大孔樹脂法分離純化莢果蕨總?cè)?/h1>
2015-10-21 03:50:06楊曉艷馬吉福習(xí)偉佳陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教育部藥用植物資源及天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陜西西安710062
食品工業(yè)科技 2015年2期
楊曉艷，馬 驥，彭 飛，陸 洋，馬吉福，習(xí)偉佳，張 婷（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教育部藥用植物資源及天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710062）
大孔樹脂法分離純化莢果蕨總?cè)?/p>
楊曉艷，馬驥*，彭飛，陸洋，馬吉福，習(xí)偉佳，張婷
（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教育部藥用植物資源及天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710062）
目的：篩選出分離純化莢果蕨總?cè)频淖罴汛罂讟渲吞柤肮に嚄l件。方法：以莢果蕨總?cè)茲舛葹橹笜?biāo)，通過靜態(tài)和動態(tài)實(shí)驗(yàn)，篩選最佳大孔吸附樹脂并初步確定總?cè)萍兓に嚒＝Y(jié)果：AB-8型大孔樹脂吸附解析效果最好，吸附條件：溶液濃度1.96mg/mL，pH為6，流速1.5mL/min，吸附體積5BV；洗脫條件：60%乙醇，流速2.0mL/min，洗脫體積4BV，其回收率為86.27%，純度82.32%，精制倍數(shù)為2.88。結(jié)論：AB-8大孔樹脂較適合分離純化莢果蕨總?cè)?。該工藝簡單可行，純化效果好，可為工業(yè)生產(chǎn)中分離純化莢果蕨總?cè)铺峁├碚撝笇?dǎo)和參考依據(jù)。
莢果蕨，總?cè)?，大孔吸附樹脂，分離，純化
莢果蕨［Matteuccia struthiopteris（L.）Todaro］是球子蕨科（Onocleaceae）莢果蕨屬（MatteucciaTodaro）多年生草本植物，含有多種藥用成分，如：黃酮類、甾酮類、多糖、萜類等有效成分，為我國主要的五種貫眾之一，可全草入藥，具有清熱解毒、殺蟲、止血等功效［1］。近年來作為營養(yǎng)價(jià)值極高的綠色山野菜出口，是藥食兩用的蕨類植物［2］。三萜類化合物為莢果蕨的主要有效成分之一［3］，三萜類化合物在抗癌［4］、保肝、降血糖、抗腫瘤、抗病毒［5-7］等方面已有文獻(xiàn)報(bào)道。
莢果蕨總?cè)频奶崛∫褐杏休^多雜質(zhì)，需要進(jìn)行選擇性分離，以提高總?cè)频募兌?。大孔吸附樹脂具有穩(wěn)定性高、吸附選擇性獨(dú)特、吸附解析條件溫和快捷、再生能力強(qiáng)、使用周期長等諸多優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、環(huán)保等方面，同時用于生化物質(zhì)的分離純化，尤其適用于中草藥有效成分如皂苷類、黃酮類、多酚等的分離純化及工業(yè)化生產(chǎn)［8-11］。目前莢果蕨總?cè)频难芯窟€處于提取階段，缺乏對其分離純化的系統(tǒng)研究，本實(shí)驗(yàn)以莢果蕨總?cè)茷椴牧线M(jìn)行純化研究，考察不同樹脂對總?cè)频奈浇馕鲂阅埽瑸榍v果蕨的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。
1 材料與方法
1.1材料與儀器
莢果蕨采自陜西省寧陜縣旬陽壩鎮(zhèn)，經(jīng)陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬驥副教授鑒定；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、冰乙酸、高氯酸均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水超純水；HPD-100、HPD-300、S-8、D101、AB-8均購自西安藍(lán)深特種樹脂有限責(zé)任公司。
HL-2電腦數(shù)顯恒流泵上海滬西有限公司；HH-6B數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇常州國華電器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山超聲儀器有限公司；SHB-循環(huán)水式多用真空泵、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；MicroBench PH600TRANS-WIGGENS；超微量微孔板分光光度計(jì)美國BioTek。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1總?cè)拼痔嵋旱闹苽鋵⑶v果蕨粉碎，過60目篩，稱2g材料，30mL石油醚脫脂兩次，以60%乙醇，料液比1∶30，在300W，63℃的水浴中超聲39min，提取兩次合并提取液旋蒸揮去乙醇，冷凍干燥成粉末，放于冰箱中儲存?zhèn)溆茫?2］。
1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取干燥恒質(zhì)量的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品2mg置于10mL的容量瓶中，加入無水乙醇定容，制得0.2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取系列梯度的標(biāo)品溶液置于10mL的具塞試管中，在60℃恒溫水浴鍋中揮干，流水冷卻后加5%的香草醛-冰乙酸0.2mL，高氯酸0.8mL，搖勻，60℃水浴鍋加熱15min，流水冷卻，加5mL冰乙酸，搖勻后在550nm處測定吸光值［13-14］。以齊墩果酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為：Y=8.1738x-0.0174，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。
1.2.3總?cè)坪繙y定準(zhǔn)確稱取1.2.1中樣品粉末1g于試管中，加入蒸餾水10mL溶解，再按1.2.2中方法顯色，測吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算莢果蕨總?cè)坪俊?/p>
1.2.4樹脂的預(yù)處理［15］稱取一定不同型號大孔吸附樹脂，用2BV的無水乙醇浸泡樹脂并攪拌，待充分溶脹24h后，繼續(xù)用乙醇洗滌，洗至洗出液無白色渾濁，再用蒸餾水洗盡乙醇，至無醇味。進(jìn)行酸堿處理，用2BV的5%HCl溶液浸泡3h后，用蒸餾水沖洗至中性；用2BV的5%NaOH溶液浸泡3h，而后用蒸餾水洗至中性，蒸餾水浸泡備用。
1.2.5樹脂的篩選［16-17］根據(jù)莢果蕨總?cè)频睦砘匦院痛罂讟渲奈叫阅?，選用AB-8、HPD-100、HPD-300、D101、S-85種型號樹脂進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以大孔樹脂對莢果蕨總?cè)频撵o態(tài)吸附量、吸附率、解析量、解析率指標(biāo)評價(jià)樹脂。稱取2g預(yù)處理好的樹脂（濕重），置于100mL的三角瓶中，分別加入1.52mg/mL的溶液20mL，各三個重復(fù)。于25℃，1200r/min的搖床中振蕩10h，測定吸附前后的總?cè)瀑|(zhì)量濃度的變化，按下列公式（1）、（2）計(jì)算各樹脂的靜態(tài)吸附量和吸附率。同理，將吸附飽和的樹脂用蒸餾水沖洗，加入20mL 70%的乙醇洗脫，放入同樣條件的搖床中解吸10h，按公式（3）、（4）計(jì)算解析量和解析率。
式中：E：吸附量（mg/g）；Q：吸附率（%）；C0：初始濃度（mg/mL）；Ce：吸附后的濃度（mg/mL）；V：初始溶液體積（mL）；W：濕態(tài)樹脂質(zhì)量（g）。
式中：M：解析量（mg/g）；N：解析率（%）；V1：解析液的體積（mL）；C1：解析后的濃度（mg/mL）。
1.2.6AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附與解析
1.2.6.1靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線準(zhǔn)確稱取2g樹脂（濕重）置于100mL三角瓶中，加20mL總?cè)迫芤红o態(tài)吸附。分別在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0h取80μL溶液于60℃水浴揮干。以時間為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)繪制吸附曲線。
1.2.6.2靜態(tài)解析動力學(xué)曲線準(zhǔn)確稱取2g吸附飽和的樹脂置于100mL的錐形瓶中，加入70%的乙醇20mL洗脫，分別在0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0h取80μL于60℃水浴揮干。以時間為橫坐標(biāo)，解析量為縱坐標(biāo)繪制解析曲線。
1.2.7AB-8大孔樹脂的動態(tài)吸附與解析
1.2.7.1上樣濃度將不同濃度的總?cè)迫芤阂?mL/min流速，提取液的初始pH為5.77（pH計(jì)測定）上樣，吸附3h后，分別取吸附后的溶液測吸附率，以確定最佳濃度。
1.2.7.2上樣流速用濃度為1.96mg/mL，pH為5.77的樣品溶液以不同流速各上樣20mL。吸附3h后取吸附后的溶液測吸附率，確定最佳上樣流速。
1.2.7.3樣液pH用濃度1.96mg/mL，流速1.5mL/min，分別用NaOH、HCl溶液將樣液調(diào)至不同的pH上柱。3h后取吸附液測總?cè)坪?，確定最佳上樣pH。
1.2.7.4洗脫曲線的繪制取20g樹脂裝柱，以濃度1.96mg/mL、流速1.5mL/min、pH為5.77的樣液上樣，每隔10mL收集一管，測流出液中總?cè)茲舛?，一般?dāng)流出液的濃度達(dá)到上樣液濃度的1/10時，認(rèn)為此處是總?cè)频男孤c(diǎn)，以流出液體積為橫坐標(biāo)，流出液中總?cè)坪繛榭v坐標(biāo)繪制洗脫曲線，計(jì)算飽和動態(tài)吸附量。
1.2.7.5洗脫劑濃度的選擇考慮到洗脫劑的毒性大小及回收和后處理等因素，選擇乙醇為洗脫劑。樹脂吸附飽和后，先用3BV蒸餾水將多糖等水溶性雜質(zhì)洗脫，再分別用30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇以2mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫3BV，分別測定各洗脫液的解析量，以確定最佳的洗脫劑的體積分?jǐn)?shù)。
1.2.7.6洗脫流速將吸附飽和的樹脂用蒸餾水洗脫3BV，再用60%的乙醇以不同的流速洗脫3BV，測洗脫液的解析量，確定最佳洗脫流速。
1.2.7.7洗脫體積將吸附飽和的樹脂用蒸餾水洗脫3BV，再用60%以2mL/min進(jìn)行洗脫，每10mL收集一管洗脫液，共收集100mL溶液。測各管洗脫液總?cè)茲舛?，確定最合適的洗脫體積。
1.2.7.8莢果蕨總?cè)频募兌扰c回收率測定［18］
式中：C：樣液中總?cè)频臐舛龋╩g/mL）；V：樣液的體積（mL）；M：總?cè)品勰┑母芍兀╩g）。
式中：Ca：純化前的濃度（mg/mL）；Cb：純化后的濃度（mg/mL）；Va：上柱的溶液體積（mL）；Vb：純化后洗脫液的體積（mL）。
1.2.8數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理。
2 結(jié)果與分析
2.1大孔樹脂的篩選
在相同實(shí)驗(yàn)條件下，各樹脂的靜態(tài)吸附解析結(jié)果如表1所示，從表1中可看出，與其他型號樹脂相比，AB-8型樹脂對莢果蕨總?cè)凭哂休^好的吸附和解析效果。影響大孔樹脂吸附解析性能的因素很多，如：樹脂的顆?？讖健⒈砻娣e、極性、被吸附物質(zhì)的極性等。因此不同型號的樹脂對總?cè)频奈浇馕鲂阅芨饔胁町?，?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吸附量較大的多為非極性或弱極性樹脂，如AB-8、HPD-100、D101。五種樹脂中，綜合考慮以上4個指標(biāo)，AB-8樹脂的吸附解析效果最好，本實(shí)驗(yàn)選擇AB-8作為莢果蕨總?cè)频姆蛛x純化樹脂。
表1 不同樹脂對總?cè)频奈浇馕鼋Y(jié)果Table 1 Adsorption and desorption performance ofdifferent resins towards triterpenes
2.2AB-8大孔樹脂的靜態(tài)吸附解析曲線
2.2.1靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線由圖1可知，0～3h之間樹脂吸附速率較快，吸附量隨時間延長增大，至3h后吸附量基本趨于飽和，變化平緩，說明AB-8大孔樹脂對莢果蕨總?cè)频奈綖榭焖倨胶庑停?9］，省時高效，具有良好的靜態(tài)吸附特性，適用于工業(yè)生產(chǎn)中的分離純化。
圖1 總?cè)旗o態(tài)吸附動力學(xué)曲線Fig.1 The static adsorption kinetic curve of total triterpenes
2.2.2靜態(tài)解析動力學(xué)曲線由圖2可知，在0.5h解析時間內(nèi)，總?cè)频慕馕鏊俾瘦^快，解析量隨之增大，超過1h后，隨著時間的延長，解析量達(dá)到平衡。即當(dāng)靜態(tài)解析時間達(dá)1h時就基本解析完全，表明吸附飽和的樹脂解析時間較短，可降低成本，更適于工業(yè)化生產(chǎn)。
圖2 總?cè)旗o態(tài)解吸時間動力學(xué)曲線Fig.2 The static desorption kinetic curve of total triterpenes
2.3AB-8樹脂對莢果蕨總?cè)频膭討B(tài)吸附
2.3.1上樣濃度對樹脂的吸附效果的影響由圖3可知：以不同濃度的總?cè)迫芤荷蠘樱珹B-8樹脂的吸附率隨濃度先遞增后趨于平衡。若總?cè)茲舛容^小，樹脂不能被充分利用而造成浪費(fèi)；若濃度太大，溶質(zhì)不易溶解且吸附率趨于飽和，會使樹脂堵塞，為后續(xù)的解析及樹脂再生造成困難［20］，綜合考慮各因素，選擇最佳上樣濃度為1.96mg/mL。
圖3 濃度對吸附率的影響Fig.3 The effect of concentration of triterpenes on adsorption
圖4 流速對吸附率的影響Fig.4 The effect of the sample flow velocity on adsorption
2.3.2上樣流速對樹脂吸附效果的影響由圖4知，吸附率隨上樣速度的增大而降低，其原因是流速越慢，總?cè)圃跇渲型Ａ舻臅r間越久，利于二者的吸附；反之，流速較大時，停留時間變短不利于互相吸附，從而降低了吸附率。但流速太小會使操作周期延長，生產(chǎn)效率降低，不利于工業(yè)中大批量純化，綜合吸附率和工作效率，1.5mL/min的流速上樣最佳。
2.3.3樣液pH對樹脂吸附效果的影響由圖5可知，樣液的不同pH對吸附率的影響較大。pH對大孔樹脂的吸附效果與被吸附物質(zhì)的酸堿性有關(guān)，酸性物質(zhì)在酸性溶液中易吸附，堿性化合物在堿性溶液中易吸附［21］。圖5可見莢果蕨總?cè)迫芤涸趐H為6左右時吸附最好，因?yàn)榭側(cè)铺崛∫撼嗜跛嵝裕╬H= 5.77）時，三萜皂苷以分子形勢存在，利于樹脂的吸附，在中性或堿性溶劑中則吸附降低，因此選擇pH為6適宜。
圖5pH對吸附率的影響Fig.5 The effect of pH value of triterpenes on adsorption
2.3.4洗脫曲線的繪制由圖6可知，以1.96mg/mL上樣，樹脂的吸附效果隨上樣體積的增加而降低。在50mL之前，吸附效果較好，流出液的總?cè)茲舛群苄 ?00mL時流出液的濃度為0.195mg/mL，達(dá)到初始濃度的1/10，即此處為泄漏點(diǎn)，表明該樹脂吸附性能較好，最多可上樣100mL（5BV）溶液。
圖6 吸附洗脫曲線Fig.6 The curve of adsorption leak of triterpenes
2.4AB-8樹脂的動態(tài)解析效果
2.4.1乙醇濃度對解析效果的影響由圖7所示，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇解析效果不同，體積分?jǐn)?shù)在30%～60%之間時，解析量不斷增加，而高于60%時，解析量隨之逐漸降低。根據(jù)相似相溶原理，60%乙醇能充分溶解總?cè)苹蛟摌O性可更好的減弱總?cè)婆c樹脂間的吸附力，使解析效果最佳。
圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)對解析量的影響Fig.7 The effect of ethanol concentrations on desorption of macroporous resin
圖8 洗脫流速對解析量的影響Fig.8 The effect of elution velocity on desorption of macroporous resin
2.4.2洗脫流速對解析效果的影響分別以不同流速的蒸餾水和60%乙醇進(jìn)行動態(tài)洗脫，在圖8中可知，隨著洗脫流速的增大，解析量呈降低的趨勢。解析流速過大，乙醇不能與被吸附的總?cè)瞥浞纸佑|而將其從樹脂上洗脫下來，使解析效果不佳。流速過小，解析完全但工作周期太長，因此兼顧較高的解析量和較短的實(shí)驗(yàn)周期，選擇2.0mL/min的速度洗脫最好。
2.4.3洗脫劑用量考察由圖9所示，解析峰非常集中，峰型較窄且無明顯的拖尾現(xiàn)象。經(jīng)測定，當(dāng)洗脫體積達(dá)2BV時，所需的大部分目標(biāo)物已被洗脫下來，當(dāng)洗脫液為80mL（4BV）時，洗脫液中總?cè)茲舛葞缀鯙榱?，說明4BV的洗脫液已經(jīng)將總?cè)葡疵撏耆?，故確定最佳洗脫劑用量為4BV。
圖9 洗脫曲線Fig.9 The curve of desorption of triterpenes
3 結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)對5種不同型號的大孔樹脂進(jìn)行篩選，分離純化莢果蕨總?cè)频睦硐氪罂孜綐渲茿B-8。通過考察不同因素對純化效果的影響，初步確定最佳吸附條件：上樣濃度1.96mg/mL，上樣流速1.5mL/min，樣液pH6，最大上樣量達(dá)5BV；最佳洗脫條件：60%乙醇，2.0mL/min洗脫速度，4BV洗脫體積。其回收率為86.27%，純度從28.61%提高到82.32%，精制倍數(shù)達(dá)2.88，說明AB-8大孔吸附樹脂對莢果蕨總?cè)凭哂休^好的純化精制效果，選擇性好，吸附解析率高，操作簡單易行且無毒害作用。
與其他三萜類物質(zhì)的分離純化研究［22-23］相較而言，本文所用的乙醇濃度低、用量少、節(jié)約成本，其純度和回收率也有一定的提高，因此該方法在分離純化藥材中三萜類物質(zhì)方面具有一定推廣價(jià)值，可為工業(yè)生產(chǎn)中莢果蕨總?cè)频姆蛛x純化及單體的鑒定等方面提供可靠的理論和參考依據(jù)。
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Separation and purification of triterpenes from Matteuccia struthiopteris with macroporous resin
YANG Xiao-yan，MA Ji*，PENG Fei，LU Yang，MA Ji-fu，XI Wei-jia，ZHANG Ting
（Life Science College，Shaanxi Normal University，Key Laboratory of Minisitry of Education for Madicinal Plant Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry，Xi’an 710062，China）
Objective：An optimal macroporous resin and process that to separate and purify triterpenes from Matteuccia struthiopteris was reasearched.Methods：The optimal resin and purificating technology were preliminary selected through the static and dynamic test，taking the concentration of triterpenes as the main index.Results：The best macroporous resin was AB-8，the adsorption conditions were described as follows：the pH and concentration of sample was 6 and 1.96mg/mL，the maximum injection volume was 5BV，the flow velocity was 1.5mL/min.The desorption process was determined as follows：60%ethanol was used as eluent at the flow rate of 2.0mL/min with 4BV，the recovery rate reached up to 86.27%，the purity was 82.32%，the purified multiples of triterpenes was 2.88.Conlusion：These data demonstrated the AB-8 macroporous resin in purifying triterpenes from Matteuccia struthiopteris was well.This method was easy to operate and displayed a good purification effect，the certain reference and theoretical guidance for separation and purification of triterpenes in industrial application could be provided.
Matteuccia struthiopteris；triterpenes；macroporous resin；separation；purification
TS201.1
B
1002-0306（2015）02-0238-05
10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.043
2014－05－22
楊曉艷（1989-），女，碩士研究生，研究方向：藥用植物資源。
馬驥（1964-），男，碩士研究生，副教授，研究方向：藥用植物資源。
國家“十二五”科技支撐計(jì)劃課題（2011BAI06B05）；國家大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（201310718050）。
楊曉艷，馬 驥，彭 飛，陸 洋，馬吉福，習(xí)偉佳，張 婷（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教育部藥用植物資源及天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710062）
大孔樹脂法分離純化莢果蕨總?cè)?/p>
楊曉艷，馬驥*，彭飛，陸洋，馬吉福，習(xí)偉佳，張婷
（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教育部藥用植物資源及天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710062）
目的：篩選出分離純化莢果蕨總?cè)频淖罴汛罂讟渲吞柤肮に嚄l件。方法：以莢果蕨總?cè)茲舛葹橹笜?biāo)，通過靜態(tài)和動態(tài)實(shí)驗(yàn)，篩選最佳大孔吸附樹脂并初步確定總?cè)萍兓に嚒＝Y(jié)果：AB-8型大孔樹脂吸附解析效果最好，吸附條件：溶液濃度1.96mg/mL，pH為6，流速1.5mL/min，吸附體積5BV；洗脫條件：60%乙醇，流速2.0mL/min，洗脫體積4BV，其回收率為86.27%，純度82.32%，精制倍數(shù)為2.88。結(jié)論：AB-8大孔樹脂較適合分離純化莢果蕨總?cè)?。該工藝簡單可行，純化效果好，可為工業(yè)生產(chǎn)中分離純化莢果蕨總?cè)铺峁├碚撝笇?dǎo)和參考依據(jù)。
莢果蕨，總?cè)?，大孔吸附樹脂，分離，純化
莢果蕨［Matteuccia struthiopteris（L.）Todaro］是球子蕨科（Onocleaceae）莢果蕨屬（MatteucciaTodaro）多年生草本植物，含有多種藥用成分，如：黃酮類、甾酮類、多糖、萜類等有效成分，為我國主要的五種貫眾之一，可全草入藥，具有清熱解毒、殺蟲、止血等功效［1］。近年來作為營養(yǎng)價(jià)值極高的綠色山野菜出口，是藥食兩用的蕨類植物［2］。三萜類化合物為莢果蕨的主要有效成分之一［3］，三萜類化合物在抗癌［4］、保肝、降血糖、抗腫瘤、抗病毒［5-7］等方面已有文獻(xiàn)報(bào)道。
莢果蕨總?cè)频奶崛∫褐杏休^多雜質(zhì)，需要進(jìn)行選擇性分離，以提高總?cè)频募兌?。大孔吸附樹脂具有穩(wěn)定性高、吸附選擇性獨(dú)特、吸附解析條件溫和快捷、再生能力強(qiáng)、使用周期長等諸多優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、環(huán)保等方面，同時用于生化物質(zhì)的分離純化，尤其適用于中草藥有效成分如皂苷類、黃酮類、多酚等的分離純化及工業(yè)化生產(chǎn)［8-11］。目前莢果蕨總?cè)频难芯窟€處于提取階段，缺乏對其分離純化的系統(tǒng)研究，本實(shí)驗(yàn)以莢果蕨總?cè)茷椴牧线M(jìn)行純化研究，考察不同樹脂對總?cè)频奈浇馕鲂阅埽瑸榍v果蕨的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。
1 材料與方法
1.1材料與儀器
莢果蕨采自陜西省寧陜縣旬陽壩鎮(zhèn)，經(jīng)陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬驥副教授鑒定；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、冰乙酸、高氯酸均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水超純水；HPD-100、HPD-300、S-8、D101、AB-8均購自西安藍(lán)深特種樹脂有限責(zé)任公司。
HL-2電腦數(shù)顯恒流泵上海滬西有限公司；HH-6B數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇常州國華電器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山超聲儀器有限公司；SHB-循環(huán)水式多用真空泵、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；MicroBench PH600TRANS-WIGGENS；超微量微孔板分光光度計(jì)美國BioTek。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1總?cè)拼痔嵋旱闹苽鋵⑶v果蕨粉碎，過60目篩，稱2g材料，30mL石油醚脫脂兩次，以60%乙醇，料液比1∶30，在300W，63℃的水浴中超聲39min，提取兩次合并提取液旋蒸揮去乙醇，冷凍干燥成粉末，放于冰箱中儲存?zhèn)溆茫?2］。
1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取干燥恒質(zhì)量的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品2mg置于10mL的容量瓶中，加入無水乙醇定容，制得0.2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取系列梯度的標(biāo)品溶液置于10mL的具塞試管中，在60℃恒溫水浴鍋中揮干，流水冷卻后加5%的香草醛-冰乙酸0.2mL，高氯酸0.8mL，搖勻，60℃水浴鍋加熱15min，流水冷卻，加5mL冰乙酸，搖勻后在550nm處測定吸光值［13-14］。以齊墩果酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為：Y=8.1738x-0.0174，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。
1.2.3總?cè)坪繙y定準(zhǔn)確稱取1.2.1中樣品粉末1g于試管中，加入蒸餾水10mL溶解，再按1.2.2中方法顯色，測吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算莢果蕨總?cè)坪俊?/p>
1.2.4樹脂的預(yù)處理［15］稱取一定不同型號大孔吸附樹脂，用2BV的無水乙醇浸泡樹脂并攪拌，待充分溶脹24h后，繼續(xù)用乙醇洗滌，洗至洗出液無白色渾濁，再用蒸餾水洗盡乙醇，至無醇味。進(jìn)行酸堿處理，用2BV的5%HCl溶液浸泡3h后，用蒸餾水沖洗至中性；用2BV的5%NaOH溶液浸泡3h，而后用蒸餾水洗至中性，蒸餾水浸泡備用。
1.2.5樹脂的篩選［16-17］根據(jù)莢果蕨總?cè)频睦砘匦院痛罂讟渲奈叫阅?，選用AB-8、HPD-100、HPD-300、D101、S-85種型號樹脂進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以大孔樹脂對莢果蕨總?cè)频撵o態(tài)吸附量、吸附率、解析量、解析率指標(biāo)評價(jià)樹脂。稱取2g預(yù)處理好的樹脂（濕重），置于100mL的三角瓶中，分別加入1.52mg/mL的溶液20mL，各三個重復(fù)。于25℃，1200r/min的搖床中振蕩10h，測定吸附前后的總?cè)瀑|(zhì)量濃度的變化，按下列公式（1）、（2）計(jì)算各樹脂的靜態(tài)吸附量和吸附率。同理，將吸附飽和的樹脂用蒸餾水沖洗，加入20mL 70%的乙醇洗脫，放入同樣條件的搖床中解吸10h，按公式（3）、（4）計(jì)算解析量和解析率。
式中：E：吸附量（mg/g）；Q：吸附率（%）；C0：初始濃度（mg/mL）；Ce：吸附后的濃度（mg/mL）；V：初始溶液體積（mL）；W：濕態(tài)樹脂質(zhì)量（g）。
式中：M：解析量（mg/g）；N：解析率（%）；V1：解析液的體積（mL）；C1：解析后的濃度（mg/mL）。
1.2.6AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附與解析
1.2.6.1靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線準(zhǔn)確稱取2g樹脂（濕重）置于100mL三角瓶中，加20mL總?cè)迫芤红o態(tài)吸附。分別在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0h取80μL溶液于60℃水浴揮干。以時間為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)繪制吸附曲線。
1.2.6.2靜態(tài)解析動力學(xué)曲線準(zhǔn)確稱取2g吸附飽和的樹脂置于100mL的錐形瓶中，加入70%的乙醇20mL洗脫，分別在0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0h取80μL于60℃水浴揮干。以時間為橫坐標(biāo)，解析量為縱坐標(biāo)繪制解析曲線。
1.2.7AB-8大孔樹脂的動態(tài)吸附與解析
1.2.7.1上樣濃度將不同濃度的總?cè)迫芤阂?mL/min流速，提取液的初始pH為5.77（pH計(jì)測定）上樣，吸附3h后，分別取吸附后的溶液測吸附率，以確定最佳濃度。
1.2.7.2上樣流速用濃度為1.96mg/mL，pH為5.77的樣品溶液以不同流速各上樣20mL。吸附3h后取吸附后的溶液測吸附率，確定最佳上樣流速。
1.2.7.3樣液pH用濃度1.96mg/mL，流速1.5mL/min，分別用NaOH、HCl溶液將樣液調(diào)至不同的pH上柱。3h后取吸附液測總?cè)坪?，確定最佳上樣pH。
1.2.7.4洗脫曲線的繪制取20g樹脂裝柱，以濃度1.96mg/mL、流速1.5mL/min、pH為5.77的樣液上樣，每隔10mL收集一管，測流出液中總?cè)茲舛?，一般?dāng)流出液的濃度達(dá)到上樣液濃度的1/10時，認(rèn)為此處是總?cè)频男孤c(diǎn)，以流出液體積為橫坐標(biāo)，流出液中總?cè)坪繛榭v坐標(biāo)繪制洗脫曲線，計(jì)算飽和動態(tài)吸附量。
1.2.7.5洗脫劑濃度的選擇考慮到洗脫劑的毒性大小及回收和后處理等因素，選擇乙醇為洗脫劑。樹脂吸附飽和后，先用3BV蒸餾水將多糖等水溶性雜質(zhì)洗脫，再分別用30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇以2mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫3BV，分別測定各洗脫液的解析量，以確定最佳的洗脫劑的體積分?jǐn)?shù)。
1.2.7.6洗脫流速將吸附飽和的樹脂用蒸餾水洗脫3BV，再用60%的乙醇以不同的流速洗脫3BV，測洗脫液的解析量，確定最佳洗脫流速。
1.2.7.7洗脫體積將吸附飽和的樹脂用蒸餾水洗脫3BV，再用60%以2mL/min進(jìn)行洗脫，每10mL收集一管洗脫液，共收集100mL溶液。測各管洗脫液總?cè)茲舛?，確定最合適的洗脫體積。
1.2.7.8莢果蕨總?cè)频募兌扰c回收率測定［18］
式中：C：樣液中總?cè)频臐舛龋╩g/mL）；V：樣液的體積（mL）；M：總?cè)品勰┑母芍兀╩g）。
式中：Ca：純化前的濃度（mg/mL）；Cb：純化后的濃度（mg/mL）；Va：上柱的溶液體積（mL）；Vb：純化后洗脫液的體積（mL）。
1.2.8數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理。
2 結(jié)果與分析
2.1大孔樹脂的篩選
在相同實(shí)驗(yàn)條件下，各樹脂的靜態(tài)吸附解析結(jié)果如表1所示，從表1中可看出，與其他型號樹脂相比，AB-8型樹脂對莢果蕨總?cè)凭哂休^好的吸附和解析效果。影響大孔樹脂吸附解析性能的因素很多，如：樹脂的顆?？讖健⒈砻娣e、極性、被吸附物質(zhì)的極性等。因此不同型號的樹脂對總?cè)频奈浇馕鲂阅芨饔胁町?，?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吸附量較大的多為非極性或弱極性樹脂，如AB-8、HPD-100、D101。五種樹脂中，綜合考慮以上4個指標(biāo)，AB-8樹脂的吸附解析效果最好，本實(shí)驗(yàn)選擇AB-8作為莢果蕨總?cè)频姆蛛x純化樹脂。
表1 不同樹脂對總?cè)频奈浇馕鼋Y(jié)果Table 1 Adsorption and desorption performance ofdifferent resins towards triterpenes
2.2AB-8大孔樹脂的靜態(tài)吸附解析曲線
2.2.1靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線由圖1可知，0～3h之間樹脂吸附速率較快，吸附量隨時間延長增大，至3h后吸附量基本趨于飽和，變化平緩，說明AB-8大孔樹脂對莢果蕨總?cè)频奈綖榭焖倨胶庑停?9］，省時高效，具有良好的靜態(tài)吸附特性，適用于工業(yè)生產(chǎn)中的分離純化。
圖1 總?cè)旗o態(tài)吸附動力學(xué)曲線Fig.1 The static adsorption kinetic curve of total triterpenes
2.2.2靜態(tài)解析動力學(xué)曲線由圖2可知，在0.5h解析時間內(nèi)，總?cè)频慕馕鏊俾瘦^快，解析量隨之增大，超過1h后，隨著時間的延長，解析量達(dá)到平衡。即當(dāng)靜態(tài)解析時間達(dá)1h時就基本解析完全，表明吸附飽和的樹脂解析時間較短，可降低成本，更適于工業(yè)化生產(chǎn)。
圖2 總?cè)旗o態(tài)解吸時間動力學(xué)曲線Fig.2 The static desorption kinetic curve of total triterpenes
2.3AB-8樹脂對莢果蕨總?cè)频膭討B(tài)吸附
2.3.1上樣濃度對樹脂的吸附效果的影響由圖3可知：以不同濃度的總?cè)迫芤荷蠘樱珹B-8樹脂的吸附率隨濃度先遞增后趨于平衡。若總?cè)茲舛容^小，樹脂不能被充分利用而造成浪費(fèi)；若濃度太大，溶質(zhì)不易溶解且吸附率趨于飽和，會使樹脂堵塞，為后續(xù)的解析及樹脂再生造成困難［20］，綜合考慮各因素，選擇最佳上樣濃度為1.96mg/mL。
圖3 濃度對吸附率的影響Fig.3 The effect of concentration of triterpenes on adsorption
圖4 流速對吸附率的影響Fig.4 The effect of the sample flow velocity on adsorption
2.3.2上樣流速對樹脂吸附效果的影響由圖4知，吸附率隨上樣速度的增大而降低，其原因是流速越慢，總?cè)圃跇渲型Ａ舻臅r間越久，利于二者的吸附；反之，流速較大時，停留時間變短不利于互相吸附，從而降低了吸附率。但流速太小會使操作周期延長，生產(chǎn)效率降低，不利于工業(yè)中大批量純化，綜合吸附率和工作效率，1.5mL/min的流速上樣最佳。
2.3.3樣液pH對樹脂吸附效果的影響由圖5可知，樣液的不同pH對吸附率的影響較大。pH對大孔樹脂的吸附效果與被吸附物質(zhì)的酸堿性有關(guān)，酸性物質(zhì)在酸性溶液中易吸附，堿性化合物在堿性溶液中易吸附［21］。圖5可見莢果蕨總?cè)迫芤涸趐H為6左右時吸附最好，因?yàn)榭側(cè)铺崛∫撼嗜跛嵝裕╬H= 5.77）時，三萜皂苷以分子形勢存在，利于樹脂的吸附，在中性或堿性溶劑中則吸附降低，因此選擇pH為6適宜。
圖5pH對吸附率的影響Fig.5 The effect of pH value of triterpenes on adsorption
2.3.4洗脫曲線的繪制由圖6可知，以1.96mg/mL上樣，樹脂的吸附效果隨上樣體積的增加而降低。在50mL之前，吸附效果較好，流出液的總?cè)茲舛群苄 ?00mL時流出液的濃度為0.195mg/mL，達(dá)到初始濃度的1/10，即此處為泄漏點(diǎn)，表明該樹脂吸附性能較好，最多可上樣100mL（5BV）溶液。
圖6 吸附洗脫曲線Fig.6 The curve of adsorption leak of triterpenes
2.4AB-8樹脂的動態(tài)解析效果
2.4.1乙醇濃度對解析效果的影響由圖7所示，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇解析效果不同，體積分?jǐn)?shù)在30%～60%之間時，解析量不斷增加，而高于60%時，解析量隨之逐漸降低。根據(jù)相似相溶原理，60%乙醇能充分溶解總?cè)苹蛟摌O性可更好的減弱總?cè)婆c樹脂間的吸附力，使解析效果最佳。
圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)對解析量的影響Fig.7 The effect of ethanol concentrations on desorption of macroporous resin
圖8 洗脫流速對解析量的影響Fig.8 The effect of elution velocity on desorption of macroporous resin
2.4.2洗脫流速對解析效果的影響分別以不同流速的蒸餾水和60%乙醇進(jìn)行動態(tài)洗脫，在圖8中可知，隨著洗脫流速的增大，解析量呈降低的趨勢。解析流速過大，乙醇不能與被吸附的總?cè)瞥浞纸佑|而將其從樹脂上洗脫下來，使解析效果不佳。流速過小，解析完全但工作周期太長，因此兼顧較高的解析量和較短的實(shí)驗(yàn)周期，選擇2.0mL/min的速度洗脫最好。
2.4.3洗脫劑用量考察由圖9所示，解析峰非常集中，峰型較窄且無明顯的拖尾現(xiàn)象。經(jīng)測定，當(dāng)洗脫體積達(dá)2BV時，所需的大部分目標(biāo)物已被洗脫下來，當(dāng)洗脫液為80mL（4BV）時，洗脫液中總?cè)茲舛葞缀鯙榱?，說明4BV的洗脫液已經(jīng)將總?cè)葡疵撏耆?，故確定最佳洗脫劑用量為4BV。
圖9 洗脫曲線Fig.9 The curve of desorption of triterpenes
3 結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)對5種不同型號的大孔樹脂進(jìn)行篩選，分離純化莢果蕨總?cè)频睦硐氪罂孜綐渲茿B-8。通過考察不同因素對純化效果的影響，初步確定最佳吸附條件：上樣濃度1.96mg/mL，上樣流速1.5mL/min，樣液pH6，最大上樣量達(dá)5BV；最佳洗脫條件：60%乙醇，2.0mL/min洗脫速度，4BV洗脫體積。其回收率為86.27%，純度從28.61%提高到82.32%，精制倍數(shù)達(dá)2.88，說明AB-8大孔吸附樹脂對莢果蕨總?cè)凭哂休^好的純化精制效果，選擇性好，吸附解析率高，操作簡單易行且無毒害作用。
與其他三萜類物質(zhì)的分離純化研究［22-23］相較而言，本文所用的乙醇濃度低、用量少、節(jié)約成本，其純度和回收率也有一定的提高，因此該方法在分離純化藥材中三萜類物質(zhì)方面具有一定推廣價(jià)值，可為工業(yè)生產(chǎn)中莢果蕨總?cè)频姆蛛x純化及單體的鑒定等方面提供可靠的理論和參考依據(jù)。
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Separation and purification of triterpenes from Matteuccia struthiopteris with macroporous resin
YANG Xiao-yan，MA Ji*，PENG Fei，LU Yang，MA Ji-fu，XI Wei-jia，ZHANG Ting
（Life Science College，Shaanxi Normal University，Key Laboratory of Minisitry of Education for Madicinal Plant Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry，Xi’an 710062，China）
Objective：An optimal macroporous resin and process that to separate and purify triterpenes from Matteuccia struthiopteris was reasearched.Methods：The optimal resin and purificating technology were preliminary selected through the static and dynamic test，taking the concentration of triterpenes as the main index.Results：The best macroporous resin was AB-8，the adsorption conditions were described as follows：the pH and concentration of sample was 6 and 1.96mg/mL，the maximum injection volume was 5BV，the flow velocity was 1.5mL/min.The desorption process was determined as follows：60%ethanol was used as eluent at the flow rate of 2.0mL/min with 4BV，the recovery rate reached up to 86.27%，the purity was 82.32%，the purified multiples of triterpenes was 2.88.Conlusion：These data demonstrated the AB-8 macroporous resin in purifying triterpenes from Matteuccia struthiopteris was well.This method was easy to operate and displayed a good purification effect，the certain reference and theoretical guidance for separation and purification of triterpenes in industrial application could be provided.
Matteuccia struthiopteris；triterpenes；macroporous resin；separation；purification
TS201.1
B
1002-0306（2015）02-0238-05
10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.043
2014－05－22
楊曉艷（1989-），女，碩士研究生，研究方向：藥用植物資源。
馬驥（1964-），男，碩士研究生，副教授，研究方向：藥用植物資源。
國家“十二五”科技支撐計(jì)劃課題（2011BAI06B05）；國家大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（201310718050）。
