H2O2和NO對反季節(jié)龍眼成花及FT基因表達的影響

洪繼旺　陳星星　李松剛　張蕾　楊子琴

摘 要 為闡明H2O2和NO對龍眼成花及FT基因表達的影響，選用9年生‘石硤反季節(jié)龍眼，結(jié)合H2O2和NO促進劑及信號阻斷劑噴施，分析龍眼成花及FT基因表達量的動態(tài)變化。結(jié)果表明：反季節(jié)龍眼FT基因表達量在成花過程中上升，且葉片中FT基因表達高峰時間早于頂芽，而SNP和MV均不同程度上調(diào)了FT基因的表達；DMTU和L-NNA有效地抑制了頂芽中FT基因的表達，但對花芽分化后期的葉片中FT基因表達抑制不明顯。結(jié)合龍眼成花情況，推斷H2O2和NO信號在促進龍眼成花方面具有重要作用。

關鍵詞 龍眼；成花；H2O2；NO；FT基因

中圖分類號 S667.1 文獻標識碼 A

Abstract This paper focused on the impact of H2O2 and NO on the expression of FT gene and floral bud formation. We sprayed H2O2/NO generators and signal scavenger to the 9-year-old off-season‘Shixia（a variety of Longan）. The measured parameters includes the cases of floral buds and the dynamic changes of the FT gene expression in the leaves and buds. The results showed that the expression quantity of FT gene of off-season Longan rose up in the process of flowering and the peak period of the expression of the FT gene in leaves was earlier than that in terminal buds. The SNP and MV both increased the expression of FT gene in different degrees. The expression of FT gene in terminal buds inhibited effectively by DMTU and L-NNA，but it was not effectively enough when FT gene expressed in the later period of differentiation of flower buds in leaves. Combined with the formation of flowers in Longan，we believe that H2O2 and NO play an important role in promoting the formation of flowers in Longan.

Key words Longan；Flower bud formation；Hydrogen peroxide（H2O2）；Nitric oxide（NO）；FT gene

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.013

龍眼（Dimocarpus longan Loureiro）是典型的亞熱帶常綠果樹，在中國海南、廣東、廣西、福建等省區(qū)廣泛種植。龍眼的成花受低溫誘導，而強氧化劑氯酸鉀可取代低溫誘導龍眼反季節(jié)成花，這使得經(jīng)典的花芽分化理論面臨新的挑戰(zhàn)。氯酸鉀的施用勢必造成脅迫，氧化脅迫與低溫誘導應存在某些共同之處，從而啟動了龍眼花芽分化的發(fā)生。由此可見，脅迫誘導的生理信號與成花存在一定的相關性。實際上，低溫脅迫以及氧化脅迫存在著共同的特征，即都會導致活性氧和活性氮的累積使植物處于脅迫狀態(tài)[1-2]。

作為比較穩(wěn)定的一種活性氧信號分子，H2O2調(diào)控許多生理過程，包括產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、誘導氣孔關閉、誘發(fā)過敏性反應[3]。Lokhande等[4]發(fā)現(xiàn)，擬南芥開花前的抗壞血酸過氧化物酶活性越高，則開花越遲；氧化脅迫越強，開花越早。為此，Lokhande等[4]提出H2O2是誘導開花的一個因子。另有證據(jù)表明，H2O2的形成與花發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)表達有關[5]。NO作為信號分子參與了活性氧協(xié)同作用，從而啟動植物的應逆反應[6]。Zafra等[7]發(fā)現(xiàn)，油橄欖成花過程有賴于H2O2和NO的參與，且NO大量爆發(fā)時H2O2含量出現(xiàn)下降趨勢。低溫脅迫可誘導荔枝混合花芽中H2O2和NO含量上升；H2O2和NO發(fā)生劑硝普鈉和百草枯處理同樣可以增加荔枝混合花芽中NO和H2O2含量，促進抽生純花芽。NO合酶抑制劑L-NNA和H2O2清除劑DMTU抑制荔枝成花，這表明H2O2和NO正調(diào)控荔枝成花[8]。關于H2O2和NO在龍眼成花過程中的作用報道較少，H2O2和NO對龍眼成花是否也存在調(diào)控作用還有待深入研究。本研究從信號的加強及阻斷途徑入手，分析H2O2和NO在龍眼成花中對成花及FT基因表達的影響，以期探明龍眼成花的信號分子調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所選植物材料為9年生的反季節(jié)催花‘石硤龍眼，均常規(guī)管理。于正造季節(jié)摘除龍眼樹花序，在新梢抽生3次后進行催花（6月中旬）。催花方式：土施氯酸鉀和氯化鉀，m氯酸鉀 ∶ m氯化鉀=6 ∶ 4，每米樹冠直徑施0.5 kg。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計與樣品采集 試驗設信號加強劑、阻斷劑及對照共5個處理，即H2O2發(fā)生劑百草枯（MV）20 mg/L、 H2O2清除劑二甲基硫脲（DMTU）1 g/L、 NO發(fā)生劑硝普鈉（SNP）0.1 mmol/L、 NO合酶抑制劑 （L-NNA）0.1 mmol/L、 陰性對照（清水）， 5次重復，每個重復1株樹。噴施方式： 對龍眼枝梢進行噴施，噴施至葉片滴水為限， 每處理固定15個枝梢留作觀察用。每隔7 d采集樣品一次， 直至側(cè)花原基形成前7 d為止， 采集的樣品為葉片與頂芽。

1.2.2 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄與cDNA的PCR擴增 采用天恩澤公司的植物RNAout提取試劑盒及DNA清除試劑盒分別對不同時期的樣品進行總RNA的提取及純化；將得到的RNA進行濃度測定和電泳檢測后，取2 μg的RNA進行反轉(zhuǎn)錄；將得到的cDNA通過熒光定量PCR方法同時對龍眼成花關鍵基因和內(nèi)參基因GAPDH的表達水平進行檢測，所采用的引物見表1。

具體反應條件如下：反應總體積為20 μL，其中SYBRR premix Ex TaqTM II（2×）5 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板2 μL，用滅菌DEPC水補足，混合均勻；擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，并收集熒光，40個循環(huán)后進行熔解曲線分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對反季節(jié)龍眼成花過程中葉片F(xiàn)T基因表達的影響

GAPDH基因和FT基因的PCR擴增分別見圖1、圖2。氯酸鉀反季節(jié)催花導致了龍眼葉片中FT基因表達量短暫下降后即出現(xiàn)上升態(tài)勢，并在催花后14 d上升至最高值，是催花0 d時的2.74倍；隨后下降至極低水平（見圖3中的CK）。使用SNP處理的龍眼樹，在催花后7 d，葉片F(xiàn)T基因表達量變化不大，然而隨后上升，催花14 d后，葉片中的FT基因表達量上升至高峰，達到0 d時的6.98倍；使用MV處理時，在催花后7 d，葉片F(xiàn)T基因表達量變化不大，然而隨后上升，在催花21 d后FT表達量上升至最高值，達到催花0 d時的7.33倍；DMTU處理顯著地抑制了處理初期葉片F(xiàn)T基因表達量，但在21 d時葉片F(xiàn)T基因表達量恢復至催花0 d時的水平；用L-NNA處理7 d后FT基因表達量出現(xiàn)小幅的下調(diào)，隨后緩慢地上升，至21 d時葉片F(xiàn)T基因表達量上升至0 d時的4.81倍（圖3）。

2.2 不同處理對反季節(jié)龍眼成花過程中頂芽FT基因表達的影響

除MV處理對氯酸鉀反季節(jié)催花的龍眼頂芽FT基因表達有較大的影響外，其余各處理與陰性對照有相似的變化趨勢。MV處理的頂芽FT基因表達量在催花后7 d上升至峰值，達到0 d時的8.79倍，隨后下降至0 d時的6.08～7.36倍之間。而其余各處理與對照的FT基因表達量在催花后有小幅的下降，隨后緩慢上升；在催花后21 d，SNP處理的頂芽FT基因表達量達到催花0 d時的4.98倍，DMTU處理的頂芽FT基因表達量達到催花0 d時的3.94倍，L-NNA處理的頂芽FT基因表達量達到催花0 d時的2.42倍（圖4）。

2.3 不同藥劑處理對反季節(jié)龍眼成花的影響

催花后28 d，各藥劑處理間表現(xiàn)出很大的差異：SNP（硝普鈉，NO發(fā)生劑）和MV（百草枯，H2O2發(fā)生劑）可顯著促進龍眼花芽形成，而L-NNA（NO合酶抑制劑）及DMTU（二甲基硫脲，H2O2清除劑）對龍眼成花有抑制作用（圖5）。

3 討論與結(jié)論

在許多植物中，F(xiàn)T基因及其同源物被認為是強大的開花推動者，在調(diào)節(jié)從營養(yǎng)生長階段到生殖生長階段的過渡中起著至關重要的作用[9-11]。擬南芥接受合適的光周期誘導后，F(xiàn)T的轉(zhuǎn)錄本（mRNA）從葉片移動到頂端組織，翻譯后的FT蛋白促進了下游成花基因AP1的表達，進而促進開花[12]，且過量表達FT基因，擬南芥花期明顯提前[13]。有相關學者提出FT可能就是通常說的開花素（florigen）。酵母雙雜交試驗發(fā)現(xiàn)，在蘋果中FT同源基因編碼蛋白、TCP（teosinte branched1， cycloidea and proliferating cell factors）基因以及VOZ1（vascullar plant one zinc finger protein）基因編碼蛋白相互作用，不僅參與了分生組織細胞增殖，而且影響葉片和果實的發(fā)育[14]。本研究中也發(fā)現(xiàn)，反季節(jié)催花（氯酸鉀處理）的龍眼，F(xiàn)T基因在成花過程中表達量上升，且葉片中FT基因表達高峰時間早于頂芽。而SNP和MV均不同程度上調(diào)了FT基因的表達；DMTU和L-NNA有效地抑制了頂芽中FT基因的表達，對花芽分化后期葉片中的FT基因表達抑制不明顯。

在植物與環(huán)境的互作中，適當?shù)拿{迫往往促進開花，如高溫脅迫可誘導水仙花FT-like NFT1基因高量表達[15]；干旱脅迫造成了擬南芥中包括FT基因在內(nèi)的4 153個成花相關基因差異表達[16]。而氯酸鉀處理代替低溫脅迫誘導龍眼成花也是脅迫后產(chǎn)生的生理效應，由FT基因的表達豐度變化的時序，推測龍眼感受脅迫的部位首先是葉片，成花基因的表達最早在葉片中上調(diào)，然后才是頂芽的FT基因表達上調(diào)，這與Ream等[17]在二穗短柄草的研究結(jié)論相同，即低溫可誘導短柄草FT基因表達量上調(diào)，且葉片是低溫脅迫的最先感知部位，成花基因的最早表達也出現(xiàn)在葉片中，隨后才是樹體其他部位一系列的變化。

綜上所述，結(jié)合龍眼成花情況，推斷H2O2和NO在促進龍眼成花方面具有重要作用。

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