視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb）、MMP—3和人細(xì)胞周期素D2（Cyclin—D2）在前列腺癌中的表達(dá)及臨床意義

陽(yáng)翔蓮

摘要：目的：探討Cyclin-D2、MMP-3和pRb蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)及與前列腺癌生物學(xué)行為的關(guān)系.方法：應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)源80例前列腺癌和30例正常前列腺組織中Cyclin-D2、MMP-3和pRb蛋白的表達(dá).結(jié)果： Cyclin-D2、MMP-3和pRb在前列腺癌中的陽(yáng)性率分別為76.25%、73.75%、41.25%；Cyclin-D2和pRb蛋白在前列腺癌中的表達(dá)與病理類(lèi)型有關(guān)（p<0.05），MMP-3在前列腺癌中的表達(dá)與病理類(lèi)型無(wú)關(guān)（ p>0.05）；Cyclin-D2、MMP-3和pRb蛋白在前列腺癌復(fù)發(fā)組中的陽(yáng)性率與無(wú)復(fù)發(fā)組相比，差異有顯著性（p<0.05）；Cyclin-D2與pRb在前列腺癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與MMP-3表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論： Cyclin-D2、MMP-3和pRb蛋白的異常表達(dá)在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)中起重要作用，聯(lián)合檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)可能對(duì)患者預(yù)后的判斷有指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞： 前列腺癌；Cyclin-D2；MMP-3；pRb；免疫組織化學(xué)

前列腺癌在歐美國(guó)家發(fā)病率較高， 東亞地區(qū)發(fā)病率較低， 但有增高趨勢(shì)， 我國(guó)近年來(lái)該病的發(fā)病率較20 世紀(jì)60 年代前明顯增高[1]. 對(duì)前列腺癌的診治已日益受到重視.，目前對(duì)前列腺癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制尚不清楚。

pRb蛋白由原始抑癌基因Rb編碼表達(dá)，在細(xì)胞周期中以磷酸化和去磷酸化的形式?jīng)Q定著轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性，從而控制著細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，其在控制細(xì)胞周期G1-S期轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用。CyclinD2是D型細(xì)胞周期素的成員之一，與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、分化和惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。研究表明，cyclinD2是Myc的直接靶點(diǎn)，它的聚集有助于隔離細(xì)胞周期抑制子p27而啟動(dòng)細(xì)胞周期[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase3，MMP -3）的功能比較特殊，可以降解、重塑細(xì)胞外基質(zhì)，并完全激活多種基質(zhì)金屬蛋白酶前體（ProMMPs），包括ProMMP1、ProMMP3、ProMMP7、ProMMP8、ProMMP9、ProMMP13 等，使其成為臨床許多疾病病理過(guò)程研究的重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)前列腺癌中pRb、MMP-3及Cyclin-D2的表達(dá)，旨在明確pRb、MMP-3及Cyclin-D2在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及三者間相關(guān)性，從而為前列腺癌的生物治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源：本實(shí)驗(yàn)石蠟標(biāo)本取自2003年1月至2010年12月在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科住院行手術(shù)治療，術(shù)前未行化療和放療，術(shù)后均經(jīng)病理檢查確診的患者。前列腺癌的病理分級(jí)采用Bocking（ 1982） 的三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)， I ， Ⅱ ， Ⅲ級(jí)分別有42， 20 和18 例。 臨床分期采用1993 年版吳階平主編泌尿外科標(biāo)準(zhǔn)分為A、B、C、D 四期，分別各有31、24、17和8例. 甲醛固定石蠟包埋的組織切片常規(guī)進(jìn)行HE染色，分別由2名病理診斷醫(yī)師確定腫瘤的病理類(lèi)型以及組織學(xué)分級(jí)。包括正常前列腺組織30例和前列腺癌80例（漿液性囊腺癌42例，黏液性囊腺癌24例，子宮內(nèi)膜樣癌14例）。80例前列腺癌中，中位年齡43歲；按組織分化程度分為：高一中分化47例，低分化33例；采用國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIG0）2009年制定的分期標(biāo)準(zhǔn)，臨床分期：I期+Ⅱ期42例，Ⅲ期+Ⅳ期38例。

1.2 免疫組化

pRb、MMP-3和Cyclin-D2單克隆即用型抗體和S-P Kits均購(gòu)自北京中杉金橋公司，免疫組化采用SP法，DAB顯色。以已知 pRb、MMP-3和Cyclin-D2陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

Cyclin-D2和pRb陽(yáng)性表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞胞核內(nèi)，Cyclin-D2陽(yáng)性表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，均以出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞<10%為陰性，≥10%為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間數(shù)據(jù)用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 pRb、MMP-3和Cyclin-D2在正常前列腺組織和前列腺癌中表達(dá)

Cyclin-D2在前列腺癌中陽(yáng)性率為76.25%（61/80）（圖1），在正常前列腺組織中陽(yáng)性率為23.33%（7/30），兩者差異有顯著性（p<0.05）；pRb在前列腺癌中陽(yáng)性率為41.25%（33/80）（圖2），在正常前列腺組織中陽(yáng)性率為86.67%（26/30），兩者差異有顯著性（p<0.05）；MMP3在前列腺癌中陽(yáng)性率為73.75%（59/80）（圖3），在正常前列腺組織中陽(yáng)性率為26.67%（8/30），兩者差異有顯著性（ p<0.05，表1）。

2.3 前列腺癌中pRb、MMP-3和Cyclin-D2蛋白表達(dá)的相關(guān)性

在33例pRb陽(yáng)性表達(dá)的前列腺癌中MMP-3和Cyclin-D2陽(yáng)性例數(shù)分別為19例（57.58%）和20例（60.61%），47例pRb陰性表達(dá)的前列腺癌中MMP-3和Cyclin-D2陽(yáng)性例數(shù)分別為40例（85.11%）和41例（87.23%）；在61例Cyclin-D2陽(yáng)性和19例 陰性表達(dá)的前列腺癌中MMP-3的陽(yáng)性例數(shù)分別為55例（90.16%）和4例（21.05%）。Spearman等級(jí)相關(guān)分析表明，pRb分別與MMP-3和Cyclin-D2呈負(fù)相關(guān)，而MMP-3與Cyclin-D2呈正相關(guān)（表3）。

3 討論

研究證實(shí)Cyclin-D2是多種人類(lèi)癌癥的重要調(diào)控因子。Sakuma M等研究表明，Cyclin-D2啟動(dòng)子異常甲基化與前列腺癌患者預(yù)后差相關(guān)，與本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似；Cyclin-D2蛋白在前列腺癌中的陽(yáng)性率明顯高于正常前列腺組織組，與Milde-Langosch K研究結(jié)果一致；本組研究還發(fā)現(xiàn)Cyclin-D2蛋白在低分化前列腺癌組的陽(yáng)性率明顯高于中高分化組，Cyclin-D2在復(fù)發(fā)組中的陽(yáng)性率明顯高于無(wú)復(fù)發(fā)組，差異有顯著性（p<0.05）。從病理分級(jí)上看，低分化前列腺癌侵襲性明顯高于高中分化型，且Cyclin-D2高表達(dá)者復(fù)發(fā)率增高，說(shuō)明Cyclin-D2的表達(dá)隨著前列腺癌惡性程度升高而升高，Cyclin-D2蛋白的高表達(dá)患者預(yù)后差，與相關(guān)文獻(xiàn)類(lèi)似，提示其表達(dá)可作為評(píng)價(jià)前列腺癌惡性程度的客觀指標(biāo)之一。

MMP-3是一組鋅離子依賴(lài)性蛋白水解酶，由多個(gè)結(jié)構(gòu)和功能上與ECM 結(jié)構(gòu)蛋白及生長(zhǎng)因子的功能單位具有同源性的區(qū)段拼接而成，這些相互適應(yīng)的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)在“外顯子改裝”和“外顯子插入”中，其催化區(qū)域是包含鋅離子的由160～170 個(gè)氨基酸組成的致密球形結(jié)構(gòu)，該區(qū)域能特異的與底物結(jié)合，同時(shí)，也是大多數(shù)人工合成的小分子MMP 抑制劑的作用靶點(diǎn)[3] 。MMP3 可降解幾乎所有的ECM，降低細(xì)胞之間的黏附狀態(tài)，從而使腫瘤細(xì)胞易于侵襲遷移，引起腫瘤的轉(zhuǎn)移[4] 。國(guó)內(nèi)外有關(guān)MMP-3在前列腺癌中的表達(dá)報(bào)道較少，本研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織和正常前列腺組織中MMP-3的陽(yáng)性率分別為73.75%和26.67%，兩者差異有顯著性（p<0.05），另外MMP-3陽(yáng)性率高的前列腺癌患者與陽(yáng)性率低者相比，術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率較高，兩者差異有顯著性（p<0.05），說(shuō)明MMP-3在前列腺癌的發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其機(jī)制可能是前列腺癌過(guò)量表達(dá)MMP-3，其激活后降解了腫瘤細(xì)胞周?chē)|(zhì)和脈管基膜，使腫瘤細(xì)胞易于侵入周?chē)M織和脈管系統(tǒng)，形成連鎖反應(yīng)進(jìn)而共同促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)與侵襲。

pRb是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因家族成員之一，是抑癌基因Rb的一種蛋白表達(dá)產(chǎn)物[5]，其與PRB2/p130、p107三者共同組成了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤家族（Rb家族）蛋白。三種蛋白的結(jié)構(gòu)和功能相似，作用相互補(bǔ)充。在細(xì)胞周期的進(jìn)行中，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F家族成員活性的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞周期的不同階段發(fā)揮負(fù)調(diào)控功能，將正在分裂的細(xì)胞阻滯于G1期，激活這個(gè)途徑的活動(dòng)依賴(lài)于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)pRb損傷或缺失[6]。因此pRb是典型的抑癌基因之一，在人體內(nèi)的各種正常組織中廣泛表達(dá)，而其發(fā)生突變或缺失與人類(lèi)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。pRb在多種惡性腫瘤中低表達(dá)，其在前列腺癌中的相關(guān)研究較罕見(jiàn)。本組研究結(jié)果顯示，pRb在前列腺癌中的表達(dá)水平明顯低于正常前列腺組織， pRb在前列腺癌復(fù)發(fā)組中的陽(yáng)性率明顯低于無(wú)復(fù)發(fā)組，差異均有顯著性（ p<0.05）。這些結(jié)果均提示，pRb的失活促進(jìn)了前列腺癌的惡性增殖及轉(zhuǎn)移，pRb陰性表達(dá)的前列腺癌患者預(yù)后差。pRb在惡性腫瘤中的預(yù)后與國(guó)內(nèi)學(xué)者孫光等[8]在膀胱癌中的結(jié)果類(lèi)似。

另外本文發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中Cyclin-D2與pRb的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與MMP-3呈正相關(guān)，提示Cyclin-D2與pRb、MMP-3可能共同參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。pRb能夠調(diào)節(jié)E2F轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族的活性，而E2F是許多與G1/S過(guò)渡有關(guān)的基因表達(dá)所需要的，這些基因之中就包括Cyclin-D2，這一現(xiàn)象表明在前列腺癌和癌前發(fā)生階段即存在pRb表達(dá)的缺失，也存在Cyclin-D2蛋白的異常高表達(dá)，使得細(xì)胞周期失控，促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)和腫瘤的發(fā)展，是前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的重要事件。MMP-3蛋白表達(dá)與Cyclin-D2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，其可能是Cyclin-D2蛋白的異常高表達(dá)，使得細(xì)胞周期失控，而MMP-3能降解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)上皮前列腺癌的侵襲性生長(zhǎng)，可能與Cyclin-D2在前列腺癌表達(dá)的調(diào)節(jié)過(guò)程中起到協(xié)同作用有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中Cyclin-D2與pRb、MMP-3蛋白表達(dá)與前列腺癌生物學(xué)行為和預(yù)后相關(guān)，Cyclin-D2、MMP-3蛋白高表達(dá)、pRb蛋白低表達(dá)或陰性者，腫瘤惡性程度高，進(jìn)展快，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差。聯(lián)合檢測(cè)前列腺癌中Cyclin-D2與pRb、MMP-3蛋白表達(dá)水平可能對(duì)判斷前列腺癌惡性程度及預(yù)后具有指導(dǎo)意義。

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