DLLME-UPLC-MS/MS法測定食用油中的雙酚類化合物

何東，冼燕萍，嚴婉盈，郭新東，葉梅，萬渝平

（1.嘉應學院梅州師范分院，廣東梅州514087；2.廣州質量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州510110；3.成都市食品藥品檢驗研究院，四川成都610000）

DLLME-UPLC-MS/MS法測定食用油中的雙酚類化合物

何東1，冼燕萍2，嚴婉盈2，郭新東2，葉梅3，萬渝平3

（1.嘉應學院梅州師范分院，廣東梅州514087；2.廣州質量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州510110；3.成都市食品藥品檢驗研究院，四川成都610000）

基于分散液液微萃取（DLLME）技術和同位素稀釋-超高效液相色譜-質譜/質譜（ID-UPLC-MS/MS），建立了一種快速測定食用油中7種雙酚類化合物的方法。優(yōu)化了萃取劑種類及體積、渦旋分散時間等影響萃取的關鍵因素；優(yōu)化了UPLC分離條件和質譜定性定量參數(shù)。優(yōu)化條件為：400 μL甲醇/乙腈（1∶1，v/v）混合溶液作為萃取劑，渦旋分散萃取1 min；以C18色譜柱和甲醇-0.05%氨水梯度洗脫分離，質譜多反應監(jiān)測模式（MRM）測定。結果表明，7種雙酚類化合物在0.5 μg/L～500 μg/L內線性關系良好，相關系數(shù)均在大于0.998，方法定量限（S/N=10）在0.2 μg/L～3.0 μg/kg之間，3個添加水平的平均回收率為80.1%～93.7%，相對標準偏差（n=6）為4.4%～9.1%。本方法前處理簡單，節(jié)省溶劑和時間，準確靈敏，適用于食用油中7種雙酚類化合物的檢測。

分散液液微萃?。怀咝б合嗌V-質譜/質譜；食用油；雙酚類化合物

雙酚類化合物（Bisphenols，BPs）是一類具有兩個羥苯基結構的物質。這類化合物化學性質穩(wěn)定、耐高溫，延展性良好，生產成本低廉，是生產聚碳酸酯等多種高分子材料的重要原料，被廣泛應用于食品包裝材料等工業(yè)生產中［1］。但是，此類化合物對人體具有內分泌干擾效應，影響生殖與發(fā)育機能，并具有致畸、致癌和致突變等毒效應，而且易富集，不易降解，對人類健康和生態(tài)環(huán)境均有潛在的危害［2-4］。歐盟規(guī)定，嬰幼兒奶瓶中禁止使用雙酚A（Bisphenol A，BPA）；與食品接觸塑料制品中，BPA和雙酚S（Bisphenol S，BPS）的遷移量應分別小于0.6 mg/kg和0.05 mg/kg；而雙酚F（Bisphenol F，BPF）則為禁用［5］。我國也有類似的規(guī)定［6］，然而，現(xiàn)有研究表明這類物質在食品中廣泛存在［7-9］。因此，建立雙酚類化合物的檢測方法對保護環(huán)境和消費者健康具有重要意義。

雙酚類化合物的檢測方法主要有液相色譜法（LC）［10-12］、氣相色譜-質譜法（GC-MS）［13-14］和液相色譜-質譜/質譜法（LC-MS/MS）［15-19］。鑒于LC法靈敏度低、GC-MS法需要衍生處理，而LC-MS/MS法選擇性和抗干擾能力強、靈敏度高、定性定量準確，廣泛用于痕量有害物質的檢測，也是雙酚類物質目前主要的檢測方法。但是，現(xiàn)有研究多為對四溴雙酚A（Tetrabromobisphenol A，TBBPA）、BPA、BPF及其縮水甘油醚等衍生物的檢測，但尚未見食用油中BPS等多種雙酚類化合物同時測定方法報道。分散液液微萃?。╠ispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）是2006年Assadi等［20］提出的一種集萃取和富集于一體的前處理技術，具有操作簡單、快速、耗有機溶劑少、成本低和對環(huán)境友好等優(yōu)點，已被廣泛應用于環(huán)境、食品樣品中痕量有機污染物的分析。因此，本研究采用DLLME技術，優(yōu)化萃取劑的種類和體積及渦旋分散萃取時間等影響萃取的關鍵因素，結合同位素稀釋技術和超高效液相色譜-質譜/質譜儀（UPLC-MS/MS），優(yōu)化色譜分離條件和質譜定性定量參數(shù)，建立了食用油中BPS、BPA、BPF、TBBPA、雙酚B（Bisphenol B，BPB）、雙酚C（Bisphenol C，BPC）和雙酚AF（Bisphenol AF，BPAF）7種雙酚類化合物的檢測方法。方法簡單、快速、準確、成本低，可為食用油中雙酚類化合物的檢測及監(jiān)控提供技術參考。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜和XevoTMTQ三重四極桿串聯(lián)質譜儀（UPLC-MS/MS，美國Waters公司）；MS3 basic漩渦混合器：德國IKA公司；臺式離心機：科大中佳公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器：美國Millipore公司。

標準品：BPA、BPF和TBBPA（純度均大于99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司），BPS（純度大于99%，美國Admas公司），BPB、BPC和BPAF（純度均大于95%，日本TCI公司）；同位素內標：BPA-d14（純度大于98%，美國Sigma-Aldrich公司），BPF-d10（純度大于99%，日本東京化工公司），BPS-13C12（純度大于99%，加拿大化學研究公司），TBBPA-d10（100 mg/L，上海市化工研究院）。甲醇、乙腈、正己烷均為色譜純，美國Fisher公司；氨水為分析純，廣州化學試劑廠；去離子水（18.0 MΩ·cm），由Milli-Q制得。

1.2標準溶液配制

分別稱取適量的7種雙酚類物質標準品，用甲醇配成質量濃度均為100 mg/L的單標貯備液；分別吸取適量7種單標貯備液，用甲醇稀釋成混合標準溶液，其中BPS和BPAF的質量濃度為1.0 mg/L，其余5種化合物的質量濃度均為10.0 mg/L。

分別稱取適量的3種同位素標準品，用甲醇配成質量濃度均為50 mg/L的內標貯備液；采用逐級稀釋法，用甲醇將4種內標配成混合內標工作溶液，其中BPS-13C12的質量濃度為0.02 mg/L，其余3種同位素內標的質量濃度均為0.2 mg/L。

用甲醇配制系列濃度混合標準工作溶液，其中BPS和BPAF的濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/L，其余5種化合物的濃度分別為5.0、10.0、50.0、100、500 μg/L，BPS-13C12的濃度均為5.0 μg/L，其余3種同位素內標的濃度均為50.0 μg/L。

1.3樣品處理

稱取1.0 g食用油樣品于10 mL尖底玻璃離心管中，加入3mL正己烷分散稀釋，再加入50 μL混合內標工作溶液，渦旋混勻，然后快速注射入400 μL甲醇/乙腈（1∶1，v/v）混合溶液，渦旋分散萃取1min，2500 r/min離心5 min，用微量注射器將離心管底部的沉積相［體積約為（200±10）μL］轉移入400 μL尖底玻璃內插管中，待UPLC-MS/MS測定。

1.4UPLC-MS/MS測定條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A為甲醇，流動相B為0.05%（v/v，下同）氨水溶液；梯度洗脫程序：0.0～1.0 min，50%A；1.0 min～6.0 min，50%A～80%A；6.0 min～6.5min，80%A～100%A；6.5min～7.5min，100%；7.5 min～7.6 min，100%A～50%A，平衡2 min；流速：0.25 mL/min；柱溫30℃；進樣量5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI）電離，負離子模式掃描，多反應監(jiān)測（MRM）模式檢測；毛細管電壓1.0 kV；離子源溫度150℃；脫溶劑氣溫度400℃；脫溶劑氣流速800 L/h；錐孔氣流速50 L/h；碰撞氣為氬氣，0.2 mL/min；化合物的監(jiān)測離子對（m/z）、錐孔電壓等質譜參數(shù)見表1。

表17　種待測物及同位素內標物的質譜參數(shù)Table 1MS parameters of studied compounds

2結果與討論

2.1萃取劑種類和體積

在DLLME中，選擇合適的萃取劑和體積是獲得較高萃取富集效率的關鍵因素。萃取劑的性質影響三相平衡體系的形成，故要求萃取劑對目標物具有一定的溶解度，與樣品不互溶，密度大于被萃取體系，且色譜行為不影響目標物的分析?；谏鲜鲆螅狙芯勘容^了甲醇、乙腈、甲醇/乙腈（7∶3，v/v）、甲醇/乙腈（1∶1，v/v）、甲醇/乙腈（3∶7，v/v）5種溶劑作為萃取劑的萃取效率，如圖1所示。

圖1　不同萃取劑的萃取回收率Fig.1Extraction recoveries of 7 bisphenols in different extractants

實驗結果表明：甲醇/乙腈（1∶1，v/v）的整體萃取效率最好，原因可能為混合溶劑的極性和誘導性發(fā)生改變而協(xié)同導致，不同混合比例的結果稍有差異。因此，實驗選擇甲醇/乙腈（1∶1，v/v）作為萃取劑。

對萃取劑體積的要求為：可以獲得較高的富集倍數(shù)，以提高方法靈敏度；同時能夠滿足進樣體積的要求。實驗考察了不同萃取劑體積（300、400、500、600、700、800 μL）的情況。實驗結果表明，當萃取劑體積為300 μL時，離心得到的沉淀相過小，難以移取；萃取劑體積為400 μL～800 μL時，萃取回收率整體變化不明顯（如圖2所示）。

圖2　萃取劑體積對萃取回收率的影響Fig.2Effect of extraction volume on the extraction recoveries of 7 bisphenols

但沉淀相體積逐漸增大，約由（200±10）μL增至（450±10）μL，富集倍數(shù)則相應減少，方法的靈敏度也隨之降低，當萃取劑體積為400 μL時，方法靈敏度和進樣體積均能較好滿足需要。因此，本實驗確定萃取劑體積為400 μL。

2.2分散萃取時間

在DLLME中，常借助加入分散劑、渦旋或超聲等手段將萃取劑以微小液滴的形式分散在樣品溶液中，形成穩(wěn)定的乳濁體系，快速完成目標化合物在樣品與萃取劑之間的分配平衡。在本實驗中，由于食用油的粘度較大，在加入萃取劑前，先用正己烷稀釋，增加樣品的流動性，并選用渦旋分散的方式實現(xiàn)分散液液微萃取。

對比了正己烷用量分別為2、3、4、5mL時的萃取情況，實驗發(fā)現(xiàn)當正己烷用量為2mL時，食用油樣品的粘度仍偏大，萃取效果不理想；當正己烷用量為3 mL～5 mL時，食用油樣品的黏度逐漸降低，但萃取效果無明顯差異。所以實驗選擇正己烷用量為3 mL。

考察了渦旋分散萃取時間分別為0.5、1、2、3 min時的萃取回收率情況。結果表明，在0.5 min～1 min，萃取回收率隨著萃取時間的增加逐漸提高；在1 min～3 min，萃取回收率基本平衡。因而選擇渦旋分散萃取時間為1 min。

2.3色譜質譜條件

7種雙酚類物質及4種同位素內標物的分子結構均含有酚羥基，易在ESI源的負離子模式下獲得較高豐度的［M-H］-準分子離子峰。對確定的母離子進行二級質譜掃描，并根據(jù)歐盟2002/657/EC指令，每種待測化合物選擇2個主要特征碎片離子作為定性與定量離子；同位素內標物則選擇1個主要特征碎片離子。然后對碰撞電壓進行優(yōu)化，使特征碎片離子的強度達到最大。7種雙酚類物質和內標物的特征離子對和電離條件、碰撞條件見表1。

雙酚類物質的色譜分離常用C18色譜柱。本實驗采用BEH C18色譜柱，對比了甲醇-水、甲醇-0.05%氨水和乙腈-0.05%氨水流動相體系的分離效果。結果表明，甲醇-0.05%氨水的效果最好，原因為：流動相加入氨水促進了目標化合物的離子化效率，提高響應靈敏度，同時可以消減實際樣品檢測時產生的基質抑制效應；而甲醇的洗脫能力較乙腈弱，可以獲得更好的分離效果。因此，本實驗選擇甲醇-0.05%氨水為流動相，并優(yōu)化了2.4所述的梯度洗脫程序，使各目標化合物獲得良好的分離和靈敏度，并盡量避免與樣液中的雜質共流出，降低基質效應。7種雙酚類化合物的總離子流色譜圖如圖3所示。

圖3　7種雙酚類化合物的總離子流色譜圖Fig.3Total ion chromatograms of 7 bisphenols

2.4線性方程及檢出限

本實驗采用同位素內標進行定量，可以有效校準基質效應，提高定量的準確性。按照本實驗條件測定2.2配制的系列混合標準工作溶液，7種雙酚類化合物以其定量離子峰面積與對應內標峰面積比值為縱坐標，以相應的濃度為橫坐標進行回歸分析，線性范圍和相關系數(shù)見表2，可見，相關系數(shù)均大于0.998，表明7種雙酚類化合物在0.5 μg/L～500 μg/L范圍內線性關系良好；分別以3倍信噪比（S/N）、10倍信噪比（S/N）結合前處理濃縮倍數(shù)（5倍）和回收率情況，估算得到7種雙酚類化合物的方法檢出限（LODs）和定量限（LOQs），如表2所示，方法定量限在0.2 μg/L～3.0 μg/kg之間，表明方法具有較高的靈敏度。

表2　7種雙酚類化合物的線性范圍、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 2Linear range，LODs and LOQs of 7 BPs

2.5回收率、精密度試驗

選取陰性食用油樣品按照本實驗方法進行3個濃度水平（1×LOQ、2×LOQ和10×LOQ）的添加回收和精密度實驗（n=6）。實驗結果見表3。

表3　回收率和精密度測定結果（n=6）Table 3Recoveries and repeatability for 7 BPs（n=6）

7種待測物的平均回收率在80.1%～93.7%之間，相對標準偏差（RSD）在4.4%～9.1%之間，表明方法回收率和精密度良好。

2.6實際樣品檢測

采用本方法測定了市售的花生油、大豆油和調和油等10個食用油樣品，均未檢出7種目標化合物。

3結論

基于DLLME和同位素稀釋技術，結合UPLC-MS/ MS，建立了一種快速測定食用油中雙酚類化合物的方法。每個樣品僅需加入3 mL正己烷和400 μL甲醇-乙腈混合萃取劑，萃取時間為1 min，前處理簡單，有機溶劑消耗少，節(jié)省了濃縮的時間；萃取液經(jīng)C18色譜柱和甲醇-0.05%氨水梯度洗脫分離，質譜MRM測定，同位素內標法定量，有效消減了基質效應，方法定性定量準確；7種雙酚類化合物的方法定量限（S/N=10）為0.2 μg/kg～3.0 μg/kg，靈敏度高。所建立的檢測方法成本低、效率高，準確靈敏，精密度良好，能夠滿足不同食用油中雙酚類化合物的檢測需求。

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Rapid Determination of Seven Bisphenols in Edible Oils with Dispersive Liquid-Liquid Microextraction and Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HE Dong1，XIAN Yan-ping2，YAN Wan-ying2，GUO Xin-dong2，YE Mei3，WAN Yu-ping3
（（1.Meizhou Teachers'Academy，Jiaying University，Meizhou 514087，Guangdong，China；2.Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，Guangzhou 510110，Guangdong，China；3.Chengdu Food and Drug Inspection Institute，Chengdu，610000，Sichuan，China）

A simple and rapid method for determination of seven bisphenols in edible oils using dispersive liquid-liquid microextraction（DLLME）and ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with isotope dilution（ID-UPLC-MS/MS）was developed.In the paper，related critical factors that may influence extraction efficiency，such as the type and volume of extraction solvent and vortex-assisted dispersive extraction time，and the separation condition of UPLC，qualitative and quantitative parameters of mass spectrometry were investigated and optimized.The optimum extraction condition was：extracting agent was 400 μL mixed solution（methanol：acetonitrile=1∶1，v/v），and vortex extraction 1 min.Targets were separated with a C18 chromatographic column by gradient elution with methanol-0.05%ammonia，and determined by UPLC-MS/MS under ESI at negative and multiple reaction monitoring（MRM）mode.The results indicated that 7 bisphenols were in the range of 0.5 μg/L-500 μg/L with the correlation coefficients greater than 0.998，the method quantitation limit（LOQ，S/N=10）of the analytes were ranged from 0.2 μg/kg to 3.0 μg/kg.The average recoveries were from 80.1%to 93.7%，and the relative standard deviation（RSD，n=6）were in a range of 4.4%-9.1%when three levels of standard were spiked into edible oil sample.The method was simple，fast，saving solvent and time，accurate and senstive，which was suitable for the detection of 7 bisphenols in edible oils.

Dispersive liquid-liquid microextraction；ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；edible oils；bisphenols

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.029

2015-03-31

何東（1968—），男（漢），講師，本科，研究方向：化學分析方法。