高效液相色譜法鑒別原料乳中碳水化合物摻偽

鄭向華，楊自潔，張青燕，龔吉軍，，，*，肖蓮榮，鄧放明

（1.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局科學(xué)研究院，福建廈門361026；2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長沙410004；3.湖南亞華乳業(yè)有限公司，湖南長沙410013；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)博士后流動(dòng)站，湖南長沙410128）

高效液相色譜法鑒別原料乳中碳水化合物摻偽

鄭向華1，楊自潔2，張青燕3，龔吉軍2，3，4，*，肖蓮榮3，鄧放明4

（1.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局科學(xué)研究院，福建廈門361026；2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長沙410004；3.湖南亞華乳業(yè)有限公司，湖南長沙410013；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)博士后流動(dòng)站，湖南長沙410128）

以Hypersil氨基柱為分離柱，乙腈-水（80∶20）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，建立了用于同時(shí)鑒別原料乳中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖摻偽的高效液相色譜法。結(jié)果表明，在0.5 mg/mL～20 mg/mL的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，用于果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖摻偽鑒別的精密度分別為2.100%、1.500%、1.680%和2.975%，回收率分別為101.0%、100.0%、99.3%、99.3%，檢出限分別0.21、0.25、0.22、0.20 mg/mL。此法準(zhǔn)確可靠，可用于原料乳中此4種碳水化合物的摻偽檢測。

原料乳；碳水化合物；摻偽檢測；高效液相色譜法

原料乳中的碳水化物主要是乳糖。在原料乳生產(chǎn)過程中，為了使相對密度達(dá)到國標(biāo)要求，在其中違規(guī)添加其他碳水化合物的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。因此，建立快速且能同時(shí)鑒別原料乳中多種碳水化合物摻偽的技術(shù)手段，是現(xiàn)實(shí)的需求。

有關(guān)乳制品中碳水化合物檢測方法的研究報(bào)道很多，如比色法［1］、熒光法［2］、色譜法［3-4］等，這些方法中，化學(xué)分析方法一般只能檢測單一碳水化合物組分，而高效液相色譜法［5］具有步驟簡單、可同時(shí)測定多種組分、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于碳水化合物組分的分析。然而，高效液相色譜法目前主要用于乳制品或其他食品中正常碳水化合物成分的分析檢測［6-8］，非摻偽檢測，而將高效液相色譜法用于原料乳中碳水化合物的摻偽檢測，還未見報(bào)道。本文旨在探明高效液相色譜-示差檢測器法用于同時(shí)鑒別原料乳中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖摻偽的技術(shù)方法，以期為生產(chǎn)實(shí)踐中原料乳碳水化合物的摻偽鑒別提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑

色譜純果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖Sigma公司；色譜純乙腈Fisher公司；分析純亞鐵氰化鉀、乙酸鋅國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；原料乳、乳清粉湖南亞華乳業(yè)有限公司提供。

1.1.2主要設(shè)備

Waters 2965高效液相色譜儀（RID檢測器）：沃特世科技（上海）有限公司；AR2140電子分析天平：上海力衡儀器儀表有限公司；WH-2微型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；SB25-12DTD超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司；DKB-501A超級恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MilliPure A10純水機(jī)：美國密理博公司；TDL-80-2B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

精確稱取果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖標(biāo)準(zhǔn)品各2.000 0 g，放入同一個(gè)100 mL容量瓶中完全溶解，超聲處理10 min后，用超純水定容，配制成20 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。置于4℃冰箱中保存。

1.2.1.2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用超純水定容于10 mL容量瓶中，依次稀釋成濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2色譜條件

色譜柱：Hypersil氨基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈∶水（體積比）80∶20；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL；運(yùn)行時(shí)間：20 min。

1.2.3色譜峰保留時(shí)間的確定

準(zhǔn)確稱取果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖標(biāo)準(zhǔn)品各0.100 0 g，分別溶于4個(gè)100 mL容量瓶中，在1.2.2的色譜條件下檢測，記錄各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，并與混標(biāo)色譜圖比較，根據(jù)保留時(shí)間確定各色譜峰的成分。

1.2.4樣品的制備及前處理

1.2.4.1未加標(biāo)樣品溶液的配制及前處理

取10 mL原料乳，加適量超純水，再加入2 mL亞鐵氰化鉀（150 g/L）、2 mL乙酸鋅（300 g/L），充分反應(yīng)后，用超純水定容至100 mL，靜止片刻，分別經(jīng)濾紙和0.45 μm濾膜過濾，濾液備用。

1.2.4.2加標(biāo)樣品溶液的配制及前處理

取10 mL原料乳，按10.00 mg/mL的量加入果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖，加入少量50℃～60℃超純水使其充分溶解，置于漩渦混合儀上充分混勻，超聲處理10 min，分別加入2 mL亞鐵氰化鉀、2 mL乙酸鋅。后續(xù)處理同1.2.4.1。

1.2.4.3乳清粉溶液的配制及前處理

稱取0.100 0 g乳清粉，加入少量50℃～60℃超純水使其充分溶解，于漩渦混合儀上充分混勻，超聲處理10 min后，分別加入1 mL亞鐵氰化鉀和1 mL乙酸鋅。后續(xù)處理同1.2.4.1。

1.2.4.4摻乳清粉原料乳樣品的配制及前處理

在10 mL原料乳中，分別加入0.2、0.5 g和0.6 g乳清粉得到1、2和3號樣品，加入少量50℃～60℃超純水使其充分溶解。后續(xù)處理同1.2.4.1。

2結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇

碳水化合物分離和測定常用的色譜柱主要有兩種：一種是陽離子交換柱或凝膠柱，以水、稀酸或醋酸鈣溶液等作為流動(dòng)相［9-10］；另一種是使用化學(xué)鍵合固定相，也就是氨基色譜柱，乙腈-水被作為流動(dòng)相［11］。由于本文檢測的果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖分子量較小，且結(jié)構(gòu)簡單，而氨基柱對流動(dòng)相和柱溫要求較低，價(jià)格也低于其它柱子，因此選擇氨基柱來進(jìn)行分離檢測。

2.1.2流動(dòng)相的選擇

因檢測目標(biāo)物果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖含有極性基團(tuán)，故選用極性較大的溶劑即乙腈作為流動(dòng)相。流動(dòng)相中，乙腈與水的配比對分離效果會(huì)產(chǎn)生直接影響。本文在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)定了3種不同的乙腈與水配比，分別為80∶20、75∶25和70∶30（均為體積比），通過對比發(fā)現(xiàn)，乙腈與水的配比為80∶20時(shí)，果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖的分離效果相對較好。在此條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中4種碳水化合物的分離情況見圖1。

圖1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Fig.1The chromatogram of mixed standard solution

圖1的結(jié)果表明，該方法能夠?qū)?種碳水化合物完全分離。果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的保留時(shí)間分別為7.476、8.358、11.590 min和15.032 min。在16 min內(nèi)，可同時(shí)完成對4種摻偽碳水化合物的檢測。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

以測得的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，得到線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見表1和圖2～圖5。

表1　4種碳水化合物的檢出限和精密度Table 1The detection limit and precision of 4 carbohydrates

圖2　果糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2The standard curve of fruit

圖3　葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3The standard curve of glucose

圖4　蔗糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4The standard curve of sucrose

圖5　乳糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5The standard curve of lactose

在0.5 mg/mL～20 mg/mL的范圍內(nèi)，4種碳水化合物的線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 0～0.999 4，其相關(guān)性很好。本文的檢測范圍比李靜芳等［5］的研究有所擴(kuò)大，但所得回歸方程的線性相關(guān)性并未降低。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均在3%以內(nèi)，說明本文所建方法的精密度高；以3倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限，4種碳水化合物的檢出限在0.25 mg/mL以內(nèi)。

2.3回收率試驗(yàn)

回收率試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　回收試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of recovery test

表2的結(jié)果表明，原料乳樣品中乳糖含量為4.56 mg/mL，即為加標(biāo)回收率試驗(yàn)時(shí)乳糖的本底值。果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的回收率分別為101.0%、100.0%、99.3%和99.3%，結(jié)果非常理想，說明本文所建方法用于原料乳中碳水化合物摻偽鑒別是可靠的。

2.4乳清粉摻偽原料乳的檢測

正常牛生乳的乳糖含量一般為4.4%～5.2%，為了使乳糖含量偏低的原料乳符合乳糖含量要求，摻入乳清粉是比較常見的方式。為了能獲得用于生產(chǎn)實(shí)踐的乳清粉摻偽檢測方法，在采用標(biāo)準(zhǔn)品試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本文將所建方法在乳清粉摻偽檢測上作進(jìn)一步驗(yàn)證。乳清粉和乳清粉摻偽原料乳檢測色譜圖見圖6和圖7，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由圖6可見，所采用的乳清粉中只有1種碳水化合物，即乳糖，且乳清粉中的其他成分對乳糖檢測結(jié)果沒有影響。說明本文建立的高效液相色譜法適用于乳清粉中乳糖的檢測。

由圖7可見，原料乳中以乳清粉形式摻入乳糖后，樣品中乳糖的分離檢測色譜圖中沒有出現(xiàn)干擾峰，說明本文建立的方法適用于以乳清粉形式的乳糖摻偽檢測。

圖6　乳清粉檢測色譜圖Fig.6Chromatogram of whey powder

圖7　乳清粉摻偽樣品檢測色譜圖Fig.7Chromatogram of raw milk adulterated with whey powder

表3　乳清粉及乳糖摻偽原料乳樣品測定結(jié)果Table 3Results of whey powder and raw milk adulterated with whey powder

由表3的結(jié)果可以看出，本文所用乳清粉中乳糖含量為72.92%，樣品1～3中乳糖含量明顯高出正常原料乳中乳糖含量，可以判定該原料乳樣品存在乳糖摻偽。同時(shí)，本文所建方法用于原料乳中乳清粉摻偽檢測的誤差很小，說明該方法可靠。

3結(jié)論

以氨基柱為分離柱，乙腈-水（80∶20）為流動(dòng)相，建立了高效液相色譜-示差檢測法用于原料乳中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的摻偽鑒別。該法可對上述4種碳水化合物同時(shí)進(jìn)行定量摻偽檢測，其前處理簡單，分離時(shí)間短（在16 min內(nèi)完成）。在0.5mg/mL～20 mg/mL范圍內(nèi)，4種碳水化合物的線性關(guān)系好，檢出限低，回收率高，誤差小，說明本文所建方法可靠。

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Identify the Carbohydrate Adulteration in Raw Milk by High Performance Liquid Chromatography

ZHENG Xiang-hua1，YANG Zi-jie2，ZHANG Qing-yan3，GONG Ji-jun2，3，4，*，XIAO Lian-rong3，DENG Fang-ming4
（1.Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen 361026，F(xiàn)ujian，China；2.College of Food Science and Engineering，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，Hunan，China；3.Hunan AWA Dairy Co.，Ltd.，Changsha 410013，Hunan，China；4.Post-doctoral Mobile Station of Biology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China）

Taken Hypersil amino column as the separation column，CH3CN/H2O（80∶20，v/v）as the mobile phase，and the flow rate kept at 1.0 mL/min，a method of high performance liquid chromatography monitored by refractive index dectetor was established for the adulteration detection of fructose，glucose，sucrose，and lactose in raw milk.The linear relationship of these four regression equations obtained in this study was very good in a range of 0.5 mg/mL-20 mg/mL；the relative standard deviation was 2.100%，1.500%，1.680%，and 2.975%，respectively；the average recovery rate was 101.0%，100.0%，99.3%，and 99.3%，respectively；the detection limit was 0.21，0.25，0.22，and 0.20 mg/mL，respectively.It might be concluded that this method wasan accurate and raliable one for the adulteration detection of four carbohydratesabove-mentioned in raw milk.

raw milk；carbohydrates；adulteration detection；high performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.020

2014-10-16

國家十二五科技支撐計(jì)劃課題“原料奶質(zhì)量安全監(jiān)控關(guān)鍵技術(shù)研究”（2012BAD12B04）；國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目“原料乳碳水化合物摻偽鑒別技術(shù)研究”（2013IK186）；湖南省高?？萍汲晒a(chǎn)業(yè)化培育項(xiàng)目（12CY009）；中南林業(yè)科技大學(xué)“十二五”專業(yè)綜合改革試點(diǎn)項(xiàng)目（2013-6）

鄭向華（1976—），女（漢），高級工程師，碩士，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

龔吉軍（1972—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品質(zhì)量與安全，天然食品保鮮劑開發(fā)與利用。