長。

有研究人員[39]從土壤細菌K.ozaenae中分離出溴苯腈的降解基因（bxn）。該基因能夠編碼且產(chǎn)生腈水解酶，使得溴苯腈水解成為一種沒有毒性的非除草劑，名為3，5二溴4羥基苯甲酸，再將這種基因植入棉花基因中，從而得到一種能夠抗溴苯腈的轉(zhuǎn)基因植株。近來，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所和中國科學(xué)院上海植物生理研究所共同研究，利用花粉管通道法將抗溴苯腈的bar基因植入我國主要栽培棉花基因中，獲得實踐性的成果[1]。

3.4 在含腈廢水中的應(yīng)用

含腈廢水是指含有腈類（-CN基團）的工業(yè)廢水，主要來自化工、選礦、合成橡膠、纖維和染料等工業(yè)生產(chǎn)過程所排出的污水。有機腈類物如乙腈、丙腈、丙烯腈和丁腈等在工業(yè)生產(chǎn)過程中排放，其氣味刺激性強，毒性大，且難以自然沉降和生物降解。如果直接排放，則會對環(huán)境、動植物和生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重的危害[40]。

含腈廢水的處理方法通常有化學(xué)處理法、生化處理法以及物化處理法。但是，這些方法都需要非?？量痰臈l件如強酸、強堿、高溫、高壓，造成設(shè)備腐蝕嚴重，而且伴隨產(chǎn)生的副產(chǎn)物通常具有腐蝕性和毒性，會產(chǎn)生嚴重的環(huán)境污染[2]。為避免物理法和化學(xué)法產(chǎn)生的不利因素，現(xiàn)在越來越多的學(xué)者采用生物酶的方法降解腈類物質(zhì)，腈水解酶催化過程溫和可控、生成副產(chǎn)物少、環(huán)境污染小以及優(yōu)異的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性。

利用腈水解酶降解腈類化合物的特性，在含腈廢水中投加一定量的產(chǎn)腈水解酶菌株，使其發(fā)展成為優(yōu)勢菌群，接著便能將腈類物質(zhì)降解為相應(yīng)的羧酸，達到環(huán)境治理的目的。由此看來，利用腈水解酶或產(chǎn)腈水解酶的微生物處理含腈廢水，具有很大的發(fā)展?jié)摿?。目前，已有學(xué)者利用全細胞腈水解酶降解廢水中的聚合丙烯腈，而且達到很好的效果[41]。與傳統(tǒng)的物理化學(xué)法相比，腈水解酶法處理含腈廢水，具有高效性、經(jīng)濟性以及環(huán)境污染小等優(yōu)點。

4 結(jié)語

腈水解酶是酶超家族中的一個最重要的酶，能夠?qū)⒂卸镜碾嬷苯愚D(zhuǎn)化成無毒、應(yīng)用價值高的酸。近年來，它越來越受到人們的重視，主要應(yīng)用在化學(xué)工業(yè)中羧酸的合成以及在紡織工業(yè)中的聚合物表面改性和含在污染處理過程腈降解污染物。

雖然腈水解催化性能已被發(fā)掘到一定程度，但因其有限的催化效率和運行穩(wěn)定性而使其在工業(yè)應(yīng)用基本上還未開發(fā)。這些缺點可以通過基因表達和進一步的分子修飾或體外進化克服。此外，探索新的腈水解酶資源及其應(yīng)用已成為研究熱點。

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