響應(yīng)面法優(yōu)化丁香葉總酚酸提取工藝

吳　燕，盛尊來(lái)，高凌飛，陳儉清，李艷華（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

響應(yīng)面法優(yōu)化丁香葉總酚酸提取工藝

吳燕，盛尊來(lái)，高凌飛，陳儉清，李艷華*
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

采用響應(yīng)面法對(duì)丁香葉總酚酸的乙醇提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以總酚酸提取率為考察指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和液料比等提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，乙醇回流提取總酚酸的最佳工藝條件為：乙醇濃度44%、提取溫度90℃、提取時(shí)間96min、液料比25.2∶1（mL/g）、提取次數(shù)為2次，在此條件下提取率為（1.642±0.23）mg/g。響應(yīng)面優(yōu)化得到的提取工藝穩(wěn)定合理，準(zhǔn)確可靠，是提取丁香葉總酚酸的可行方法。

丁香葉，總酚酸，響應(yīng)面，提取工藝

紫丁香葉為木樨科（Oleaceae）丁香屬（Syringa）丁香的干燥葉，味苦、性寒，其所含主要化學(xué)成分有有機(jī)酸類(lèi)、苷類(lèi)、揮發(fā)油等成分［1］。其中，總酚酸類(lèi)化合物所具有的保健功能主要表現(xiàn)在清除體內(nèi)自由基、舒張血管、抗癌、抗病毒、抗菌消炎、抗過(guò)敏等方面［2］。其較強(qiáng)抗氧化活性與其所含的酚酸類(lèi)成分有關(guān)［3-4］，丁香葉中的水溶性酚酸類(lèi)成分（丹酚酸、迷迭香酸、原兒茶酸、咖啡酸、丹參素等）具有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化和清除自由基作用［5-6］。

目前，總酚酸類(lèi)化合物具有抗氧化和清除自由基的活性受到了廣泛的關(guān)注，但國(guó)內(nèi)對(duì)丁香葉中有效成分的提取研究主要集中在黃酮類(lèi)化合物［7］、總皂苷［8］、丁香酚［9］等方面，對(duì)丁香葉中酚酸類(lèi)成分提取工藝研究較少。為了使丁香葉更廣泛的應(yīng)用于食品添加劑和功能性食品開(kāi)發(fā)領(lǐng)域中，本研究采用響應(yīng)面（response surface methodology，RSM）分析法對(duì)丁香葉總酚酸的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)丁香葉總酚酸提取物的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，旨為丁香葉的綜合開(kāi)發(fā)利用提供一定理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

丁香葉采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，采收期為2013年9月；原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)（批號(hào)：20120325，純度≥98%）；乙醇、鉬酸鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純?cè)噭?/p>

UV-8000A紫外分光光度計(jì)上海市元析儀器有限公司；DH6000A電熱恒溫水浴鍋天津市泰斯特儀器有限公司；DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海恒科學(xué)儀器有限公司；BT224S分析天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1丁香葉總酚酸提取精密稱(chēng)量丁香葉粗粉5.00g，置250mL圓底燒瓶中，乙醇回流法在不同的提取條件下提取，提取液抽濾后，用蒸餾水定容至500mL，并精密吸取50mL，加入1mol/L的鹽酸溶液10mL，加蒸餾水定容至100mL，備用［10］。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備采用紫外分光光度計(jì)法，以原兒茶酸為考察指標(biāo)測(cè)定總酚酸含量［11］。精密稱(chēng)取原兒茶酸對(duì)照品（原兒茶酸對(duì)照品，在105℃干燥至恒重）12.8mg，加乙醇5mL使溶解，加鹽酸液（1mol/L）5mL，用蒸餾水定容至50mL，得濃度為0.0256mg/mL的原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)液，分別精密吸取原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4mL于25mL棕色容量瓶中，精密加入鹽酸溶液（6mol/L）0.4mL，亞硝酸鈉-鉬酸鈉溶液（亞硝酸鈉10g，鉬酸鈉15g，加水溶解使成100mL）1mL，搖勻，放置5min，加氫氧化鈉液（1mol/L）5mL，搖勻，分別加水稀釋至刻度，搖勻；另取相應(yīng)含量的標(biāo)準(zhǔn)液，除不加亞硝酸鈉-鉬酸鈉溶液外，分別用同一方法處理后，作為空白，于503nm處測(cè)定吸光度值。以原兒茶酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程y=64.886x-0.0106（r2=0.9999）。總酚酸以原兒茶酸計(jì)在0.02048～0.01229mg/mL線(xiàn)性關(guān)系良好。

1.2.3丁香葉總酚酸提取單因素實(shí)驗(yàn)分別考察乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、液料比和提取次數(shù)5個(gè)因素對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響，以丁香葉總酚酸提取率為考察指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)和分析，以確定最佳參數(shù)。精密吸取供試品溶液1mL，按1.2.2項(xiàng)下方法操作并測(cè)定吸光度，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。按以下公式計(jì)算提取率：式中：c為稀釋的提取液中丁香葉總酚酸的濃度，單位為mg/mL；25為吸取丁香葉總酚酸提取物最終定容至25mL；1000為稀釋倍數(shù)；m為丁香葉粉質(zhì)量，單位為g。

因此，理想的社區(qū)治理格局是在基層社區(qū)黨組織的領(lǐng)導(dǎo)下，基層政府及派出機(jī)構(gòu)和社區(qū)自治組織以社區(qū)為載體，搭建基層公共事務(wù)運(yùn)行平臺(tái)、社會(huì)組織運(yùn)作平臺(tái)以及居民參與社會(huì)事務(wù)的運(yùn)轉(zhuǎn)平臺(tái)[8]。這是結(jié)果導(dǎo)向的理想式社區(qū)治理模式架構(gòu)，但這一架構(gòu)僅是社區(qū)治理的運(yùn)行結(jié)果狀態(tài)，并不是路徑選擇。要達(dá)到這種理想化的運(yùn)行結(jié)果，對(duì)現(xiàn)實(shí)的改造和重塑是不可或缺的環(huán)節(jié)。

1.2.3.1乙醇濃度對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響當(dāng)提取溫度80℃、時(shí)間1h、液料比20∶1（mL/g）、提取次數(shù)為1次時(shí)，考察0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響。

1.2.3.2提取溫度對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響當(dāng)乙醇濃度40%、時(shí)間1h、液料比20∶1、提取次數(shù)為1次時(shí)，考察50、60、70、80、90、100℃的溫度對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響。

1.2.3.3提取時(shí)間對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響當(dāng)乙醇濃度40%、溫度90℃、液料比20∶1、提取次數(shù)為1次時(shí)，考察40、60、80、100、120min對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響。

1.2.3.4液料比對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響當(dāng)乙醇濃度40%、提取時(shí)間100min、溫度90℃、提取次數(shù)為1次時(shí)，考察15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、40∶1（mL/g）的液料比對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響。

1.2.3.5提取次數(shù)對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響當(dāng)乙醇濃度40%、提取時(shí)間100min、溫度90℃，液料比25∶1時(shí)，考察提取次數(shù)1、2、3、4次對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響。

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化工藝條件當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，總酚酸提取率基本就不再改變，因此在本研究中確定提取次數(shù)為兩次前提下，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0.6，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、液料比（D）為自變量，丁香葉總酚酸提取率（Y）為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　丁香葉總酚酸提取響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表Table 1　Variables and levels in response surface design

1.2.5數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Origin7.5軟件繪制趨勢(shì)曲線(xiàn)圖；響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行方差分析，并優(yōu)化出最佳提取工藝。

2　結(jié)果與分析

2.1.1乙醇濃度對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響從圖1可看出，隨乙醇濃度的升高，總酚酸提取率呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度為40%時(shí)提取率值最高。說(shuō)明40%的乙醇溶液有利于總酚酸類(lèi)物質(zhì)的溶出，而當(dāng)乙醇濃度升高時(shí)，提取率降低，這是由于一些脂溶性成分、醇溶性雜質(zhì)降低了組織的通透性，從而使總酚酸的提取率下降［12］。因此40%乙醇為優(yōu)化的中心點(diǎn)。

2.1.2提取溫度對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響從圖2可看出，隨著溫度升高，總酚酸提取率逐漸升高，這是由于溫度升高有助于傳質(zhì)過(guò)程，使分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)激烈，加快溶質(zhì)的擴(kuò)散和溶劑的滲透，有利于總酚酸類(lèi)物質(zhì)的溶出，在90℃時(shí)提取率最高，100℃時(shí)略有下降，這是由于溫度過(guò)高，總酚酸中可能有一些成分結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而被破壞，活性降低［13］，鑒于總酚酸的熱穩(wěn)定性，將90℃定為優(yōu)化的中心點(diǎn)。

圖2　提取溫度對(duì)總酚酸提取率的影響Fig.2　Effect of extraction temperature on total phenolic acids extraction rate

2.1.3提取時(shí)間對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響從圖3可看出，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，總酚酸提取率迅速升高后，60～80min內(nèi)總酚酸含量趨于平穩(wěn)后再升高，這段時(shí)間總酚酸的溶出達(dá)到飽和，溶出速率趨于平衡。當(dāng)提取時(shí)間為100min時(shí)，提取率達(dá)到最高，隨著提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，提取率開(kāi)始下降。這可能是由于總酚酸類(lèi)物質(zhì)溶出的時(shí)間不一致，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，有些酚酸發(fā)生縮合、降解、氧化等化學(xué)反應(yīng)，從而使總酚酸含量下降［14］。因此100min為優(yōu)化的中心點(diǎn)。

圖3　提取時(shí)間對(duì)總酚酸提取率的影響Fig.3　Effect of extraction time on total phenolic acids extraction rate

2.1.4液料比對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響從圖4可看出，隨液料比增加，總酚酸取率呈先升后降趨勢(shì)，當(dāng)液料比為25∶1時(shí)達(dá)峰值。溶劑量的增加使物料與溶劑接觸面積、溶液傳質(zhì)推動(dòng)力均增大，濃度梯度變大，有利于總酚酸的溶出，從而使其溶出速度和提取率變大，當(dāng)液料比一定時(shí)，提取率最高，隨著液料比的繼續(xù)增加，溶劑體積增加使得物料吸附溶劑的量也逐漸變大，從而導(dǎo)致總酚酸被物料吸附而不易溶出［15］。因此25∶1為優(yōu)化的中心點(diǎn)。

2.1.5提取次數(shù)對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響從圖5可看出，當(dāng)提取次數(shù)大于2次時(shí)，總酚酸提取率沒(méi)有發(fā)生明顯的改變，且提取次數(shù)越多，提取液的體積越大，將給后續(xù)的濃縮帶來(lái)影響，并造成大量的動(dòng)力損耗，因此提取次數(shù)為2次時(shí)為該工藝的最佳提取次數(shù)。

圖4　液料比對(duì)總酚酸提取率的影響Fig.4　Effect of liquid/material ratio on total phenolic acids extraction rate

圖5　提取次數(shù)比對(duì)總酚酸提取率的影響Fig.5　Effect of extraction times on total phenolic acids extraction rate

2.2丁香葉總酚酸提取工藝優(yōu)化

2.2.1數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗(yàn)基于單因素實(shí)驗(yàn)，采用響應(yīng)面法對(duì)丁香葉總酚酸的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以乙醇濃度（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、液料比（D）為自變量，丁香葉總酚酸提取率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，得出丁香葉總酚酸提取率的四因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（見(jiàn)表2）。

采用Design expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件，以丁香葉總酚酸提取率為響應(yīng)值，對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，各影響因子對(duì)響應(yīng)值的影響可得出下列函數(shù)關(guān)系：

對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，得方差分析表（表3）由表3可知，方程總模型和方程的二次項(xiàng)p=0.0172，表明該模型顯著；回歸失擬項(xiàng)p＞0.05，表明未知因素對(duì)該實(shí)驗(yàn)的影響較少?？偰Ｐ秃头匠痰亩雾?xiàng)對(duì)丁香葉總酚酸提取率的影響是顯著性較好。方程的一次項(xiàng)因素C是顯著的，A、B、D的p＞0.05，表明其對(duì)總黃酮提取率的影響不顯著，可忽略［16-18］。各因素的F值可以反映出其對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的重要性，F(xiàn)值越大，表明對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大，即重要性越大。各因素對(duì)丁香葉提取率的影響排序?yàn)椋禾崛r(shí)間＞乙醇濃度＞液料比＞提取溫度。

表2　丁香葉總酚酸提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Process variables and levels in response surface Design arrangement and experimental response values

表3　方差分析結(jié)果Table 3　Analysis of variance for quadric regression model

2.2.2丁香葉總酚酸提取率的響應(yīng)面分析響應(yīng)面圖是響應(yīng)值對(duì)各實(shí)驗(yàn)因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，可直觀的反映各實(shí)驗(yàn)因素的交互作用［19-21］。對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，研究表明，等高線(xiàn)的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，越趨向橢圓表明交互作用越強(qiáng)，越趨向圓形則相反，表明交互作用越弱［22］。本實(shí)驗(yàn)中各因素的交互作用均不顯著。

2.2.3丁香葉總酚酸提取工藝條件的優(yōu)化由該軟件分析后得最佳工藝條件乙醇濃度為43.55%，提取溫度為90.09℃，提取時(shí)間為96.35min，液料比25.2∶1（mL/g），提取次數(shù)為2次。為了能讓丁香葉總酚酸的提取更加便捷，可取最優(yōu)條件為乙醇濃度44%，提取溫度為90℃，提取時(shí)間為96min，液料比25.2∶1（mL/g）。在此條件下經(jīng)過(guò)驗(yàn)證得到總酚酸的實(shí)際平均提取率為（1.642±0.23）mg/g，與理論預(yù)測(cè)值1.66mg/g接近，表明該工藝優(yōu)化合理。

3　結(jié)論

將響應(yīng)面分析法用于丁香葉總酚酸提取工藝參數(shù)的優(yōu)化，確定的最佳提取工藝為乙醇濃度44%、提取溫度90℃、提取時(shí)間96min、液料比25.2∶1（mL/g）、提取次數(shù)為2次。在此條件下丁香葉總酚酸提取率為（1.642±0.23）mg/g，優(yōu)化得到的最佳提取工藝是提取丁香葉總酚酸化合物的有效途徑，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)食品添加劑和功能性食品提供了可靠依據(jù)。

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Optimization of extraction process of total phenolic acids from Syringa oblate Lindl.leaves by response surface methodology

WU Yan，SHENG Zun-lai，GAO Ling-fei，CHEN Jian-qing，LI Yan-hua*
（College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Total phenolic acids extraction from Syringa oblate Lindl.leaves was performed using the ethanol reflux extraction.Response surface methodology（RSM），based on a three level，four variable Box-Behnken design（BBD），was employed to obtain the best possible combination of ethanol concentration，extraction temperature，extraction time，and water to the raw material ratio for maximum total phenolic acids extraction. The optimum extraction conditions were as follows：ethanol concentration of 44%，extraction time of 96min，extraction temperature of 90℃，and the ratio of water to raw material of 25.2∶1（mL/g），extraction times of 2. Under these conditions，the experimental yield was（1.642±0.23）mg/g.The extraction process obtained by response surface methodology was stable and reasonable，accurate and reliable.It was a feasible method to extract the total phenolic acids from Syringa oblate Lindl.Leaves.

Syringa oblate Lindl.leaves；total phenolic acids；response surface methodology（RSM）；extraction process

TS201.1

B

1002-0306（2015）02-0286-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.053

2014－04－14

吳燕（1991-），女，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物藥學(xué)。

李艷華（1972-），女，博士研究生，教授，主要從事病原微生物耐藥性及新獸藥研發(fā)。

黑龍江省留學(xué)歸國(guó)基金（LC2013C05）。