胡椒堿分離純化工藝的研究

蒲立檸，柳　中，陳光靜，王莉莎，闞建全，*（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715；2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

胡椒堿分離純化工藝的研究

蒲立檸1，2，柳中1，2，陳光靜1，2，王莉莎1，2，闞建全1，2，*
（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715；2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

以胡椒堿粗提物為研究對象，通過靜態(tài)和動態(tài)實(shí)驗(yàn)，對適合分離純化胡椒堿的大孔樹脂進(jìn)行篩選，確定大孔樹脂分離胡椒堿的最佳工藝條件。將分離純化的胡椒堿濃縮液進(jìn)行重結(jié)晶，得到胡椒堿單體，確定最佳重結(jié)晶條件。結(jié)果表明：HPD-800大孔樹脂分離純化胡椒堿效果最好，動態(tài)實(shí)驗(yàn)最佳工藝參數(shù)為上樣液濃度1.6mg/mL，pH自然，上樣量30mL，上樣流速80mL/h，洗脫液甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，pH3，體積50mL，在此條件下得到胡椒堿旋干物的純度為82%。最佳重結(jié)晶條件為：胡椒堿濃度200mg/mL、自然pH、0℃下重結(jié)晶24h。該條件下得到的胡椒堿單體純度≥96%，再次結(jié)晶后其純度可達(dá)99%。

胡椒堿，分離純化，大孔樹脂，HPD-800，重結(jié)晶

胡椒（Piper nigrum）又名白川、浮椒，是胡椒科的一種開花藤本植物。胡椒分為白胡椒和黑胡椒，是傳統(tǒng)的香料作物，常用于食品調(diào)味和防腐。胡椒堿是胡椒主要的辛辣成分，也是胡椒主要的化學(xué)活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗抑郁、促進(jìn)藥物代謝等作用［1-8］。胡椒堿具有的功能作用使其在食品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景［9］。因此對胡椒堿的提取、分離、純化、利用以及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)都具有非常重要的意義。

胡椒堿的提取方法有酸水提取法、有機(jī)溶劑萃取法、超聲萃取法以及超臨界萃取法等［10-13］，但這些方法的胡椒堿提取液中常含有油脂、色素等雜質(zhì)，因此還需進(jìn)一步的分離純化得到高純度的胡椒堿。大孔樹脂是一類有機(jī)高分子聚合物吸附材料，被廣泛應(yīng)用于分離純化活性成分［14-16］。研究表明超聲萃取法提取胡椒堿，簡單易操作且提取效果較好，本文擬采用前期已進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的超聲萃取法萃取胡椒堿，并采用大孔樹脂層析柱法和重結(jié)晶法對胡椒堿進(jìn)行分離純化［17-18］，制備高純度的胡椒堿，確定最佳分離純化工藝，以期為胡椒堿的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

胡椒購于海南糖酒集團(tuán)，將胡椒顆粒放入恒溫鼓風(fēng)干燥箱中于45℃下烘干，粉碎，60目過篩，收集胡椒粉備用；胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品天津一方科技有限公司；大孔樹脂D101（非極性，比表面積500～550m2/g）、D155（弱酸性，全交換容量11.2mmol/g）、HPD-800（非極性，比表面積700～750m2/g）、AB-8（弱極性，比表面積480～520m2/g） 滄州寶恩化工有限公司；其他試劑均為分析純，為實(shí)驗(yàn)室常用試劑。

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市富華儀器有限公司；KQ3200DB數(shù)控超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；BT-200B數(shù)顯恒流泵上海瀘西分析儀器有限公司；BSZ-100自動部分收集器上海瀘西分析儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀日本島津公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1胡椒堿粗提物的制備按武桂芝等［19］的方法稍作修改：準(zhǔn)確稱取一定量的胡椒粉，裝入平底燒瓶，加入95%的乙醇（料液比1∶4），浸泡2h后，在70℃、功率100%的條件下超聲萃取80min，萃取兩次，萃取結(jié)束后抽慮并收集萃取液，將萃取液濃縮至一定濃度后真空干燥，制成胡椒堿粗提物，備用，并測定粗提物中胡椒堿的含量。用適量95%乙醇溶解胡椒堿粗提物得到不同濃度的胡椒堿溶液待用。

1.2.2大孔樹脂的預(yù)處理用95%乙醇浸泡處理24h后，先抽濾，然后用95%乙醇淋洗至220nm波長處無吸收峰，再用蒸餾水洗盡乙醇。接著用5倍體積的5%HCl溶液浸泡5h后，用蒸餾水洗至pH為7，再用5倍體積的5%NaOH浸泡5h后，用蒸餾水洗至中性，備用［20］。

1.2.3大孔樹脂種類的篩選以吸附率、解析率、回收率為指標(biāo)［21］，比較D101、D155、HPD-800、AB-8四種大孔樹脂對胡椒堿的分離純化效果。向100mL錫箔紙包裹的具塞三角瓶中分別加入預(yù)處理好的大孔樹脂3g和濃度為A1的胡椒堿溶液20mL，密封避光并振蕩（振蕩速率為150r/min）吸附12h后取出過濾，測定濾液中胡椒堿濃度A2。再將過濾后的大孔樹脂重新置于100mL具塞三角瓶中，加入pH為3.0的50%甲醇溶液20mL，相同條件下振蕩12h后取出過濾，測定濾液中胡椒堿濃度A3，按式（1）、式（2）、式（3）計(jì)算吸附率、解析率和回收率。

式中：A1為初始液中胡椒堿的質(zhì)量濃度（mg/mL）；A2為吸附液中胡椒堿的質(zhì)量濃度（mg/mL）；A3為解析液中胡椒堿的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V1為初始胡椒堿溶液體積（mL）；V2為甲醇溶液體積（mL）。

1.2.4大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸條件研究按1.2.3節(jié)進(jìn)行靜態(tài)吸附-解析：向100mL錫箔紙包裹的具塞三角瓶中分別加入預(yù)處理好的大孔樹脂3g和不同濃度的胡椒堿溶液20mL，以吸附率為指標(biāo)，固定50%甲醇溶液為洗脫液、洗脫液pH3.0、洗脫液體積20mL等因素，分別考察胡椒堿溶液濃度、胡椒堿溶液pH對HPD-800大孔樹脂吸附性能的影響，確定最佳吸附條件。固定胡椒堿溶液濃度1.6mg/mL、pH自然、洗脫液體積20mL等因素，以不同pH的50%甲醇溶液進(jìn)行洗脫，以解析率［22］為指標(biāo)，確定甲醇溶液最佳解析pH。

1.2.5大孔樹脂動態(tài)吸附-解吸條件研究通過靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)確定了大孔樹脂純化胡椒堿的最佳上樣液濃度為1.6mg/mL、上樣液pH自然和甲醇洗脫液的pH為3，在此基礎(chǔ)上，設(shè)定上樣量30mL、上樣流速為80mL/h、甲醇洗脫液體積分?jǐn)?shù)50%、洗脫液體積為50mL，以吸附率為指標(biāo)［23］，固定上述因素，研究上樣流速對HPD-800大孔樹脂吸附效果的影響，以解析率為指標(biāo)，研究洗脫液體積對大孔樹脂解析效果的影響。在層析柱（1.6cm×20cm）中裝滿預(yù)處理好的HPD-800大孔樹脂（有效柱高16cm），濕法上柱［24］，將30mL一定濃度的胡椒堿溶液以一定流速流經(jīng)層析柱，用自動部分收集器以每5mL收集過柱液，測定過柱液中胡椒堿含量，計(jì)算吸附率。然后用pH為3.0的50%甲醇洗脫，用自動部分收集器以每5mL收集洗脫液，測定洗脫液中胡椒堿含量，計(jì)算解析率。

1.2.6重結(jié)晶法制備胡椒堿單體將經(jīng)過大孔樹脂純化的胡椒堿溶液濃縮至一定濃度（141.367mg/mL），取不同濃度的胡椒堿濃縮液100mL于250mL的三角瓶中，以甲醇/水為溶劑，采用均相結(jié)晶得到胡椒堿晶體，抽濾烘干，并觀察晶體的形態(tài)、大小、顏色，按式（4）計(jì)算胡椒堿提取率。設(shè)定胡椒堿濃度141.367mg/mL、pH自然、溫度0℃、時間24h，固定其他因素，以晶體產(chǎn)量和胡椒堿結(jié)晶率為指標(biāo)，分別研究胡椒堿濃度、pH、結(jié)晶溫度、結(jié)晶時間對胡椒堿結(jié)晶的影響［25］。

式中：M2為胡椒堿晶體質(zhì)量（mg）；C結(jié)晶液中胡椒堿的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為結(jié)晶液體積（mL）。

1.2.7分析方法采用高效液相色譜法（HPLC）測定胡椒堿含量［26］。

1.2.8數(shù)據(jù)處理方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，采用Origin 8作圖，統(tǒng)計(jì)軟件DPS 9.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖1　HPLC測定胡椒堿含量標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1　The standard chromatogram of HPLC determination of pepper alkali content

2　結(jié)果與分析

2.1胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

HPLC測定胡椒堿含量的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1，HPLC測定胡椒堿含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.00004x-2.1061（R2=0.9995），在0.20～1.00mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2分離胡椒堿的最適大孔樹脂的篩選結(jié)果

圖2　不同樹脂對胡椒堿作用效果的影響Fig.2　The effect of different types of resin on the piperine

從圖2可以看出，4種大孔樹脂按其吸附率的大小排列為AB-8＞HPD-800＞D101＞D155，解析率的大小排列為HPD-800＞D101＞AB-8＞D155，回收率的大小排列為HPD-800＞AB-8＞D101＞D155，盡管AB-8的吸附率為48.59%，稍大于HPD-800的吸附率47.47%，但其解析率和回收率均明顯小于HPD-800。故綜合考慮，選用HPD-800作為分離純化胡椒堿的樹脂。

圖3　胡椒堿濃度對樹脂吸附的影響Fig.3　The effect of concentration of piperine on adsorption of the resin

2.3大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸工藝實(shí)驗(yàn)

2.3.1胡椒堿濃度對HPD-800大孔樹脂吸附的影響由圖3可知，隨著胡椒堿濃度的增大，大孔樹脂的吸附率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)胡椒堿濃度為1.6mg/mL時，大孔樹脂對胡椒堿的吸附率達(dá)到最大，此時吸附率為47.2%。當(dāng)胡椒堿濃度大于1.6mg/mL時，隨著胡椒堿濃度的增大，吸附率呈下降趨勢，由此可見1.6mg/mL是該大孔樹脂靜態(tài)吸附的飽和質(zhì)量濃度。

圖4　胡椒堿溶液pH對樹脂吸附的影響Fig.4　The effect of the pH of piperine on adsorption of the resin

2.3.2胡椒堿溶液pH對HPD-800大孔樹脂吸附的影響由圖4可以看出，隨著pH的增加，大孔樹脂的吸附率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)胡椒堿溶液pH不做改變時，即自然pH為5.91時，大孔樹脂對胡椒堿的吸附率達(dá)到最大，為48.92%。當(dāng)pH大于其自然pH后，隨著pH的增大，吸附率呈下降趨勢，可能是由于pH增大以后，溶液中形成了一些不利于吸附的鹽類物質(zhì)，影響了大孔樹脂的吸附效果。

圖5　甲醇洗脫液pH對洗脫效果的影響Fig.5　The effect of different eluent pH on the elution

2.3.3甲醇溶液pH對HPD-800大孔樹脂解析效果的影響由圖5可以看出，隨著甲醇洗脫溶液pH的增大，大孔樹脂的解析率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)pH為3時，其解析率達(dá)到最大，為92.32%。當(dāng)pH大于3以后，隨著pH的增大，解析率呈下降趨勢。這可能是由于胡椒堿在不同pH的甲醇洗脫液中的溶解度不同。

圖6　上柱液流速對樹脂吸附的影響Fig.6　The effect of the column flow rate on adsorption of the resin

2.4大孔樹脂動態(tài)吸附-解吸工藝實(shí)驗(yàn)

2.4.1上柱液流速對HPD-800大孔樹脂吸附的影響從圖6可以看出，隨著上柱液流速的增大，吸附率降低。上柱流速為40mL/h時，其吸附率高于其他3個流速的吸附率，結(jié)果表明上柱液流速越慢，大孔樹脂的吸附效果越好，可能是因?yàn)闃渲奈叫枰佑|和擴(kuò)散的過程，若流速太快，樹脂還未充分吸收，上柱液就流出層析柱了。由圖6可知，流速為80mL/h時，其吸附率略低于40mL/h，但卻明顯高于其他2個流速的吸附率（p＜0.05），綜合考慮，采用80mL/h流速過柱。

圖7　洗脫液體積對樹脂解析效果的影響Fig.7　The effect of eluent volume on the analytical resin

2.4.2洗脫液體積對HPD-800大孔樹脂解析效果的影響由圖7可以看出，胡椒堿主要存在于10～50mL洗脫液中。當(dāng)洗脫液體積大于50mL時，胡椒堿已基本洗脫完全，故洗脫液中胡椒堿含量很低。因此，收集10～50mL洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)掉有機(jī)溶劑，測得旋干物中胡椒堿的純度由粗提物的44%上升到82%。

表1　不同胡椒堿濃度對結(jié)晶的影響Table 1　The effect of different concentration of piperine on the crystallization

2.5重結(jié)晶法純化胡椒堿實(shí)驗(yàn)

2.5.1胡椒堿濃度的確定由表1可知，胡椒堿濃度只有在130～200mg/mL時才能結(jié)晶并得到晶體，且隨著胡椒堿濃度的增大，胡椒堿晶體產(chǎn)量和結(jié)晶率均呈上升趨勢，當(dāng)胡椒堿濃度在230mg/mL時，無晶體析出，且有胡椒油樹脂沉淀凝結(jié)。所以綜合考慮，胡椒堿濃度在200mg/mL左右較適宜。

表2　不同結(jié)晶溫度對結(jié)晶的影響Table 2　The effect of different crystallization temperature on the crystallization

2.5.2重結(jié)晶溫度的確定由表2可知，胡椒堿在不同結(jié)晶溫度下會產(chǎn)生三種明顯的晶體形態(tài)，而這三種晶體形態(tài)中以棱狀晶體最好，其晶體形態(tài)呈短、粗、大，所以結(jié)晶溫度以0℃最佳。

表3　不同結(jié)晶時間對結(jié)晶的影響Table 3　The effect of different crystallization time on the crystallization

2.5.3重結(jié)晶時間的確定由表3可以看出，結(jié)晶時間越長對結(jié)晶越有利，但結(jié)晶時間越長，胡椒堿晶體產(chǎn)量和結(jié)晶率的增加量逐漸變緩，且結(jié)晶時間的延長也會增加工業(yè)生產(chǎn)的成本，所以結(jié)晶時間在24h左右最好。

表4　不同pH對結(jié)晶的影響Table 4　The effect of different pH on the crystallization

2.5.4重結(jié)晶pH的確定由表4可知，當(dāng)胡椒堿溶液pH增大或減小時，胡椒堿晶體產(chǎn)量和結(jié)晶率均降低，當(dāng)其pH不做改變時，胡椒堿的結(jié)晶率最高，所以結(jié)晶時胡椒堿溶液的pH保持自然。

在結(jié)晶過程中，采用不同結(jié)晶條件時其晶體形態(tài)略有不同，分別有針狀、棱狀和顆粒狀三種，其晶體大小也有差異。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，純化胡椒堿的最佳結(jié)晶條件為結(jié)晶時間24h，結(jié)晶溫度0℃，pH自然，胡椒堿濃度200mg/mL，該條件下得到的胡椒堿晶體為白色棱狀，此時胡椒堿純度≥96%，該晶體經(jīng)第二次重結(jié)晶其純度可達(dá)99%。另外，在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，若結(jié)晶溫度采用先在5℃下結(jié)晶24h，再在0℃下結(jié)晶24h，則胡椒堿結(jié)晶體會有相互凝結(jié)現(xiàn)象，更加有利于晶體的分離，且結(jié)晶率比單一溫度下有所增加，可達(dá)32.12%。

3　結(jié)論

3.1通過靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)表明，HPD-800型大孔樹脂效果最好，通過動態(tài)吸附-解析實(shí)驗(yàn)得到HPD-800型大孔樹脂分離胡椒堿的最佳工藝條件為：上柱液濃度1.6mg/mL，上柱液pH自然，上柱液體積30mL，上柱液流速80mL/h，50%甲醇洗脫液pH為3，洗脫液體積50mL，解析液的最終旋干物中胡椒堿純度為82%。

3.2重結(jié)晶法純化胡椒堿時，其最佳結(jié)晶條件為結(jié)晶時間24h，結(jié)晶溫度0℃，自然pH，胡椒堿濃度200mg/mL，此條件下，得到的胡椒堿晶體為白色棱狀，胡椒堿純度≥96%，該晶體經(jīng)第二次重結(jié)晶可得到純度高達(dá)99%的白色棱狀胡椒堿單體。通過變溫結(jié)晶，胡椒堿結(jié)晶率可達(dá)32.12%。

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Separation and purification process of piperine

PU Li-ning1，2，LIU Zhong1，2，CHEN Guang-jing1，2，WANG Li-sha1，2，KAN Jian-quan1，2，*
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage，Chongqing 400715，China）

Based on static and dynamic adsorption performance，HPD-800 type macroporous resin was selected as a more appropriate carrier to separate and purify piperine from crude extract of piperine by ultrasonic. Then，recrystallize the concentrated piperine solution.The optimal process parameters for dynamic adsorption and desorption were determined as follows：30mL of 1.6mg/mL samples at natural pH and 80mL/h of loading flow rate，followed by desorption with 50mL 50%methanol at pH3.0.Under this condition，the purity of piperine was 82%.The purity of piperine could reach 96%at the optimal process parameters for recrystallization：piperine concentration was 200mg/mL，natural pH，0℃recrystallize for 24h.Recrystallize again，the purity could up to 99%.

piperine；separation and purification；macroporous resin；HPD-800；recrystallize

TS201.1

B

1002-0306（2015）02-0304-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.057

2014－05－23

蒲立檸（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)。

闞建全（1965-），男，教授，研究方向：食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)、食品生物技術(shù)、食品質(zhì)量與安全。