免疫佐劑研究進(jìn)展

高明 邵軍軍 常惠蕓 張永光

摘要 佐劑是能夠增強(qiáng)免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)，本身可以具有免疫原性，也可以沒(méi)有免疫原性。佐劑種類很多，如氫氧化鋁佐劑、細(xì)菌佐劑、脂多糖、細(xì)胞因子等。綜述了氫氧化鋁佐劑、多糖佐劑、細(xì)胞因子佐劑以及一些新型佐劑的研究進(jìn)展，旨在為今后開(kāi)展疫苗和佐劑的相關(guān)研究提供參考。

關(guān)鍵詞 疫苗；免疫佐劑；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào) R392 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）34-204-03

佐劑是非特異性免疫增強(qiáng)劑，主要作用是提升機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗原或免疫原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，或改變免疫應(yīng)答類型。早期關(guān)于佐劑的報(bào)道可以追溯到19世紀(jì)20年代，研究人員發(fā)現(xiàn)在疫苗中加入瓊脂和金屬鹽等物質(zhì)可以提高抗原的特異性免疫應(yīng)答。迄今為止，佐劑已廣泛應(yīng)用于人類和獸疫苗。筆者綜述了氫氧化鋁佐劑、多糖佐劑、細(xì)胞因子佐劑以及一些新型佐劑的研究進(jìn)展，旨在為今后開(kāi)展疫苗和佐劑的相關(guān)研究提供參考。

1 傳統(tǒng)免疫佐劑

1.1 鋁鹽佐劑

自1926年被Glenny發(fā)現(xiàn)以來(lái)，鋁鹽佐劑一直受到廣泛關(guān)注。溶液中的蛋白質(zhì)抗原通過(guò)靜電引力、疏水作用力以及磷酸鹽配體間的交換力等作用力吸附于含鋁疫苗并形成沉淀，抗原的吸附強(qiáng)度直接影響免疫反應(yīng)。為了研究含鋁疫苗吸附

抗原的能力，Jully V等[1]創(chuàng)建了一個(gè)快速的、可重復(fù)利用的高通量篩查平臺(tái)（HTS），既能使抗原吸附能力被快速定量，又減輕了操作人員的工作量，同時(shí)減少試劑的使用。鋁鹽佐劑包括氫氧化鋁凝膠、磷酸鋁和明礬。Ljutic B等[2]將3種肺炎球菌蛋白抗原（PhtD、PcpA、PlyD1）配合鋁鹽佐劑制成疫苗，研究該疫苗的免疫原性、穩(wěn)定性和吸附性能。免疫BALB/c小鼠，結(jié)果表明使用氫氧化鋁佐劑的疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)顯著高于使用磷酸鋁佐劑或無(wú)佐劑情況下的免疫反應(yīng)。利用反相高效液相色譜法RPHPLC測(cè)定PcpA和PlyD1的穩(wěn)定性和小鼠體內(nèi)抗原的免疫原性，對(duì)氫氧化鋁和磷酸根離子進(jìn)行預(yù)處理，減小對(duì)抗原的吸附強(qiáng)度以及降低微環(huán)境的pH，均能提高抗原的穩(wěn)定性?？偠灾?，鋁鹽的種類、吸附強(qiáng)度的大小和微環(huán)境的pH均對(duì)疫苗的免疫原性和化學(xué)穩(wěn)定性有顯著影響。明礬不僅可以增強(qiáng)抗原的免疫原性，而且能誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答。Miki H等[3]已證實(shí)磷脂酰絲氨酸（PS）的抑制性受體CD300a在明礬誘導(dǎo)的Th2型免疫反應(yīng)中起主導(dǎo)作用。

鋁鹽佐劑的缺陷在于不耐低溫也不易保存，而且在與高純度的小分子蛋白抗原共同使用時(shí)不能產(chǎn)生足夠的抗體應(yīng)答，因此并不能滿足新型佐劑的需求，但可以與新型佐劑合用。研究表明，將鋁鹽佐劑和CpG ODN佐劑聯(lián)合成的雙佐劑可以提高乙肝疫苗的免疫效果。CpG ODN具有平衡 Th1/Th2 型免疫應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn)，但CpG ODN進(jìn)入體內(nèi)會(huì)被快速代謝，若與鋁佐劑協(xié)同使用，通過(guò)鋁佐劑的作用在體內(nèi)形成 CpG ODN 庫(kù)，便可延長(zhǎng)其體內(nèi)代謝周期。另外有研究表明，若鋁元素在體內(nèi)累積到一定水平，尤其對(duì)于腎功能低下的機(jī)體，則會(huì)對(duì)腦和骨組織產(chǎn)生不良影響，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)綜合癥。

1.2 油乳佐劑

繼鋁鹽佐劑之后，應(yīng)用最廣泛的佐劑則為“油包水”的乳狀液，即油乳佐劑。1935年，美籍匈牙利細(xì)菌學(xué)家Freund發(fā)現(xiàn)了弗氏佐劑，也是礦物油佐劑中最經(jīng)典的一種，分為弗氏不完全佐劑（IFA）與弗氏完全佐劑（CFA）2種。礦物油佐劑黏稠且不穩(wěn)定，毒副作用大，逐漸被易于代謝的角鯊烯代替。角鯊烯是一種脂質(zhì)不皂化物，無(wú)毒性，最初是從鯊魚的肝油中發(fā)現(xiàn)的，又稱魚肝油萜，具有提高

體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等多種生理功能。

MF59是以角鯊烯為油相、以Tween 80和Span 85為表面活性劑的O/W納米油乳佐劑，也是繼鋁鹽佐劑之后唯一被批準(zhǔn)的人用佐劑。Lofano G等[4]最新研究發(fā)現(xiàn)，MF59能夠促進(jìn)生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)持久性免疫應(yīng)答反應(yīng)。Montanide ISA720也是典型的以角鯊烯為油相的佐劑，以甘露醇單油酸脂為乳化劑，屬于O/W型乳劑，已經(jīng)被廣泛用于HIV疫苗和瘧疾疫苗的研發(fā)。據(jù)報(bào)道，Montanide ISA720被乳化后會(huì)減少抗原的免疫原性。Xue X 等[5]用試驗(yàn)推翻了這一結(jié)論，新建立了一種ELISA雙抗體夾心法評(píng)估重組惡性瘧疾疫苗PfCP-2.9的穩(wěn)定性和免疫效力，結(jié)果表明PfCP-2.9配合ISA720佐劑在4 ℃環(huán)境中可以保持蛋白完整性長(zhǎng)達(dá)18個(gè)月之久。

2 多糖佐劑

2.1 菊粉佐劑 菊粉是一類天然果聚糖的混合物，在自然界中分布十分廣泛。Advax是新型的三角洲菊粉佐劑，在安全性和耐藥性方面都優(yōu)于鋁佐劑和油乳佐劑。Advax可誘導(dǎo)Th1型（IgG2a）和Th2型（IgG1、IgA）抗體反應(yīng)，并促使產(chǎn)生Th1型（IL2、IFN-γ）和Th2型（IL5、IL6）細(xì)胞因子，這也彌補(bǔ)了鋁佐劑的局限性。Gordon等[6]將Advax配合乙肝表面抗原（HBsAg）進(jìn)行臨床試驗(yàn)，結(jié)果表明Advax可以增強(qiáng)乙肝表面抗體滴度和CD4+T細(xì)胞的增殖能力。研究表明，Advax可以結(jié)合單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化。應(yīng)用于甲型H1N1流感疫苗時(shí)，Advax能夠提高重組血凝素蛋白的免疫原性，有效預(yù)防該病的大流行。

2.2 殼聚糖佐劑

殼聚糖又稱脫乙酰甲殼素，是由幾丁質(zhì)經(jīng)過(guò)脫乙酰作用而得到的。自1859年法國(guó)人Rouget首先得到殼聚糖以來(lái)，這種天然高分子的生物官能性、相容性、微生物降解性等優(yōu)良性能被人們廣泛關(guān)注。殼聚糖可以刺激促炎性細(xì)胞釋放細(xì)胞因子IL1β、IL6、TNFα、MCP1和 MIP1α，促進(jìn) CD4+和 CD8+T 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。殼聚糖

在抗腫瘤方面也有顯著效果。殼聚糖可以誘導(dǎo)來(lái)源于小鼠骨髓的單核細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞，給小鼠接種由殼聚糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的腫瘤抗原致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞，可以增強(qiáng)細(xì)胞毒型T細(xì)胞的活動(dòng)來(lái)對(duì)抗腫瘤。Highton等[7]應(yīng)用包含殼聚糖水凝膠、OVA抗原的疫苗免疫小鼠，結(jié)果表明殼聚糖通過(guò)刺激OVA特異性CD8+T細(xì)胞記憶反應(yīng)，保護(hù)小鼠應(yīng)對(duì)黑色素瘤的挑戰(zhàn)。

2.3 葡聚糖佐劑

β葡聚糖是細(xì)菌、真菌和植物中存量最多的多糖，如酵母多糖、香菇多糖和藻多糖。據(jù)報(bào)道，β葡聚糖有抗腫瘤作用，可提高疫苗的免疫應(yīng)答。將β葡聚糖與重組甘油醛磷酸脫氫酶疫苗免疫動(dòng)物，機(jī)體產(chǎn)生了高水平的抗體，并顯著上調(diào)了參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)分子的轉(zhuǎn)錄水平。Wang M等[8]從釀酒酵母提取的硫酸葡聚糖可誘導(dǎo)雞脾淋巴細(xì)胞在體外增殖，當(dāng)將硫酸葡聚糖和紐卡斯?fàn)柌∫呙缫黄鹱⑸涞诫u體內(nèi)，硫酸葡聚糖增強(qiáng)血清抗體滴度以及提高血清IL2和IFNγ的濃度。試驗(yàn)還表明，HBsAg配合硫酸多糖的試驗(yàn)組IgG2a/IgG1的比值顯著高于HBsAg配合鋁佐劑的試驗(yàn)組。除了β葡聚糖以外，一些α葡聚糖也具有免疫調(diào)節(jié)功能，如Nano11[9]。Nano11是一個(gè)樹(shù)枝狀αD葡聚糖納米顆粒，可以通過(guò)靜電作用吸附帶負(fù)電的蛋白抗原。作為抗原載體，Nano11可以增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞攝取抗原的能力，并在體外激活樹(shù)突狀細(xì)胞。此外，肌肉注射Nano11可以顯著增加抗原的免疫效應(yīng)，不僅可以增加抗體效價(jià)，而且還能在注射部位聚集大量的單核細(xì)胞。

2.4 其他多糖佐劑

甘露聚糖作為免疫佐劑，在先天性免疫中扮演著重要的角色。疫苗和甘露聚糖蛋白結(jié)合可以保護(hù)小鼠抵抗全身曲霉病[10]，也可以抵抗癌癥。Vassilaros S等[11]在對(duì)12～15歲的乳腺癌患者的跟蹤試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用甘露聚糖MUC1黏蛋白作為免疫佐劑，可以降低癌癥的復(fù)發(fā)率，且不會(huì)引起任何不良反應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)，低聚果糖（FOS）也具有佐劑效應(yīng)。將傳染性支氣管疫苗配合FOS免疫機(jī)體，證實(shí)FOS可以促進(jìn)產(chǎn)生更多的病毒特異性IgG抗體[12]。脂多糖的衍生物——單磷酰脂質(zhì)A（MPL）已被證實(shí)是一種通過(guò)與TLR4受體結(jié)合的無(wú)毒的免疫佐劑。常用的AS04佐劑由MPL和磷酸鋁佐劑組成，由CSK公司生產(chǎn)，是已經(jīng)被許可用于乙肝病毒疫苗和人乳頭瘤病毒疫苗的佐劑。近年來(lái)，由MPL和QS21兩種佐劑組成的佐劑也被應(yīng)用于乙肝疫苗。

3 細(xì)胞因子免疫佐劑

1983年，Staruch MJ等[13]曾報(bào)道細(xì)胞因子可以作為疫苗佐劑。迄今為止，研究報(bào)道較多的是干擾素（IFN）和白細(xì)胞介素（IL）。不同白細(xì)胞介素之間具有相互協(xié)同或制約的作用，由此構(gòu)成了錯(cuò)綜復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，對(duì)免疫起著重要的調(diào)節(jié)作用。

3.1 干擾素

干擾素的佐劑效應(yīng)主要體現(xiàn)在抗腫瘤方面。Fabian Wolpert等[14]研究發(fā)現(xiàn)IFNβ可以作為應(yīng)用免疫療法靶向治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的佐劑，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。樹(shù)突狀細(xì)胞利用不同細(xì)胞亞群的獨(dú)特屬性來(lái)治療腫瘤是一種新的方法，該方法的關(guān)鍵在于TLR3可以誘導(dǎo)分泌IFNα，進(jìn)而由IFNα迅速誘導(dǎo)TLR7的表達(dá)，引發(fā)強(qiáng)烈的TH1型免疫應(yīng)答[15]。

3.2 白細(xì)胞介素

3.2.1 白細(xì)胞介素1（IL1）。

IL1主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)胸腺細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖與分化，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，促進(jìn)IL2、IL3、IL4、GCSF等多種免疫分子的表達(dá)。

3.2.2 白細(xì)胞介素2（IL2）。

IL2必須與IL2受體（IL2R）結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[16]。與傳統(tǒng)疫苗佐劑（如鋁佐劑）相比，IL2一次少量接種即可在宿主體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間低量表達(dá)，且對(duì)人體本身無(wú)毒副作用。

3.2.3 白細(xì)胞介素6（IL6）。

IL6是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，不僅影響B(tài)細(xì)胞和T細(xì)胞的增生與分化，而且參與CTL分化及對(duì)顆粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用。Su L K等[17]研究表明IL6可作為佐劑顯著提高防齲DNA疫苗的免疫原性。

3.2.4 白細(xì)胞介素12（IL12）。

IL12的最大特點(diǎn)是在極低濃度時(shí)就有顯著活性，且其活性高于IL2和IFN。作為佐劑，IL12更多是與其他因子聯(lián)合作用。Khan T等[18]研究發(fā)現(xiàn)IL12和IL23聯(lián)合應(yīng)用在誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答和降低病毒對(duì)肺的負(fù)擔(dān)方面具有粘膜佐劑的潛力，可顯著降低所需保護(hù)疫苗的劑量。

4 新型免疫佐劑

4.1 免疫刺激復(fù)合物及基質(zhì)

免疫刺激復(fù)合物（ISCOM）是由抗原物質(zhì)與糖苷QuilA及膽固醇按1∶1∶1混合后自發(fā)形成的一種具有較高免疫活性的脂質(zhì)小泡，主要適用于提高亞單位疫苗的免疫原性，還能有效通過(guò)黏膜給藥，從而提高黏膜免疫功能，用于抗呼吸道感染。Camussone CM等[19]分別以金黃色葡萄球菌和裂解細(xì)胞作為免疫原配合ISCOM免疫懷孕的母牛，二者均刺激機(jī)體產(chǎn)生了強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答，并在牛奶和血液中獲得了高水平的抗體。與菌苗配方相比，裂解液配方產(chǎn)生了更高、更持久的抗體滴度。

與ISCOM不同，ISCOM基質(zhì)（ISCOMmatrix）既不包含抗原，又具備QuilA額外的佐劑效應(yīng)和微粒載體系統(tǒng)2個(gè)優(yōu)點(diǎn)，同樣可作為良好的佐劑。一直以來(lái)，預(yù)防豬支原體肺炎的疫苗都是胸腔注射，以達(dá)到對(duì)機(jī)體的最佳保護(hù)，但這種方式大大限制了疫苗的使用。為改善胸腔注射的局限性，Xiong Q等[20]嘗試肌肉注射，由于以前的研究表明肌肉注射誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)對(duì)試驗(yàn)感染的保護(hù)性不足，因此利用QuilA、磷脂和膽固醇制成顆粒佐劑，即ISCOMmatrix。結(jié)果表明，機(jī)體產(chǎn)生了較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，且ISCOMmatrix無(wú)毒副作用。

4.2 卡介苗 （ BCG）

BCG可促進(jìn)DCs的同型黏附作用，能刺激骨髓的多功能干細(xì)胞發(fā)育成免疫活性細(xì)胞，從而明顯提高機(jī)體的免疫力。最近的一些研究表明，BCG增強(qiáng)免疫反應(yīng)需要依賴某些中間介質(zhì)。Jinesh GG等[21]發(fā)現(xiàn)TNFα是BCG刺激中性粒細(xì)胞分泌的重要介質(zhì)。Kleinnijenhuis J等[22]證實(shí)NK細(xì)胞有利于促進(jìn)接種卡介苗后產(chǎn)生的非特異性免疫，并增加促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。此外，在研究散播性念珠菌病的小鼠模型中已經(jīng)證實(shí)接種卡介苗后依賴NK細(xì)胞可以提高小鼠的存活率。 Iljine DA等[23]研究發(fā)現(xiàn)卡介苗可以促進(jìn)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的分泌，促使TNFα基因轉(zhuǎn)錄和 TNFα蛋白的釋放，還可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞無(wú)絲分裂早期的活動(dòng)，但若將其大量應(yīng)用會(huì)引起嚴(yán)重的副作用。Liu Q等[24]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)BCG活化的巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生一個(gè)新的分子，命名為NMAAP1。NMAAP1在巨噬細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致M1型巨噬細(xì)胞極化，并提高M(jìn)1型基因的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的表型，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

4.3 寡脫氧核苷酸（CpG ODN）

研究表明，CpG ODN 能夠活化B細(xì)胞，提高B細(xì)胞表面抗原遞呈相關(guān)分子的表達(dá)，而對(duì)T細(xì)胞無(wú)明顯作用。Behrens NE等[25]研究發(fā)現(xiàn)CpG ODN可以顯著促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化。CpG ODN的免疫刺激作用與激活TLR9有關(guān)[26]，TLR9分布于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，能識(shí)別非甲基化的CpG二核苷酸，從而能有效識(shí)別入侵的病原體核酸。CpG ODN能直接激活樹(shù)突狀細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞等，間接激活NK細(xì)胞，誘導(dǎo)以Th1型為主的免疫應(yīng)答。Gunawardana T等[27]已經(jīng)證實(shí)單純的CpG ODN在雛雞卵內(nèi)遞送系統(tǒng)中可以顯著保護(hù)新生肉雞抵抗大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌感染。近年來(lái)，他們又將CpG ODN與2種類型的碳納米管或紙質(zhì)表面活性劑混合，檢測(cè)其在新生肉雞對(duì)抗大腸桿菌敗血癥時(shí)的安全性和免疫保護(hù)性能。結(jié)果表明，使用該混合制劑可以將雛雞的存活率由20%左右提升為80%左右，且與單純使用CpG ODN及生理鹽水對(duì)照組相比細(xì)菌負(fù)荷量也顯著降低。

4.4 納米佐劑

納米佐劑由納米材料構(gòu)成，其優(yōu)勢(shì)在于吸附能力強(qiáng)、緩釋功能好，具有很好的靶向性和穩(wěn)定性。從免疫學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看，納米佐劑可以誘導(dǎo)共刺激分子的正向調(diào)節(jié)以及刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子，包裹或吸附的抗原顆粒正是巨噬細(xì)胞（MФ）和樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的首選吞噬目標(biāo)，為實(shí)現(xiàn)機(jī)體有效的免疫反應(yīng)完成了重要的一步，特別是細(xì)胞免疫。此外，納米佐劑與多肽抗原或DNA疫苗連接后，可以避免常規(guī)佐劑載體效應(yīng)的發(fā)生，起到保護(hù)抗原的作用。聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）納米佐劑是一個(gè)能使生物降解的生物相容性聚合物，Singh D等[28]探索其潛在的免疫原性，將布氏桿菌的免疫顯性抗原蛋白L7和L12包裹于PLGA中，對(duì)抗布氏桿菌，初次免疫后即可產(chǎn)生高水平的IgG抗體水平，促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子尤其是 IFNγ的分泌。Saeed MI等[29]提出了提高黏膜疫苗免疫力的新方法，即將HEV71疫苗與包裹了殼聚糖和海藻酸鈉載體的納米磷酸鈣佐劑配合，采用雙重免疫（皮膚和黏膜）途徑提升唾液中IgA和全身性IgG的分泌水平，提高了病毒中和抗體效價(jià)，能同時(shí)誘導(dǎo)黏膜免疫和全身性免疫反應(yīng)對(duì)抗HEV。

5 展望

疫苗是預(yù)防疫病的關(guān)鍵，而對(duì)于疫苗而言，佐劑的選擇顯得尤為重要。合理使用佐劑，不僅可以節(jié)約抗原的使用量，而且能迅速刺激免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。盡管有很多新型佐劑不斷出現(xiàn)，但研制出更多適用于人類疫苗的佐劑仍是今后努力的重要方向。應(yīng)該著重建立可靠的非臨床模型，并結(jié)合各種佐劑的特點(diǎn)，將不同佐劑聯(lián)合使用，進(jìn)一步調(diào)節(jié)所需的免疫反應(yīng)。疫苗不僅用于預(yù)防疾病，而且可以用于治病，適用于治療性疫苗的佐劑在未來(lái)也具有廣闊的發(fā)展前景。

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