尖孢鐮刀菌致病性菌株遺傳多樣性的ISSR分析

肖榮鳳　陳燕萍　朱育菁　詹洪　劉波　葛慈斌

摘 要 致病性尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是一種世界性分布的作物土傳病原真菌，為明確其不同寄主及?；途赀z傳差異性和親緣關(guān)系，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)來(lái)源于不同寄主（?；停┘暗乩矸植嫉?3個(gè)菌株進(jìn)行了遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，供試的15條引物通過(guò)ISSR-PCR 擴(kuò)增，共擴(kuò)增出147條條帶，其中多態(tài)性條帶為144條，平均多態(tài)性條帶達(dá)98.0%。43個(gè)菌株的聚類結(jié)果表明，各菌株間的遺傳相似系數(shù)為0.67～0.97，且遺傳多樣性與其寄主和地理來(lái)源沒(méi)有明顯的相關(guān)性。進(jìn)一步將供試菌株中葫蘆科與茄科作物尖孢鐮刀菌分別進(jìn)行聚類分析，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.84時(shí)，16個(gè)葫蘆科的菌株可分為6個(gè)ISSR類群；當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.77時(shí)，16個(gè)茄科的菌株亦可分為6個(gè)ISSR類群；且均表現(xiàn)為相同寄主或?qū)；途暌虻乩韥?lái)源不同，被歸屬于不同的ISSR類群，說(shuō)明寄主或?qū)；拖嗤木昱c地理來(lái)源存在一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 尖孢鐮刀菌；?；?；ISSR-PCR；遺傳多樣性

中圖分類號(hào) S43；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Pathogenic Fusarium oxysporum is one of the most common soil-borne fungal pathogens all over the world. To specify genetic difference and phylogenetic relationship of F. oxysporum strains，the genetic diversity of 43 strains with different host and geographic origin or formae speciales strains was analyzed using the ISSR-PCR molecular marker technique. The results showed that 147 fragments were amplified from 43 strains by 15 tested primers. Among them， the polymorphic band was 144，which accounted for 98.0% in the total amplified fragments. The ISSR analysis showed that genetic similarity coefficient was 0.67-0.97， suggesting a high genetic variability within 43 strains. However， the results did not reveal a clear relationship between variability and the host/geographic origin. The isolates from cucurbitaceae and solanaceae crops were further performed the cluster analyses of genetic variability， respectively. At the level of 0.84，16 isolates from cucurbitaceae crops could be obviously divided into six ISSR groups. At the level of 0.77， 16 isolates from solanaceae crops could be also obviously divided into six ISSR groups. Moreover， these F. oxysporum isolates from the same host or formae speciales strains could be divided into different ISSR groups due to their different geographic origin. The results indicated that there was a relationship in a certain degree between variability and geographic origin within the isolates from the same hosts or the same formae speciales strains.

Key words Fusarium oxysporum；Formae speciales；ISSR-PCR；Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.014

由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的作物枯萎病是一種世界性分布的土傳病害，也是造成作物連作障礙的主要原因之一。該病菌可危害各種作物，一般造成20%～30%產(chǎn)量損失，嚴(yán)重者可導(dǎo)致絕收[1-4]。該病原菌在遺傳上十分復(fù)雜，且極易發(fā)生變異，導(dǎo)致菌株間的差異較大，僅靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類和致病性檢測(cè)進(jìn)行種間及種內(nèi)鑒定，難以準(zhǔn)確揭示物種的進(jìn)化關(guān)系。目前，ISSR分子遺傳標(biāo)記技術(shù)由于其穩(wěn)定性和重復(fù)性較好、操作簡(jiǎn)單快速、所需DNA量少、不需要活體材料、也沒(méi)有組織特異性等特點(diǎn)[5-6]，在多種植物病原菌的遺傳多樣性研究中得到應(yīng)用[7-10]。

在尖孢鐮刀菌的研究方面，相關(guān)的ISSR遺傳多樣性研究表明其與寄主、地理來(lái)源和毒力等方面可能存在一定的相關(guān)性。段會(huì)軍等[11]研究發(fā)現(xiàn)河北省西瓜枯萎病菌的ISSR遺傳多樣性與生理小種之間存在一定相關(guān)性，但與菌株的地理來(lái)源無(wú)相關(guān)性。María等[12]分析了來(lái)自不同國(guó)家的梨孢鐮刀菌的ISSR遺傳多樣性，結(jié)果表明ISSR類群與寄主和地理來(lái)源無(wú)明顯相關(guān)性。苑琳等[13]對(duì)尖孢鐮刀菌胡麻?；偷姆治霰砻?，ISSR多樣性與地理來(lái)源存在相關(guān)性。劉東等[14]研究發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌黃瓜?；途闕SSR的遺傳多樣性與菌株地理來(lái)源及毒力存在相關(guān)性。王建明等[15]和李新鳳等[16]的研究表明，尖孢鐮刀菌同一類群中菌株之間的遺傳相似性與地理來(lái)源存在一定的相關(guān)性。張述義等[17]研究表明，不同寄主的尖孢鐮刀菌的ISSR 類群劃分與菌株的地理來(lái)源沒(méi)有明顯的相關(guān)性，但分離自相同寄主的各菌株間的遺傳相似性與菌株的地理來(lái)源有一定的相關(guān)性。上述相關(guān)研究表明，尖孢鐮刀菌的遺傳變異存在復(fù)雜性和多樣性，不同寄主與地理來(lái)源的菌株在遺傳變異上存在較大差異性，可能與菌株進(jìn)化過(guò)程中受自然環(huán)境條件影響及與寄主發(fā)生協(xié)同進(jìn)化等因素有關(guān)，而且菌株的遺傳變異也可能引發(fā)寄主植物抗性的改變，從而影響該病害的防治。因此，研究不同寄主尖孢鐮刀菌的遺傳多樣性對(duì)該病原菌的種系演化和病害防治具有重要的意義。但目前如番茄、辣椒、甜瓜和苦瓜等作物尖孢鐮刀菌ISSR的遺傳多樣性還未見(jiàn)報(bào)道，本研究收集了不同寄主（?；停┖偷乩韥?lái)源的尖孢鐮刀菌43株，擬采用ISSR-PCR技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性研究，旨在探討這些菌株的遺傳多樣性與寄主或?qū)；汀⒌乩矸植嫉年P(guān)系，為尖孢鐮刀菌的遺傳分化、系統(tǒng)發(fā)育和病害防治等領(lǐng)域的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：尖孢鐮刀菌不同專化型菌株共43株（表1）。除菌株FJAT-282、FJAT-9394和FJAT-3322分別為浙江大學(xué)、河北省農(nóng)林科學(xué)院和中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院贈(zèng)送外，余者均由本研究室從福建省內(nèi)不同地區(qū)采集與分離保存。

培養(yǎng)基：PDA、PDB。

試劑：10 mmol/μL dNTPs、10×Buffer（無(wú)Mg2+）、25 mmol/μL MgCl2和5 U/μL Taq酶購(gòu)自上海博尚生物技術(shù)服務(wù)有限公司；用于ISSR-PCR 反應(yīng)的15條ISSR引物參考王建明等文獻(xiàn)[15]，來(lái)自于英國(guó)哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia）公布的序列（表2），引物均由上海博尚生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

儀器：Gel Doc-ItTM UVP凝膠成像系統(tǒng)；Biometra PCR儀；BIO-RAD PowerPacTM Basic電泳儀；Thermo Scientific NanoDrop 2000C分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 尖孢鐮刀菌菌絲培養(yǎng)及DNA提取 將供試的43株尖孢鐮刀菌菌株經(jīng)PDA平板活化后，分別接種到PDB培養(yǎng)液中，25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，過(guò)濾獲得菌絲，烘干備用。菌株DNA提取方法參考蘇明星等[18]方法。制備好的DNA采用Thermo Scientific NanoDrop 2000C 分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度，用滅菌的去離子水將DNA濃度統(tǒng)一調(diào)節(jié)成20 ng/μL，備用。

1.2.2 尖孢鐮刀菌的ISSR引物篩選與擴(kuò)增 ISSR 擴(kuò)增反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[15，19]。20 μL的PCR反應(yīng)體積：1.0 U Taq DNA聚合酶，1.2 μL MgCl2（25 mmol/μL），dNTPs 0.3 μL（10 mmol/μL），0.8 μL引物（10 μmol/μL），1 μL模板DNA（20 ng/μL）。PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，52 ℃/54 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。

隨機(jī)選取3個(gè)來(lái)自不同寄主的菌株基因組DNA為模板，利用合成的15條ISSR引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，然后比較擴(kuò)增結(jié)果，從中選擇多態(tài)性和重復(fù)性好的引物對(duì)43 株供試菌株的基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，在2%瓊脂糖凝膠中分離擴(kuò)增產(chǎn)物并拍照。

1.2.3 尖孢鐮刀菌的ISSR-PCR多態(tài)性分析 ISSR引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，記錄每條引物對(duì)每個(gè)菌株的DNA的擴(kuò)增結(jié)果。在電泳圖譜中每條擴(kuò)增條帶都代表引物與模板DNA互補(bǔ)的一對(duì)結(jié)合位點(diǎn)，可記為1個(gè)分子標(biāo)記。采用Gel-Pro Analyzer軟件對(duì)ISSR電泳圖譜中的條帶進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別和記錄，并進(jìn)行人工校對(duì)。將PCR擴(kuò)增的DNA條帶轉(zhuǎn)換成0/1矩陣，無(wú)帶的記為0，有帶的記為1，得到ISSR分子標(biāo)記的原始0/1二元數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYSpc（Version 2.10e）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用SIMQUAL（Similarity for Qualitative Date）法進(jìn)行菌株間的遺傳相似系數(shù)計(jì)算，以非加權(quán)類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖孢鐮刀菌的ISSR引物的篩選與擴(kuò)增

15條ISSR引物對(duì)43株尖孢鐮刀菌的擴(kuò)增結(jié)果表明（表2），所有引物均具背景清晰、信號(hào)強(qiáng)、多態(tài)性明顯的特點(diǎn)，部分?jǐn)U增結(jié)果圖片見(jiàn)圖1。共擴(kuò)增出147條條帶，多分布在500～2 000 bp之間，其中特征性條帶（多態(tài)性位點(diǎn)）為144條，多態(tài)性平均比例為98%。不同引物擴(kuò)增條帶數(shù)不等，條帶數(shù)在5～15條之間，多數(shù)為9～11條之間，平均每條引物產(chǎn)生多態(tài)性條帶9.8條。因此供試的15條引物均可用于供試的不同寄主的尖孢鐮刀菌遺傳多態(tài)性分析。

2.2 不同寄主?；图怄哏牭毒腎SSR-PCR多態(tài)性分析

對(duì)43株來(lái)自8個(gè)不同寄主或?qū)；图怄哏牭毒腎SSR-PCR擴(kuò)增，聚類分析結(jié)果表明（圖2）：各菌株間的遺傳相似系數(shù)為0.67～0.97，且遺傳多樣性與其寄主和地理來(lái)源沒(méi)有明顯的相關(guān)性。有些寄主或地理來(lái)源相同的菌株間的遺傳距離比寄主或地理來(lái)源不同的菌株間的遺傳距離大，有些則相反。如1號(hào)菌（來(lái)自浙江）與同寄主?；偷?～5號(hào)菌株（均來(lái)自福州市閩侯縣）遺傳距離相差較大；而34號(hào)分離自花生的菌株（來(lái)自泉州市惠安縣）與17～18號(hào)分離自苦瓜?；停ǜＶ菔虚}候縣）遺傳距離較近。但?；停闹鳎┖偷乩韥?lái)源相同的菌株卻有優(yōu)先聚到一起的趨勢(shì)，如番茄?；途?～5號(hào)（均來(lái)自福州市閩侯縣）、茄?；途?3～16號(hào)（均來(lái)自廈門市同安區(qū)）和香蕉古巴?；?2～25號(hào)（均來(lái)自漳州市南靖縣）。

為進(jìn)一步分析這些尖孢鐮刀菌的ISSR-PCR多態(tài)性及遺傳相似性，從中將寄主為葫蘆科和茄科作物的尖孢鐮刀菌菌株分別進(jìn)行聚類分析。

葫蘆科作物尖孢鐮刀菌的聚類分析結(jié)果表明（圖3），16株菌株遺傳相似系數(shù)在0.62～0.97之間。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.84時(shí)，供試的16株尖孢鐮刀菌可明顯地分成6個(gè)ISSR類群（ISSR Groups，IGs）：甜瓜專化型菌株可分為3個(gè)IGs，IGsⅠ為7～9號(hào)菌（均來(lái)自福州市閩侯縣）、IGsⅤ為10號(hào)菌（來(lái)自寧德市古田縣）和IGsⅥ為11株號(hào)（來(lái)自福州市永泰縣），苦瓜?；途昃鶜w為IGsⅡ（17～21號(hào)菌，來(lái)自福州市閩侯縣）；西瓜專化型菌株分為2個(gè)IGs，IGsⅢ為28、29號(hào)菌、31～33號(hào)菌（均來(lái)自福州市永泰縣）和IGsⅣ為30號(hào)菌（來(lái)自福清市漁溪鎮(zhèn)）。上述結(jié)果表明，相同寄主?；途暌虻乩韥?lái)源不同，遺傳相似距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；相同寄主?；颓业乩韥?lái)源相同的菌株，遺傳相似距離較小，親緣關(guān)系較近。

茄科作物尖孢鐮刀菌的聚類分析結(jié)果表明（圖4），16株菌株遺傳相似系數(shù)在0.62～0.94之間。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.77時(shí)，供試的16株尖孢鐮刀菌可明顯地分成6個(gè)ISSR類群：番茄專化型菌株可分為2個(gè)IGs，IGsⅠ為1號(hào)菌（來(lái)自浙江），IGsⅡ?yàn)?～6號(hào)菌（分別來(lái)自福州市閩侯縣和河北保定）；寄主為辣椒的萎蔫?；涂煞譃?個(gè)IGs，IGsⅢ為40號(hào)菌株（來(lái)自莆田市荔城區(qū)），IGsⅣ為41～43號(hào)菌（來(lái)自漳州市平和縣），IGsⅥ為39號(hào)菌（來(lái)自福清市漁溪鎮(zhèn)）；茄?；?3～16號(hào)菌株歸為IGsⅤ（均來(lái)自廈門市同安區(qū)），但12號(hào)茄?；途辏▉?lái)自漳州平和縣）例外，與番茄?；途隁w為IGsⅡ。上述結(jié)果同樣表明，相同寄主?；途暌虻乩韥?lái)源不同，遺傳相似距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；相同寄主專化型且地理來(lái)源相同的菌株，遺傳相似距離較小，親緣關(guān)系較近；但個(gè)別菌株出現(xiàn)例外。

3 討論與結(jié)論

ISSR分子標(biāo)記通常為顯性標(biāo)記，具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性[20]。本研究對(duì)43個(gè)尖孢鐮刀菌菌株進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，供試的15條引物均具有良好的多態(tài)性，且平均多態(tài)性條帶達(dá)98.0%，說(shuō)明供試菌株的DNA 基因組在SSR區(qū)域的遺傳差異明顯、多態(tài)性高，所篩選的引物可用于ISSR-PCR擴(kuò)增進(jìn)行尖孢鐮刀菌種內(nèi)遺傳差異分析，該結(jié)果與段會(huì)軍等[11]和王建明等[15]的結(jié)果一致。

不同寄主與地理來(lái)源尖孢鐮刀菌的遺傳變異存在復(fù)雜性和多樣性，影響著該病原菌的種系演化和病害防治，明確其遺傳變異具有重要的意義。本研究對(duì)43株來(lái)自于不同寄主或?qū)；图怄哏牭毒腎SSR-PCR遺傳多態(tài)性分析結(jié)果表明，各?；途觊g的遺傳相似系數(shù)與其寄主和地理來(lái)源沒(méi)有明顯的相關(guān)性。有些寄主或地理來(lái)源相同的菌株間的遺傳相似系數(shù)比寄主或地理來(lái)源不同的各菌株間的遺傳相似系數(shù)大，有些則相反。說(shuō)明不同?；皖惾壕曛?，當(dāng)寄主差異較大時(shí)，利用ISSR-PCR遺傳多態(tài)性分析并不能很好的反映菌株與寄主或地理來(lái)源的相關(guān)性，但寄主和地理來(lái)源相同的菌株卻有優(yōu)先聚到一起的趨勢(shì)，該結(jié)果與張述義等[17]的研究結(jié)果一致。通過(guò)進(jìn)一步將供試菌株進(jìn)行細(xì)化分類重新聚類分析，發(fā)現(xiàn)葫蘆科與茄科作物尖孢鐮刀菌ISSR-PCR遺傳多態(tài)性結(jié)果均表明，相同寄主?；途暌虻乩韥?lái)源不同，遺傳相似距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；相同寄主?；颓业乩韥?lái)源相同的菌株，遺傳相似距離較小，親緣關(guān)系較近；但有個(gè)別菌株會(huì)出現(xiàn)例外。該結(jié)果可說(shuō)明在同一類群中不同菌株之間的遺傳相似性與菌株的地理來(lái)源有一定的相關(guān)性，與王建明等[15]的結(jié)果有相似性，而且其認(rèn)為簡(jiǎn)單地提出分子類群與菌株的地理來(lái)源沒(méi)有相關(guān)性是不準(zhǔn)確的。Bentley等[21]研究表明，鐮刀菌在很小的地理隔離就有多樣性，甚至在間隔l m的種植行種系就出現(xiàn)明顯的差異。本研究中如甜瓜?；秃臀鑼；途觌m然均來(lái)自福建省內(nèi)，因地理來(lái)源于不同市縣，均分別歸屬于不同的ISSR類群，說(shuō)明不同?；途暝谶z傳變異上有豐富的多樣性，同時(shí)在相似種群內(nèi)（均來(lái)自葫蘆科或茄科）與地理和寄主來(lái)源存在一定相關(guān)性，這對(duì)后續(xù)田間作物品種種植的合理布局與病原菌的遺傳變異監(jiān)測(cè)具有重要的理論指導(dǎo)，通過(guò)對(duì)田間菌株的遺傳多樣性監(jiān)測(cè)，進(jìn)行作物的輪作、間作和病害防治指導(dǎo)，以減輕病害的發(fā)生。此外，本研究中由于供試菌株數(shù)量有限，可能導(dǎo)致結(jié)果存在一定的局限性。因此，下一步的研究還待收集更多來(lái)源廣泛的菌株，并對(duì)特定的某種?；途N進(jìn)行種下的遺傳多態(tài)性研究。

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