巴西橡膠樹HbCytb561的克隆及表達分析

王立豐　王紀坤　安鋒　謝貴水

摘 要 細胞色素b561通過參與抗壞血酸的再生在活性氧淬滅、生長發(fā)育和抗旱等生理過程中起作用。從巴西橡膠樹熱研7-33-97葉片中克隆一個細胞色素b561基因，其推導(dǎo)氨基酸含有特征性Cyt_b561家族結(jié)構(gòu)域，命名為HbCytb561。該基因在花、葉片和膠乳中表達，在樹皮中不表達。干旱、機械傷害和白粉菌侵染均顯著上調(diào)該基因在橡膠樹葉片中表達。結(jié)果說明HbCytb561基因受逆境反應(yīng)誘導(dǎo)，參與橡膠樹抗逆響應(yīng)的生理和分子機制。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；干旱；細胞色素b561；活性氧；機械傷害

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract Cytochrome b561 takes part in reactive oxygen species scavenges， growth and development as well as drought tolerance through regeneration of ascorbic acid. In this study， a HbCytb561 was cloned and designated from the leaves of rubber tree clone CATAS7-33-97， which containing specific Cyt_b561 superfamily domain. The highest expression was observed in flowers， then in leaves and latex. No expression was found in the bark. Drought， mechanical wounding and powdery mildew infection up regulated its expression at significant level. These suggested that HbCytb561， inducted by stress environment， play roles in physiological and molecular mechanisms of stress resistance in rubber tree.

Key words Hevea brasiliensis； Drought； Cytb561； ROS； Mechanical wounding

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.008

細胞色素b561（Cytochrome b561）家族含有b561核心結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其特征基序的不同，將其分為7個亞家族，其中B組為植物家族[1]。細胞色素b561是含有2個血紅素分子的內(nèi)膜蛋白，參與抗壞血酸（維生素C）再生[2]。其作用機制是作為電子傳遞體攜帶電子跨過質(zhì)膜，將電子從抗壞血酸分子轉(zhuǎn)移到受體分子上。抗壞血酸單電子氧化的產(chǎn)物-單脫氫抗壞血酸（MDHA）在哺乳動物和植物中被鑒定為是細胞色素b561的電子受體。細胞色素b561催化MDHA還原導(dǎo)致還原性抗壞血酸的再生。細胞色素b561在人類[3]、動物[4]和植物中都有發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)物種含有3～4個細胞色素b561同源蛋白，是疏水性蛋白，含有6個跨膜結(jié)構(gòu)（TMH1～TMH6）。TMH2～TMH5這4個跨膜螺旋是最保守區(qū)域，TMH1和TMH6則保守型相對較差。在植物擬南芥、葡萄、大豆和玉米等植物中發(fā)現(xiàn)了Cytb561基因家族成員[5]，證明其參與擬南芥抗病[6]、西瓜抗旱[7]等生理過程，其功能受到膜電勢[8]、小RNA[9]和二氫硫辛酸[10]等調(diào)節(jié)。

中國橡膠樹種植經(jīng)常面對寒害[11]、風害和干旱[12]等逆境的威脅。目前，發(fā)現(xiàn)橡膠樹寒害和干旱逆境響應(yīng)均與活性氧代謝和淬滅有關(guān)[13]?；钚匝醮銣缈煞譃槊复俸头敲复?個類型，主要與SOD、抗壞血酸、酚類等相關(guān)[14]。例如，干旱可導(dǎo)致巴西橡膠樹病蟲害發(fā)生率[15]、死皮率增加，還增加災(zāi)害預(yù)報和管理成本[16-17]， 降低膠乳產(chǎn)量[18]。已有研究結(jié)果證明，干旱會誘導(dǎo)橡膠樹滲透調(diào)節(jié)能力變化[19]，也會導(dǎo)致葉片中蛋白質(zhì)含量變化[20]。筆者發(fā)現(xiàn)干旱會誘導(dǎo)抗壞血酸過氧化物酶的上調(diào)表達[13]，因此推測抗壞血酸再生與橡膠樹抗旱性緊密相關(guān)。筆者擬從巴西橡膠樹熱研7-33-97葉片中克隆與抗壞血酸再生密切相關(guān)的HbCytb561基因，研究其在逆境條件下的表達規(guī)律，為闡明HbCytb561基因在橡膠逆境響應(yīng)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以位于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗場二隊15年生巴西橡膠樹品種熱研7-33-97開割樹為材料，采集葉片、膠乳、花和樹皮用于組織表達分析[21]。以中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗場五隊培育的熱研7-33-97芽接苗為材料，選取均勻一致的2蓬葉且頂篷葉片處于穩(wěn)定期的芽接苗進行干旱、機械傷害和白粉菌侵染處理。

1.2 方法

1.2.1 植物材料RNA提取和cDNA合成 膠乳、葉片等材料總RNA提取根據(jù)Qin等[21]的方法，利用DNaseⅠ去除RNA中殘留的少量DNA。所提取的RNA經(jīng)紫外分光光度計測定OD230、OD260、OD280吸收值以檢測純度，同時采用1%甲醛變性膠電泳檢測RNA的完整性。cDNA第Ⅰ鏈合成參照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit， Fermentas試劑盒說明書[22]。

1.2.2 HbCytb561基因的克隆 根據(jù)GenBank公布的人類、擬南芥和蓖麻等細胞色素b561蛋白序列，在橡膠樹EST數(shù)據(jù)庫中做TBLASTN搜索，通過DNAman軟件拼接同源片段，得到巴西橡膠樹細胞色素b561基因的cDNA序列。采用primer 6.0軟件設(shè)計基因特異引物Cytb561F1（5′-CTCACAGG

CTCACACTTAA-3′）和cytb561R1（5′-TCAGTTGAAG

TCATAGGACG-3′），以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第Ⅰ鏈為模板，擴增巴西橡膠樹細胞色素b561基因的cDNA序列。使用2×Taq PCR MasterMix（天根生化）進行PCR擴增，反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×PCR MasterMix 25 μL，加ddH2O至50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃變性3 min，94 ℃變性30 s；55 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段，凝膠回收純化，并克隆到pMD19-T載體上，經(jīng)菌落PCR檢測，送上海立菲生物技術(shù)有限公司廣州測序部進行測序驗證[23]。

1.2.3 HbCytb561的生物信息學(xué)分析 采用NCBI ORF Finder 在線分析工具預(yù)測基因的ORF及其編碼的氨基酸序列，通過Expasy的ProtParam在線分析軟件分析巴西橡膠樹細胞色素b561蛋白中各種氨基酸含量，并預(yù)測得到理論分子量和等電點；用NCBI Conserved Domains數(shù)據(jù)庫和SMART在線分析軟件分析蛋白的結(jié)構(gòu)；用SignalP 4.1 Server在線分析軟件分析信號肽結(jié)構(gòu)；用TMHMM 2.0 Server在線分析軟件分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域。在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中通過blastp搜索其它物種的細胞色素b561同源蛋白并獲取其序列，利用DNAman8.0軟件進行多重序列比對[23]。

1.2.4 HbCytb561基因表達分析 干旱處理采用先將芽接苗澆水至飽和，然后放在光照培養(yǎng)箱進行斷水處理，連續(xù)采集0～10 d葉片為材料[13]；機械傷害處理采用Qin等[21]的方法；白粉菌處理采用筆者發(fā)表的方法[24]。以熒光定量引物N561F（5′-CTAC

AGTTAGGAGCGAGTC-3′）和N561R（5′-ACAGCAG

TGAAGTTGATGA-3′）擴增，以HbACTIN為內(nèi)參基因，分析HbCytb561的表達量。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS軟件（版本號21）進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析和Duncan檢驗分析不同處理間基因表達的差異顯著性。采用Origin2015科技繪圖軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbCytb561基因克隆與生物信息學(xué)分析

HbCytb561（基因登錄號：KM086717）基因，全長977 bp，其5′端長度為228 bp，3′端長度為50 bp，編碼區(qū)長度為702 bp，編碼233個氨基酸（圖1）。其推導(dǎo)氨基酸分子量為25.3 ku，等電點8.61，分子式為C1 211H1 876N282O298S5，為疏水性蛋白。推導(dǎo)氨基酸與蓖麻RcCytb561（Ricinus communis，XP_002510795.1）、花煙草NsTAF1L（Nicotiana sylvestris，XP_009778201.1）、煙草NtTAF1L（Nicotiana tomentosiformis，XP_009590952.1）和苜蓿MtCytb（Medicago truncatula，XP_003638360.1）相似性分別為77%、68%、67%和69%，是細胞色素b561家族成員。第80位賴氨酸和第105位組氨酸是底物識別位點（圖2）。

生物信息學(xué)分析可以看出（圖3），HbCytb561基因推導(dǎo)的氨基酸序列中1～37位氨基酸編碼信號肽，49～175位氨基酸編碼特異的Cyt_b561 superfamily結(jié)構(gòu)域（圖3-A）。亞細胞定位分析表明，其在質(zhì)膜、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔的幾率分別為0.64、0.46、037和0.10，表明細胞色素b561定位在質(zhì)膜上（圖3-B）。根據(jù)跨膜軟件分析，發(fā)現(xiàn)細胞色素b561蛋白在10～32、45～67、82～104、116～138、

153～175和195～217具有6個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖3-C）。

2.2 HbCytb561基因的表達分析

干旱處理橡膠樹芽接苗10 d葉片中，HbCytb561在第3天有顯著上調(diào)表達的趨勢，隨后隨著干旱處理時間的延長，其表達量逐漸下降，在第8天又呈現(xiàn)上升趨勢，隨后下降（圖4）。這說明，細胞色素b561參與橡膠樹干旱響應(yīng)的關(guān)鍵時期為第3天。

從圖5的組織表達分析可以看出，HbCytb561在花中的表達量最高，在葉片和膠乳中表達量次之，在樹皮中不表達。說明其主要在花、葉片和膠乳中起作用。

從圖6可以看出，機械傷害處理葉片后，在1～2 h上調(diào)HbCytb561的表達，隨后下降，其表達最高峰出現(xiàn)在在機械傷害處理后的10～24 h，說明HbCytb561參與橡膠樹對機械傷害的早期反應(yīng)。

白粉菌侵染后不同級別的葉片中HbCytb561的表達顯著上調(diào)，尤其在3級和4級葉片中上調(diào)分別為4.5和3倍。說明白粉菌侵染會導(dǎo)致HbCytb561表達的顯著增加，與干旱和機械傷害的結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

3.1 HbCytb561是植物細胞色素b561家族成員

抗壞血酸在真核生物中參與多種基礎(chǔ)的代謝反應(yīng)，細胞色素b561是抗壞血酸依賴的氧化還原酶，具有高度保守的跨膜結(jié)構(gòu)，在抗壞血酸循環(huán)和離子吸收起到重要作用[6]。目前，其結(jié)構(gòu)與功能研究進展迅速[25]。筆者從橡膠樹品種熱研7-33-97葉片中克隆了HbCytb561基因，與蓖麻、煙草中的細胞色素b561基因相似度達70%以上，含有特征性Cytb561結(jié)構(gòu)域，并含有6個跨膜結(jié)構(gòu)域。物種間差異會引起細胞色素b561基因結(jié)構(gòu)和定位的差異。例如，亞細胞定位已發(fā)現(xiàn)細胞色素b561基因定位在溶酶體[26]和液泡膜上[27]，而筆者發(fā)現(xiàn)HbCytb561定位在質(zhì)膜上。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)賴氨酸81和組氨酸106對于底物識別和催化具有重要作用[28]，在玉米中發(fā)現(xiàn)精氨酸72和酪氨酸71是保守位點[29]。HbCytb561由于物種差異，其底物結(jié)合位點與擬南芥相差一位。上述分析說明HbCytb561是植物細胞色素b561家族成員。

3.2 HbCytb561參與橡膠樹干旱等抗逆反應(yīng)

盡管植物中對細胞色素b561基因結(jié)構(gòu)研究較多，但對其生理功能研究較少。已經(jīng)證明，細胞色素b561具有促進抗壞血酸再生[30]、生長發(fā)育[31]和參與抗旱[7]的作用。橡膠樹生長發(fā)育過程中經(jīng)常遇到干旱、白粉菌侵染等脅迫，同時割膠亦會導(dǎo)致對橡膠樹樹皮的傷害。筆者發(fā)現(xiàn)，干旱會誘導(dǎo)橡膠樹葉片產(chǎn)生活性氧，進而導(dǎo)致活性氧淬滅酶基因表達和活性增加。干旱處理3～5 d是橡膠樹生理反應(yīng)的關(guān)鍵時期。本文中，HbCytb561基因受干旱上調(diào)表達，其在第3天表達豐度最高，說明同其它活性氧淬滅酶一起參與了橡膠樹抗旱生理反應(yīng)。隨后，由于干旱的加重，導(dǎo)致其基因表達持續(xù)下降。在西瓜中證明上調(diào)表達細胞色素b561和抗壞血酸氧化酶基因能提高野生西瓜對干旱和高光照的抗性[7]。機械傷害和白粉菌侵染會導(dǎo)致葉片中活性氧含量上升，進而導(dǎo)致HbCytb561基因上調(diào)表達。筆者證明了在橡膠樹葉片中HbCytb561參與抗逆調(diào)控，是對細胞色素b561基因生物功能的深入詮釋。

本研究結(jié)果說明HbCytb561含有細胞色素b561家族特征的結(jié)構(gòu)域，參與橡膠樹對干旱、機械傷害和白粉菌侵染的響應(yīng)，將為闡明細胞色素家族成員功能和篩選橡膠樹抗逆診斷指標打下堅實基礎(chǔ)。

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