芹菜籽中黃酮的提取工藝

徐斌，馬洪波，張嵐，葛紅娟

（吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132013）

芹菜籽中黃酮的提取工藝

徐斌，馬洪波*，張嵐，葛紅娟

（吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132013）

探討芹菜籽黃酮類成分的最佳提取工藝，為芹菜籽的開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。以甲醇為提取溶劑，采用索式提取法從芹菜籽中提取黃酮類物質(zhì)成分，以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)單因素試驗(yàn)，影響黃酮提取率的因素主次順序?yàn)椋毫弦罕龋咎崛r(shí)間＞甲醇濃度＞提取溫度。芹菜籽中黃酮的最佳提取工藝條件下芹菜籽黃酮粗品的提取率為13.54（%）。索式提取法提取芹菜籽中黃酮是中切實(shí)可行的方法。

芹菜籽；黃酮；索式提取法

黃酮類化合物是一類結(jié)構(gòu)相似，功能相近的抗氧化劑，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同，主要分為四種，分別為：黃酮、黃烷酮、兒茶素、花色苷。其生理特性取決于其結(jié)構(gòu)中含雙鍵的芳香環(huán)，特別是與芳香環(huán)的失電子有關(guān)［1］。傘形科植物芹菜［2］在維吾爾醫(yī)藥中應(yīng)用廣泛并已頒布標(biāo)準(zhǔn)，已記載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部〈藥品標(biāo)準(zhǔn)〉維吾爾藥分冊(cè)》和《維吾爾藥志》等書(shū)籍，是新疆資源豐富的藥食兼用植物資源［3-4］。

芹菜，屬傘形科植物。有水芹、旱芹兩種，功能相近，藥用以旱芹為佳。旱芹香氣較濃，又名“香芹”，亦稱“芹菜”。芹菜是高纖維食物，它經(jīng)腸內(nèi)消化作用產(chǎn)生一種木質(zhì)素或腸內(nèi)脂的物質(zhì)，這類物質(zhì)是一種抗氧化劑，常吃芹菜，對(duì)預(yù)防高血壓、動(dòng)脈硬化等都十分有益，并有輔助治療作用。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)芹菜的研究主要是對(duì)地上部分的揮發(fā)油和黃酮類成分抗腫瘤和心血管病等的研究上，體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明芹菜全草含有的黃酮類、丁基苯酞類、氨基酸、不飽和脂肪酸等多種成分都具有降血壓、降血脂的生理功能［5］。新疆維醫(yī)臨床中以旱芹的根和籽入藥，認(rèn)為其性干熱，具健腦安神、活血痛經(jīng)、祛風(fēng)除濕之功能；常用于頭暈頭痛，四肢麻木，高血壓，清胃中濁夜和風(fēng)濕病癥，是多種護(hù)肝降壓維成藥制劑的主要藥味［6］。

國(guó)內(nèi)大多實(shí)驗(yàn)均針對(duì)芹菜的根、莖、葉中黃酮類化合物的提取或芹菜籽精油的提純提出相關(guān)的研究報(bào)道，但是研究較少涉及對(duì)芹菜籽中黃酮類化合物的提?。?］。本實(shí)驗(yàn)以甲醇為提取溶劑，采用索式提取法從芹菜籽中提取黃酮類物質(zhì)成分，以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定，探討芹菜籽黃酮類成分的最佳提取工藝，為芹菜籽的開(kāi)發(fā)和利用提供理論參考。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

芹菜籽：購(gòu)于吉林市欣源食品有限公司，粉碎過(guò)40目篩；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：天津一方科技有限公司，甲醇、乙醚、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉以上均為分析純：天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA）：上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-ⅢA）：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；臺(tái)式低溫離心機(jī)（TD5A）：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；中草藥粉碎機(jī)（ZN-500A）：長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠；電子分析天平（FA1104N）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HHS-21-4）：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電熱恒溫干燥箱（202-1AB）：天津市泰斯特儀器有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV1800）：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 粗黃酮提取工藝

芹菜籽→脫脂→熱水浸提→抽濾→濃縮→加甲醇溶液→靜置過(guò)夜→離心10 min（3 000 r/min）→沉淀溶解定容→脫質(zhì)蛋白質(zhì)、脫色→測(cè)定。

將芹菜籽除雜，放入干燥箱中60℃干燥至恒重，用中藥粉碎機(jī)粉碎成粉末，過(guò)40目篩。乙醚脫脂，樣品至于干燥箱中60℃烘干至恒重，備用。

準(zhǔn)確稱取5份粉碎的芹菜籽樣品各1.000 0 g置于250 mL圓底燒瓶中，以料液比1∶30向其中加入體積分?jǐn)?shù)為40%的甲醇溶劑，設(shè)定提取溫度為60℃，回流提取，冷至室溫，過(guò)濾，濾液離心10 min，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，并用相同體積的甲醇將其溶解，然后精密吸取1 mL至25 mL容量瓶中。依次加入顯色劑后定容至刻度，在484 nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

用單因素實(shí)驗(yàn)方法對(duì)影響芹菜籽中黃酮提取率的4個(gè)因素即提取時(shí)間、提取溫度、料液比、甲醇濃度進(jìn)行考察。用分光光度計(jì)測(cè)定484 nm處吸光度值，作為黃酮提取率的指標(biāo)。

1.3.2.1 提取時(shí)間的選擇

料液比30 g/mL，體積分?jǐn)?shù)為40%的甲醇溶劑，提取時(shí)間分別為1、1.5、2、2.5、3 h，重復(fù)3次，取平均值，確定提取的最佳時(shí)間。

1.3.2.2 提取溫度的選擇

料液比30 g/mL，體積分?jǐn)?shù)為40%的甲醇溶劑，分別在40、50、60、70、80℃條件下，提取1 h，重復(fù)3次，取平均值，確定提取的最佳溫度。

1.3.2.3 料液比的選擇

料液比為20、25、30、35、40 g/mL，加入體積分?jǐn)?shù)為40%的甲醇溶劑，提取溫度為最佳提取溫度，提取1 h，重復(fù)3次，取平均值，確定提取的最佳料液比。

1.3.2.4 甲醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

以最佳的提取時(shí)間，最佳的提取溫度，最佳的料液比，體積分?jǐn)?shù)為20、40、60、80、100%的甲醇溶劑，重復(fù)3次，取平均值，確定提取的最佳甲醇體積分?jǐn)?shù)。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上同，以提取時(shí)間、提取溫度、料液比、甲醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)條件為考察因素，采取三水平四因素L9（34）正交表正交試驗(yàn)，以吸光度為考察目標(biāo)，篩選最佳提取條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1Design of orthogonal test

1.3.4 黃酮含量的測(cè)定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品0.005 g，置于25 mL容量瓶中，加甲醇適量置水浴上微熱使之溶解，放冷并稀釋至刻度，搖勻，即得0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品。備用。移取蘆丁溶液1.00 mL于25 mL容量瓶中，加入5 mL蒸餾水后搖勻，然后按順序依次加入顯色劑：1.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置8 min；1.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min；加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的氫氧化鈉溶液，再加水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min。用蒸餾水定容，以試劑空白為參比，用紫外分光光度計(jì)在200 nm～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行吸光度掃描，2次掃描重復(fù)平均，最大特征吸收峰為484 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別移取蘆丁溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于25 mL容量瓶中，依次加入蒸餾水6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0 mL，搖勻后，按順序依次加入顯色劑：1.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置8 min；1.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min；加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的氫氧化鈉溶液，再加水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min。用蒸餾水定容，以試劑空白為參比，在484nm處測(cè)吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2黃酮含量的測(cè)定

取0.6 mL上述過(guò)濾液后的樣品溶液置于25 mL容量瓶中，按順序依次加入顯色劑：1.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置8 min；1.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min；加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)45的氫氧化鈉溶液，再加水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min。用蒸餾水定容，以試劑空白為參比，在484 nm處測(cè)吸光度。

1.3.5 粗黃酮提取率計(jì)算

黃酮類物質(zhì)提取率（%）=（n×C×V）/（m×1 000）× 100%

式中：C為樣品中相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蘆丁濃度，（mg/ mL）；V為提取物溶液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，mg。

2結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間的選擇

提取時(shí)間對(duì)芹菜籽黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.1The influence of extraction time on extraction yield

由圖1可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)，在2 h有一個(gè)明顯高峰，過(guò)后提取率反而下降，故最佳攝取時(shí)間為2 h。

2.1.2 提取溫度的選擇

提取溫度對(duì)芹菜籽黃酮提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2The influence of extraction temperature on the extraction yield of flavonoids

由圖2可知，隨著提取溫度的上升，芹菜籽中黃酮的提取率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)，但當(dāng)溫度超過(guò)60℃后，提取率會(huì)有所下降，隨著溫度的繼續(xù)升高會(huì)使溶劑少量揮發(fā)，雜質(zhì)溶出量增加，會(huì)破壞黃酮生物活性，色澤加深，黏度增大，最佳提取溫度為60℃。

2.1.3 料液比的選擇

料液比對(duì)芹菜籽黃酮提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3The influence of ratio between material and extracting solutio on extraction yield of flavonoids

由圖3可知，料液比30 g/mL時(shí)的黃酮的提取率與20、25 g/mL之間的差別較大。隨著料液比的增加，黃酮的提取率不斷地下降，選取料液比為30 g/mL。

2.1.4 甲醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)芹菜籽黃酮提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4The influence of methanol volume fraction on extraction yield of flavonoids

由圖4可知，甲醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，有一個(gè)明顯高峰，過(guò)后隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大提取率反而下降，選取甲醇體積分?jǐn)?shù)為40%。

2.2 正交試驗(yàn)

三水平四因素正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。方差分析見(jiàn)表3。

極差分析可以看出，RD＞RB＞RA＞RC，即料液比是芹菜籽黃酮提取的最重要因素，料液比例改變對(duì)芹菜籽黃酮的提取率影響最大，其次是甲醇濃度，再者是提取時(shí)間，最后是提取溫度。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化甲醇回流提取芹菜籽中黃酮最佳條件為A1B1C1D1，即20%甲醇為提取溶劑，料液比為30 g/mL時(shí)，40℃提取1 h，此時(shí)芹菜籽黃酮提取率最高，為14.635%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Result of orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3One-way ANOVA of orthogonal test

由方差分析可知除提取溫度對(duì)芹菜籽黃酮的提取的影響差異不顯著外，其余因素P值均小于0.05，差異顯著，且方差分析結(jié)果與極差分析結(jié)果一致，對(duì)芹菜籽黃酮提取率影響從大到小的因素依次為D＞B＞A＞C，說(shuō)明在工藝生產(chǎn)中改變提取溶劑及用料的比例對(duì)芹菜籽黃酮提取率影響最大，其次為甲醇濃度、提取時(shí)間，而在工業(yè)生產(chǎn)中改變提取溫度對(duì)結(jié)果影響不大，考慮到生產(chǎn)成本應(yīng)選用較低的提取溫度，降低能耗，節(jié)約成本。

3討論

本實(shí)驗(yàn)選用蘆丁作為對(duì)照品，一方面因?yàn)樘J丁是黃酮類化合物中比較有代表性的一種，可以通過(guò)測(cè)定蘆丁對(duì)照品的吸光度從而求算出樣品中黃酮的含量，這是黃酮含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)中比較經(jīng)典的方法。另一方面，蘆丁經(jīng)紫外分光光度計(jì)在200 nm～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行吸光度掃描，2次掃描重復(fù)平均，得最大特征吸收峰為484 nm，可作為定性和定量的依據(jù)。

對(duì)芹菜籽中黃酮進(jìn)行提取時(shí)，分別從甲醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度等4個(gè)方面對(duì)提取率的影響來(lái)考察。在進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)得出如下結(jié)論：甲醇濃度為40%、料液比為30 g/mL、提取時(shí)間2 h、提取溫度為60℃，芹菜籽中黃酮的提取率分別達(dá)到最高。

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選用甲醇濃度，料液比，提取時(shí)間，提取溫度這4個(gè)主要因素作為考察變量，每個(gè)因素上選擇3個(gè)考察水平，進(jìn)行三水平四因素正交試驗(yàn)，每個(gè)提取工藝的組合進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，最終將實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。通過(guò)正交試驗(yàn)確定了芹菜籽中黃酮類化合物提取的最佳提取工藝條件為A1B1C1D1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇回流提取芹菜籽中黃酮過(guò)程操作簡(jiǎn)便可行，可作為芹菜籽中黃酮含量測(cè)定的方法。黃酮類化合物提取溶劑最常用的是甲醇和乙醇，以滲漉法、浸漬法、回流法、連續(xù)回流法提取。90%左右的醇適宜于提取黃酮苷元；60%左右的醇適宜于提取黃酮苷類［8］?？琢蠲鞯龋?］采用乙醇為浸提溶劑從枸杞中提取黃酮類化合物，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定枸杞中黃酮類化合物最佳提取條件下黃酮提取率可達(dá)0.946%。姜笑寒等［10］也用醇提取法提取去油后的芹菜籽中的黃酮成分的方法具有可行性，為芹菜籽中黃酮類化合物的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持，章宏慧等［11］認(rèn)為芹菜黃酮中芹菜素、槲皮素、山奈酚、木犀草素等含量較高，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)芹菜黃酮具有較高的生物活性，包括抗氧化活性，抗癌活性，抗心血管疾病以及在生殖系統(tǒng)方面可抑制性激素的分泌等功效。在國(guó)外，烘干的芹菜葉粉末可用于制造抗菌劑、除臭劑、洗滌劑肥皂、牙膏等因?yàn)樗梢宰柚怪|(zhì)過(guò)氧化物的形成、抗炎癥及抗衰老［11］。

總之，芹菜無(wú)論葉、徑、籽都有藥用價(jià)值，常食芹菜對(duì)孕婦、缺鐵性貧血、高血壓及肝病患者恢復(fù)健康有輔助治療作用；黃酮類有效物質(zhì)，對(duì)人類的健康更大有益處，并減少因用藥物治療帶來(lái)的不良影響。從植物中提取黃酮類化合物也成為現(xiàn)代食品工業(yè)發(fā)展的主要趨勢(shì)，從而推動(dòng)種植業(yè)的大力發(fā)展發(fā)展，對(duì)于芹菜這種藥食兩用蔬菜，不因豐產(chǎn)而降價(jià)，保證了種植者的穩(wěn)定收入，無(wú)論種植業(yè)還是加工業(yè)都有廣闊的發(fā)展前景，會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

［1］鐘建青，李波，賈琦，等.天然黃酮類化合物及其衍生物的構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46（6）：622-630

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The Extraction Process of Flavonoids in Celery Seed

XU Bin，MA Hong-bo*，ZHANG Lan，GE Hong-juan
（Department of Public Health，Jilin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China）

Investigate the best extraction technology of flavonoids ingredients in celery seed，to provide theoretical basis for the development and utilization of celery seeds.Using methanol as extraction solvent，adopting soxhlet extraction to extract flavonoids ingredients from celery seed，as rutin For comparison，using ultraviolet spectrophotometric method for determination.By means of single factor experiment the primary and secondary order of influencing factors of the extraction yield of flavonoids：ratio between material and extracting solutio＞extraction time＞methanol concentration＞extraction temperature.Under the optimum extraction technology conditions flavonoids extraction yield in raw celery seed was 13.54（%）.Soxhlet extraction to extract flavonoids in celery seed was feasible method.

celery seed；flavonoids；soxhlet extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.017

2014-01-06

徐斌（1972—），男（漢），副教授，碩士，主要從事慢性病的營(yíng)養(yǎng)防治和保健品研發(fā)。

*通信作者：馬洪波（1969—），男（漢），副教授，碩士，主要從事慢性病的營(yíng)養(yǎng)防治研究。