耐低溫灰樹花工廠化生產(chǎn)菌株的篩選

馮芳俠 付慶偉 王鳳春 付慶成

摘要[目的]篩選適合低溫環(huán)境生產(chǎn)出菇的菌種。[方法]通過比較13個野生灰樹花菌株的菌絲生長速率、生長勢、拮抗性，并以栽培周期、子實體品質(zhì)及前期生物學(xué)轉(zhuǎn)化率等為指標(biāo)進(jìn)行工廠化栽培考察。[結(jié)果]菌株“ZDL05”在（18±2）℃時68 d完成2次出菇，且生物轉(zhuǎn)化率為82.3%，同時在顏色、風(fēng)味、葉片厚度、口感及朵形等方面表現(xiàn)優(yōu)秀，適合灰樹花低溫工廠化栽培。[結(jié)論] 灰樹花菌株ZDLM05可以作為秋冬季或較低溫地區(qū)工廠化生產(chǎn)菌種。

關(guān)鍵詞灰樹花；耐低溫；菌株篩選；工廠化

中圖分類號S646文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）34-056-03

灰樹花[Grifola frrondosa（Dicks.Fr.）S.F.Gray]是擔(dān)子菌亞門層菌綱無隔擔(dān)子菌亞綱非褶菌目多孔菌科灰樹花屬真菌，為珍貴的藥食兩用菌。其人工栽培歷史較短，受前期生物轉(zhuǎn)化率低、多糖含量低等因素制約，灰樹花栽培成本較高，工廠化生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展緩慢，制約了整個行業(yè)的發(fā)展。篩選前期生物轉(zhuǎn)化率高、適合低溫環(huán)境出菇的工廠化栽培菌種，既能滿足秋、冬及初春較低溫度環(huán)境下工廠化出菇，又能降低生產(chǎn)成本，可以極大地滿足灰樹花工廠化栽培的需求[1]。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1培養(yǎng)基配方。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯200.00 g，栗木屑50.00 g，麥麩50.00 g，葡萄糖20.00 g，蛋白胨2.00 g，維生素B1 0.01 g，CaH2PO4 3.00 g，MgSO4 1.50 g，瓊脂粉20.00 g，定容至1 000 ml。

原種、栽培種培養(yǎng)基：栗木屑35%、棉籽皮15%、麩皮15%、玉米芯20%、栗蓬10%、海泡石粉2%、蔗糖1%、過磷酸鈣1%、石膏1%，含水量65%，常壓100 ℃滅菌12 h。

1.1.2菌株及來源。

13個灰樹花菌株系從唐山市遷西縣東荒峪、漢兒莊等地收集、分離純化和篩選獲得的野生菌株。

采用組織分離法，取子實體柄葉結(jié)合部位組織接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上，在25℃下恒溫培養(yǎng)形成菌落，采用菌絲尖端純化法純化菌種，并用基礎(chǔ)培養(yǎng)基斜面保存?zhèn)溆?，依次編號為ZDLM01～ZDLM13。以當(dāng)?shù)刂髟云贩N“小黑汀”為對照，由河北省燕山科學(xué)試驗站提供。

1.1.3試劑。

木聚糖，Sigma公司；其他試劑如醋酸鈉、酒石酸鉀鈉、丙酮、3，5二硝基水楊酸（DNS）、MgSO4、NaOH等均為國產(chǎn)分析純試劑。

DNS顯色劑（3，5二硝基水楊酸顯色劑）：稱取10 g 3，5二硝基水楊酸溶于蒸餾水中，加入20 g氫氧化鈉、200 g酒石酸鉀鈉和500 ml水，加熱溶解后再加入重蒸酚2 g、無水亞硫酸鈉0.5 g，待全部溶解后，冷卻，蒸餾水定容至1 000 ml，貯于棕色瓶中，放置7 d后使用，用前過濾。

醋酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.6）：稱取NaAC 0.8 g，加入蒸餾水80 ml溶解，用醋酸調(diào)pH至4.6，最后用蒸餾水定容至100 ml。

木聚糖溶液（1%）：稱取木聚糖0.501 g，用蒸餾水溶解并定容至50 ml。

濃縮膠緩沖液（0.5 mol/L，pH 6.8）：稱取6.06 g Tris，加80 ml dd H2O溶解，用鹽酸調(diào)pH至6.8，最后定容至100 ml。

1.1.4主要儀器。

UV8100紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；

潔凈工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司；

梅特勒電子分析天平，河南鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；

LDZH150KBS型立式蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2試驗方法

1.2.1最適發(fā)菌溫度試驗。

采用生長速率法進(jìn)行測定。用基礎(chǔ)培養(yǎng)基做成平板，接種環(huán)挑菌種置于平板中央，分別在16、18、20、22、24、26、28、30 ℃下恒溫培養(yǎng)10 d后，測量菌落直徑，每個處理3個平行試驗，結(jié)果取平均值。

1.2.2出菇試驗。

以栗木屑35%、棉籽皮15%、玉米芯20%、麩皮15%、栗蓬10%、海泡石粉2%、蔗糖1%、過磷酸鈣1%、石膏1%為配方。將栗木屑、棉籽殼、栗蓬渣等主料稱好，混在一起攪拌均勻，再將麩皮、過磷酸鈣、蔗糖、石膏等輔料隨水拌入料中，料水比為1∶1.2～1∶1.3，含水量65%，常壓100℃滅菌12 h。

以主栽品種“小黑汀”為對照，與13個野生優(yōu)種各200棒作對比試驗；按照“1.2.1”結(jié)果中各菌種最適生長溫度（±2 ℃）為培養(yǎng)溫度，采用層架式發(fā)菌，菌絲長滿菌袋后，剝袋置于長×寬×深=2.0 m×0.5 m×0.3 m生長畦內(nèi)，覆土栽培，出菇兩潮為止。分別記錄2次出菇量、出菇溫度、出菇時間、平均單重，以前期生物轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)量、顏色、氣味、葉片厚度、產(chǎn)量等指標(biāo)[2-3]，篩選低溫環(huán)境下前期生物轉(zhuǎn)化率、商品性狀較好的野生優(yōu)種。

1.2.3菌絲生長勢測定。

以主栽品種“小黑汀”為對照，將3個野生優(yōu)種在基礎(chǔ)培養(yǎng)基活化后，沿菌落的邊緣取直徑5 mm的菌塊，分別接種于PDA加富平板培養(yǎng)基上。每個菌種3個重復(fù)，于各自適宜的生長溫度下恒溫培養(yǎng)3 d，每天定時觀察菌落的生長狀況，并精確測量菌落半徑，計算菌絲生長速度。

菌絲生長速度（mm/d）=菌落半徑（mm）/菌絲生長天數(shù)（d）

1.2.4木聚糖酶活力測定。

沿菌落邊緣挖取模擬出菇培養(yǎng)基上的菌絲各1 g于試管中，加pH 4.6 0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液10 ml，25 ℃浸提過夜（12 h），將浸提液用濾紙過濾，取濾液1 ml加入試管中，然后加入9 ml蒸餾水稀釋，充分混勻，得粗酶液待用。

將pH 4.6醋酸鈉緩沖溶液、1%木聚糖溶液及粗酶液于40 ℃水浴預(yù)熱2 min，然后在試管中依次加入pH 4.6醋酸鈉緩沖溶液1 ml，1%木聚糖溶液0.5 ml，稀釋后的粗酶液0.5 ml。40 ℃水浴30 min后，加入DNS 3 ml，100 ℃水浴5 min后水冷，在波長510 nm下測定OD值。酶活力以樣品與底物反應(yīng)30 min后吸光值的改變表示。

1.2.5拮抗性試驗。

將活化后的供試菌株沿菌落邊緣用打孔器切下直徑5 mm的菌塊，每2個不同菌株的菌塊相距約1 cm，接種于同一基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上，于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，觀察不同菌株間是否有拮抗線的存在，拮抗線是否明顯。

2結(jié)果與分析

2.1最適發(fā)菌溫度

一般灰樹花菌株菌絲體生長適宜溫度為22～30 ℃，在22 ℃以下或30 ℃ 以上生長緩慢。由表1可知，ZDLM03菌株菌落直徑在28 ℃時最大達(dá)到4.9 cm。其中，ZDLM05、ZDLM06、ZDLM12在相對低溫下（18～24 ℃）具有較大的生長量；ZDLM05在此溫度范圍下菌落直徑能達(dá)到4.4 mm，有較大的應(yīng)用空間。

2.2出菇試驗結(jié)果

由表2可知，傳統(tǒng)優(yōu)種“小黑汀”比ZDLM05號優(yōu)種2次出菇時間長15 d，且后者在較低溫度（18±2）℃下生物轉(zhuǎn)化率達(dá)到82.3%；ZDLM12優(yōu)種也比“小黑汀”早7 d完成出菇，生物轉(zhuǎn)化率同比高6.3%。

結(jié)合灰樹花子實體的特有香味、灰黑色、葉片厚實等傳統(tǒng)評價指標(biāo)，優(yōu)種ZDLM05具有耐低溫（18±2） ℃、前期生物轉(zhuǎn)化率高（82.3%）及較好的產(chǎn)品特性，符合工廠化生產(chǎn)菌種的特征。

2.3菌絲生長勢

由表3可知，4個灰樹花菌株在PDA加富培養(yǎng)基上的生長速度雖存在一定差異，但不明顯，生長速度排列為ZDLM05>ZDLM12>ZDLM06>小黑??；ZDLM06灰樹花優(yōu)種生長勢較旺，有粗壯優(yōu)勢菌絲發(fā)育。

2.4木聚糖酶活力

"小黑汀"、ZDLM05、ZDLM06、ZDLM12灰樹花菌株的木聚糖酶活力分別為13.12±0.11、25.25±0.29、24.67±0.14、19.52±0.06 U，3個篩選的灰樹花菌種均高于對照組；其中ZDLM05菌株的活力最高，接近“小黑汀”的2倍；此結(jié)果與菌種的生物轉(zhuǎn)化率相一致。

2.5 拮抗性

由表4可知，“小黑汀”和3個篩選的灰樹花菌株間拮抗作用明顯，表明考察的3個野生菌種相對獨(dú)立，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3結(jié)論與討論

我國工廠化灰樹花生產(chǎn)分為液體發(fā)酵罐菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花多糖和工廠化栽培生產(chǎn)子實體兩類。第一類主要滿足工業(yè)及醫(yī)藥生產(chǎn)需求，已經(jīng)發(fā)展相對成熟；第二類主要滿足日益增長的營養(yǎng)食材的需求，產(chǎn)品產(chǎn)量低、成本高，產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢，其中前期生物轉(zhuǎn)化率低、生長周期長是最重要的制約因素。工廠化栽培食用菌通常只采收第一潮菇，以提高菇房利用率，降低生產(chǎn)成本。前期研究表明，灰樹花第二潮出菇量為第一潮出菇量的50%～85%，出菇周期短的灰樹花品種，收兩潮菇可以降低成本40%～78%。

因此，以前期生物轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，篩選生產(chǎn)周期短、耐低溫的灰樹花菌種，不僅可以提高單位產(chǎn)量和菇房使用率，還可以降低冬季生產(chǎn)的操作成本和生產(chǎn)風(fēng)險，實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)的利潤最大化。該試驗通過最適生長溫度和小試工廠化生產(chǎn)，只能提供灰樹花優(yōu)種的篩選依據(jù)，不能完全依靠其結(jié)果作為菌株篩選的最終標(biāo)準(zhǔn)。該試驗階段獲得ZDLM05、ZDLM06和ZDLM12共3個野生優(yōu)種，均能在小于或等于22 ℃時正常出菇；其中ZDLM05可以在（18±2）℃時68 d完成2次出菇，且生物轉(zhuǎn)化率達(dá)到82.3%；同時子實體性狀和產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)較高，是難得的工廠化生產(chǎn)菌種。該研究繼續(xù)考察了3個野生優(yōu)種的生長勢、木聚糖酶活力和拮抗性，以定性或半定量的形式考察了菌種的親緣關(guān)系和生物轉(zhuǎn)化能力，其中ZDLM05不是每項指標(biāo)均最佳，但綜合評比適宜工廠化栽培。

綜上所述，灰樹花菌株ZDLM05可以作為秋冬季或較低溫地區(qū)工廠化生產(chǎn)菌種，能在68 d內(nèi)完成2次出菇，且生物轉(zhuǎn)化率達(dá)到82.3%，與傳統(tǒng)主栽品種“小黑汀”相比，優(yōu)勢非常明顯；同時菌株生物穩(wěn)定性好，可進(jìn)一步研究其栽培工藝、環(huán)境控制參數(shù)等條件，保證高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1] 潘輝，王瑞娟，李正鵬，等.工廠化栽培灰樹花菌株的篩選研究[J].北方園藝，2011（1）：188-191.

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[3] 陳秀娟.灰樹花工廠化周年栽培技術(shù)[J].中國園藝文摘，2012（6）：141-142.