面包中丙烯酰胺分析方法改進(jìn)研究

付苗苗

（河南工業(yè)貿(mào)易職業(yè)學(xué)院，河南鄭州450012）

面包中丙烯酰胺分析方法改進(jìn)研究

付苗苗

（河南工業(yè)貿(mào)易職業(yè)學(xué)院，河南鄭州450012）

面包經(jīng)過高溫烘烤會產(chǎn)生危害人體健康的丙烯酰胺。本文針對面包中丙烯酰胺分析方法的改進(jìn)進(jìn)行研究，建立一套簡單實(shí)用的丙烯酰胺檢測方法，希望為研究抑制食品中丙烯酰胺的產(chǎn)生提供依據(jù)，從而對于提高焙烤食品的安全性，降低消費(fèi)者健康風(fēng)險(xiǎn)，起到積極意義。

面包；丙烯酰胺；分析方法

2002年4月，瑞典國家食品管理局研究證實(shí)，淀粉類食物經(jīng)過煎炸烤等高溫烹調(diào)加工，會產(chǎn)生對人體危害人體健康的有機(jī)化合物丙烯酰胺［1］。更多的研究研究表明，丙烯酰胺可能具有生殖毒性和致畸性，還可引起遺傳物質(zhì)改變和癌癥發(fā)生，其中最重要的毒性影響就是誘發(fā)癌癥，并已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列入2A類致癌物，即人類可能致癌物［2］。自發(fā)現(xiàn)高溫食品中存在丙烯酰胺至今，丙烯酰胺的問題一直是食品安全熱點(diǎn)之一。面包是世界各國居民飲食中重要的主食，是以小麥粉為主要原料，經(jīng)過烘烤的方式加熱而成的焙烤食品，因此，面包也面臨著丙烯酰胺問題帶來的影響。然而，由于面包中成分復(fù)雜，并且產(chǎn)生的丙烯酞胺含量相對較低，因此獲得理想的丙烯酰胺檢測方法成為首要解決的問題。目前食品中丙烯酰胺的檢測方法主要采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用新技術(shù)（LC-MS/MS）。GC-MS法靈敏度（5 μg/kg～10 μg/kg）、專一性均好，但是樣品的分離、提取、凈化方法與溴化加成反應(yīng)等預(yù)處理較麻煩。LC-Ms/Ms法靈敏度較好（20 μg/kg～50 μg/kg），且無需衍生化，因此比GC-MS法省事得多，但存在裝置價(jià)格較高的缺點(diǎn)。而另一種色譜技術(shù)——離子排阻和離子交換色譜分析法，只在幾篇文獻(xiàn)中有報(bào)道［3］。在有關(guān)學(xué)者的研究分析中，離子色譜應(yīng)用202 nm紫外檢測成功檢測了食品中的丙烯酰胺［4］。因此，只要有合適的色譜分離和有效的樣品前處理，應(yīng)用紫外檢測器是能夠分析食品中的痕量小分子丙烯酰胺的。

本文對面包中丙烯酰胺分析方法的改進(jìn)進(jìn)行研究，建立一套簡單實(shí)用的丙烯酰胺檢測方法，希望為抑制面包中丙烯酰胺產(chǎn)生的研究提供基礎(chǔ)，從而對于提高焙烤食品的安全？性，降低消費(fèi)者健康風(fēng)險(xiǎn)，起到積極意義。

1材料

1.1主要試劑

丙烯酰胺（標(biāo)準(zhǔn)品）：美國Sigma公司；面包專用粉：福建省晉江福源食品有限公司；人造奶油：福建省晉江福源食品有限公司；甲醇（色譜純）：韓國SK化學(xué)公司；乙腈（色譜純）：韓國SK化學(xué)公司；正己烷（分析純）、六氰合鐵（Ⅲ）化鉀（分析純）、硫酸鋅（分析純）：北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；甲酸（色譜純）：天津康科德科技有限公司。

1.2主要儀器

868型酸度計(jì)：美國奧立龍公司；2000D型超純水器：北京長風(fēng)儀器儀表公司；VDRTEX－5型旋渦混合器：江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Waters 2695 LC：美國waters公司；TGL-16G-A高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器公司；冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；氮吹儀：上海安普科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京德天佑科技有限公司；烤箱：捷嘉食品機(jī)械設(shè)備有限公司；揉面機(jī)：萬杰食品機(jī)械有限公司；粉碎機(jī)：西貝樂有限公司。

2方法

2.1面包的制作

面包粉500 g，即發(fā)干酵母5 g，鹽5 g，糖30 g，起酥油20 g，奶粉20 g，水按面團(tuán)吸水量而定。工藝流程按一下流程操作。面粉及各種配料稱重→混合攪打→基礎(chǔ)醒發(fā)→稱重、分割→整形→成型→醒發(fā)→烘烤→冷卻→成品。結(jié)合實(shí)際加工過程，烘烤溫度為150℃～190℃，烘烤時(shí)間為15 min～20 min。

2.2樣品的準(zhǔn)備

面包從烤箱中取出冷卻1小時(shí)后，將面包皮用小刀進(jìn)行剝離。每3個(gè)面包的面包皮進(jìn)行混合，稱重，冷凍儲存。

2.3AA的測定

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

準(zhǔn)確稱取100 mg丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶于10 mL容量瓶中，用超純水溶解并稀釋至刻度，-20℃冰箱保存作為儲備溶液。分別配制濃度為50、80、100、150、200、250 ng/mL和300 ng/mL的AA標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)0.45 μm的膜過濾，用Waters液相工作站繪制丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2樣品提取及凈化

2 g粉碎樣品稱入25 mL離心管中。10 mL 75%甲醇水溶液，100 μL CarrezⅠ，100 μL CarrezⅡ，分別加入試管中。樣品經(jīng)搖床震蕩提取45 min（25℃，100 r/min），10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心（10℃，10 min）。5 mL上清夜定量轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，在45℃下氮吹至1 mL。Oasis HLB固相萃取柱用5 mL甲醇，5 mL水平衡后用于純化樣品。濃縮的提取液完全通過萃取柱，再經(jīng)2 mL10%（體積比）甲醇水溶液洗脫。收集洗脫液，經(jīng)0.45 μm針孔濾膜過濾，準(zhǔn)備用于液相分離。

2.3.3儀器條件及參數(shù)設(shè)置

HPLC條件：美國Waters2695高效液相系統(tǒng)，配有二極管陣列檢測器，進(jìn)樣量20 μL，HC-75H+柱（305mm×7.75mm，Hamilton，NV，USA），流動相10mmol/L的甲酸水溶液，流速為0.6 mL/min，柱溫50℃，紫外檢測波長200 nm。

3結(jié)果與討論

3.1丙烯酰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1　丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖Fig.1Standard curve of Acrylamide

3.2流速的確定

如圖2，通過比較不同流速發(fā)現(xiàn)，流速增加，保留時(shí)間縮短，柱壓升高，峰高有較小的改變。最終依據(jù)分離效果和合適的柱壓將流速確定為0.6 mL/min。

圖2　不同流速所得丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2The standard color spectrum of different velocity of Acrylamide

3.3柱溫的確定

如圖3，對柱溫的影響也進(jìn)行了比較，隨著柱溫的升高，保留時(shí)間縮短，但是峰高和峰面積有所下降。因此柱溫最終確定為50℃。

這樣的分離條件下，樣品的色譜分離時(shí)間是45min，丙烯酰胺的保留時(shí)間是36.8 min。

3.4樣品的處理

3.4.1提取劑的選擇

圖3　不同柱溫所得丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.3The standard color spectrum of Acrylamide under different column temperature

實(shí)驗(yàn)中分別對甲醇，水，甲醇水溶液進(jìn)行比較，以找到合適的提取溶劑。由于樣品中的淀粉溶脹的作用，需要水的量比較多，而在純化前提取液需要濃縮，尤其是當(dāng)樣品中丙烯酰胺的濃度比較的情況下更需要濃縮。由于水在溫和的條件下進(jìn)行濃縮比較困難，乙酸乙酯曾用來萃取水相中的丙烯酰胺，然后將乙酸乙酯用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干，但是回收率很低。甲醇雖然比較容易濃縮，但是甲醇的結(jié)果也不理想。將甲醇與水的比例從50%變化到90%（體積比），結(jié)果表明75%的甲醇水溶液合適，既能在氮?dú)饬饔?5℃的條件下蒸發(fā)，回收率又比較高。因此，將75%（體積比）的甲醇水溶液用作提取劑。

3.4.2蛋白質(zhì)的沉淀劑

Carrez試劑用來沉淀提取液中的蛋白質(zhì)。Carrez試劑的作用在色譜圖上比較溶液觀察到。無論丙烯酰胺的提取與蛋白質(zhì)的沉淀是一步完成，還是先提取丙烯酰胺然后再沉淀蛋白，都能從色譜圖上看出Carrez試劑純化的效果。在提取丙烯酰胺的同時(shí)沉淀蛋白質(zhì)，能簡化樣品處理程序縮短分析時(shí)間。

3.4.3SPE純化

在SPE純化步驟，對Accu BondⅡODS-C18柱（6 mL，500 mg）和Oasis HLB柱（6 mL，200 mg）進(jìn)行了比較。它們的純化效果相近，但是Oasis HLB柱的回收率較高，見圖4。

圖4　面包中丙烯酰胺的色譜圖Fig.4Chromatogram of acrylamide in bread

提取液經(jīng)過純化之后的色譜圖較干凈，在丙烯酰胺出峰的時(shí)間沒有干擾峰出現(xiàn)。

3.5方法評價(jià)

3.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度

定量分析是在50 μg/L～300 μg/L的線性范圍內(nèi)依據(jù)丙烯酰胺的濃度與峰面積之間的關(guān)系進(jìn)行的。保留時(shí)間的精密度是通過日內(nèi)和日間精密度實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的：150 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)6 d，每天進(jìn)行3次，每次重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)。相關(guān)數(shù)據(jù)總結(jié)在表1中。在整個(gè)線性范圍內(nèi)相關(guān)性很好。保留時(shí)間的日內(nèi)和日間精密度都在1%以下。

表1　分析丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品的方法評價(jià)Table 1Evaluation methods for analysis of acrylamide standard

3.5.2樣品的精密度

應(yīng)用此方法分析面包中的丙烯酰胺，并對方法進(jìn)行評價(jià)。表2中總結(jié)了日間、日內(nèi)精密度結(jié)果，RSD值在3.6%～8.5%范圍內(nèi)變化。

表2　分析面包中丙烯酰胺的日間和日內(nèi)精密度Table 2Analysis of acrylamide in bread during the day and within day precision

3.5.3靈敏度

以3倍信噪比計(jì)算，本方法的靈敏度為30 μg/kg，達(dá)到LC-MS/MS法靈敏度（20 μg/kg～50 μg/kg）。

3.5.4回收率

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，在空白基質(zhì)中添加不同水平（50 μg/kg～300 μg/kg）的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品。平均回收率在92%～105%之間變化，見表3。

表3　空白基質(zhì)中添加丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算回收率Table 3The blank matrix added standard acrylamide and recovery calculation

3.6面包中丙烯酰胺的含量

對市售的面包中丙烯酰胺含量進(jìn)行分析檢測，見表4。

表4　市售面包中丙烯酰胺含量分析（n=3）Table 4The analysis of acrylamide content in bread for sale

由表4可知，所得結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的面包中的丙烯酰胺含量相近。這些結(jié)果表明此方法能夠檢測面包中的丙烯酰胺含量。

4結(jié)論與展望

對液相色譜分析食品中丙烯酰胺的方法進(jìn)行了改進(jìn)，能夠應(yīng)用于淀粉基質(zhì)食品中。本方法相對于串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法在儀器費(fèi)用上能節(jié)省很多，能夠被多數(shù)實(shí)驗(yàn)室廣泛接受。樣品處理簡單快速，應(yīng)用75%甲醇水溶液作為提取劑，濃縮，經(jīng)SPE純化，應(yīng)用紫外檢測器檢測。與常用的反相色譜柱不同，丙烯酰胺以陽離子的形式在HC-75H+色譜柱上能較好的保留，因而能與共溶出物很好地分離。本方法可為一種低成本的分析淀粉基質(zhì)食品中丙烯酰胺含量在100 μg/kg～500 μg/kg范圍內(nèi)的可選方法提供參考。

［1］SNFA.Swedish National Food Administration.Acrylamide is formed during the preparation of food and occurs in many foodstuffs.Press release from Livsmedelsverket，Swedish National Food Administration.April 24，2002

［2］WHO.FAO/WHO Consultation on the Health Implications of AcrylamideinFood［R］.SummaryReportofameetingheldinGeneva，2002

［3］簡黎黎，劉潔，袁媛，等.HPLC-MS/MS法定量測定方便面中的丙烯酰胺［J］.食品工業(yè)科技，2009，30（12）：391-394

［4］張前龍，曹云.食品中丙烯酰胺分析方法研究進(jìn)展［J］.上海預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，22（2）：100-105

Study on Improvement of Methods for Analysis of Acrylamide in Bread

FU Miao-miao
（Henan Industrial and Traele Vocationd College，Zhengzhou 450012，Henan，China）

After the high temperature baking，bread will cause harm to human health because of acrylamide. Aiming at the improvement of the methods for analysis of acrylamide in bread were studied，to establish a set of simple and practical test methods of acrylamide，hope to provide the basis for the study on inhibition of acrylamide in food，thus to improve the safety of baking food，reduce health risks to consumers，positive significance.

bread；acrylamide；analysis method

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.025

2014-09-02

付苗苗（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：糧油加工與食品品質(zhì)。