響應(yīng)曲面優(yōu)化檸檬酸淀粉清料發(fā)酵培養(yǎng)基

喬　君，趙祥穎，馬欽元，張家祥，韓延雷，劉建軍，*（.山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南5003；.濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司，山東濰坊5003）

響應(yīng)曲面優(yōu)化檸檬酸淀粉清料發(fā)酵培養(yǎng)基

喬君1，趙祥穎1，馬欽元2，張家祥1，韓延雷1，劉建軍1，*
（1.山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250013；2.濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司，山東濰坊250013）

運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)淀粉清料發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)相關(guān)因素進(jìn)行評(píng)估并篩選出具有顯著效應(yīng)的3個(gè)因素：玉米漿、尿素、pH。用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近以上3個(gè)因子的最大響應(yīng)區(qū)域后，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析法，確定其最佳培養(yǎng)基：玉米漿5.15g/L、尿素1.83g/L、初始pH=4.15、磷酸氫二鉀0.4g/L、硫酸鎂0.2g/L。在優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，淀粉清料發(fā)酵檸檬酸產(chǎn)量為147.52g/L，比優(yōu)化前提高了約12.19%，與玉米粉帶渣發(fā)酵相比，檸檬酸平均產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都提高了約10%，發(fā)酵殘?zhí)墙档土思s88%。

檸檬酸，清料發(fā)酵，培養(yǎng)基優(yōu)化，響應(yīng)曲面

檸檬酸，又名枸櫞酸，其具有令人愉悅的酸味，入口爽快，無(wú)后酸味，安全無(wú)毒，主要作為酸味劑應(yīng)用于食品、飲料行業(yè)且在醫(yī)藥、化工、環(huán)保、化妝品、紡織、印染、建筑等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用［1-2］。

我國(guó)自20世紀(jì)60年代開(kāi)始，經(jīng)過(guò)幾代人的不懈努力，培育出以薯干粉為原料的黑曲霉生產(chǎn)菌株，與國(guó)外酵母菌清料生產(chǎn)檸檬酸相比具有適應(yīng)性強(qiáng)（能采用山芋干、玉米、木薯、大米等多種淀粉質(zhì)原料）、遺傳性能穩(wěn)定、產(chǎn)酸高等優(yōu)點(diǎn)，開(kāi)創(chuàng)了具有中國(guó)特色的檸檬酸帶渣發(fā)酵工藝［3］。該工藝能很好的配合鈣鹽法分離技術(shù)。但是隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，人們意識(shí)到鈣鹽法分離技術(shù)操作過(guò)程復(fù)雜、生產(chǎn)成本高，產(chǎn)生大量廢渣、廢氣和廢水，嚴(yán)重污染環(huán)境。而采用色譜法提取技術(shù)則能基本實(shí)現(xiàn)檸檬酸行業(yè)零污染［4］。但是，色譜法對(duì)料液清潔度要求很高，否則，極易造成色譜柱污染，降低提取效率，增加生產(chǎn)成本。我國(guó)檸檬酸生產(chǎn)采用帶渣發(fā)酵，發(fā)酵液成分復(fù)雜，不適用于色譜法分離技術(shù)。因此，我國(guó)亟待研發(fā)檸檬酸清料發(fā)酵技術(shù)，既保留了我國(guó)檸檬酸發(fā)酵的眾多優(yōu)點(diǎn)，又能實(shí)現(xiàn)“零污染”。清料發(fā)酵具有培養(yǎng)基成分均一穩(wěn)定，減少了發(fā)酵過(guò)程中副產(chǎn)物的產(chǎn)生，減輕了后期提取的負(fù)荷，也減少了培養(yǎng)基中不參加代謝雜質(zhì)的能源消耗［5-7］。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黑曲霉（Aspergillus niger）濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀天津化學(xué)試劑有限公司，分析純；α-高溫淀粉酶20000酶活/mL，濰坊英軒生物技術(shù)有限公司；碘化鉀天津化學(xué)試劑有限公司，分析純；氫氧化鈉萊陽(yáng)化工有限公司，分析純；碘天津化學(xué)試劑有限公司，分析純；淀粉市售；麩皮市售；玉米漿濰坊英軒生物技術(shù)有限公司；瓊脂海南省青葛瓊脂廠；尿素天津化學(xué)試劑有限公司，分析純；MgSO4·7H2O天津同鑫化工廠，分析純。

SBA-40C型葡萄糖測(cè)定儀山東省科學(xué)院生物研究；THZ-C型生化培養(yǎng)箱江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；PHS-3C型便攜式pH計(jì)上海雷磁儀器廠；HYG-A型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)濕搖瓶柜上海新星自動(dòng)化控制設(shè)備成套廠；HH-S型恒溫水浴鍋江蘇金壇縣國(guó)華儀器廠；CJ型超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備廠；YXQSG41280型蒸汽消毒器無(wú)錫市第二醫(yī)療器械廠；JY2002型電子天平上海儀器儀表有限公司。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1察氏培養(yǎng)基NaNO33g/L，KCl 0.5g/L，F(xiàn)eSO40.01g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，蔗糖30g/L，瓊脂20g/L，pH6.7，121℃滅菌15min。

1.2.2麩曲培養(yǎng)基取市售、無(wú)霉變麩皮過(guò)篩去除細(xì)粉（50目篩），稱(chēng)取30g麩皮，按麩皮∶水=1∶1混合均勻，加入500mL三角瓶中，于121℃滅菌30min。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基

1.2.3.1淀粉液化［8］自來(lái)水與淀粉按質(zhì)量比4∶1的比例混合，95℃保溫并不斷攪拌，并加入α-高溫淀粉酶，恒溫20～30min，用碘指示劑檢驗(yàn)不變藍(lán)，冷卻，回復(fù)原來(lái)體積，得到淀粉液化液。

1.2.3.2發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉液化液中分別加入玉米漿5g/L，尿素0.5g/L，硫酸鎂0.05g/L，磷酸氫二鉀0.02g/L。

1.3培養(yǎng)方法

冰箱保存的斜面菌種轉(zhuǎn)接于察氏培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3d長(zhǎng)滿(mǎn)大量黑色孢子，取一環(huán)斜面種子接種于麩曲瓶中，37℃培養(yǎng)約7d。取適量培養(yǎng)好的麩曲接至適量無(wú)菌水中，充分混勻，調(diào)整孢子濃度為1× 108個(gè)/mL，將適量孢子懸液接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)96h，過(guò)濾去菌體，取適當(dāng)清液測(cè)定總酸。

1.4分析方法

1.4.1總酸測(cè)定方法［9］用0.1429mol/L的NaOH溶液滴定，所消耗的NaOH毫升數(shù)即為發(fā)酵液中檸檬酸的含量。

1.4.2總糖測(cè)定［10-11］初始總糖：發(fā)酵液接種后，經(jīng)水解，按斐林氏定糖法測(cè)定。殘?zhí)牵喊l(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)水解，按斐林氏定糖法測(cè)定。

1.4.3葡萄糖濃度的測(cè)定SBA-40D生物傳感分析儀測(cè)定。

1.5實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1主要因素篩選本文經(jīng)前期單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分比例為：初糖150g/L、玉米漿6g/L、尿素1g/L、初始pH=3.0、磷酸氫二鉀0.4g/L、硫酸鎂0.2g/L，檸檬酸產(chǎn)量為128g/L，轉(zhuǎn)化率為85.3%。在此基礎(chǔ)上，采用Minitab 15軟件，選用N=12的6因素的Plackett-Burman［12］實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察各因素對(duì)檸檬酸產(chǎn)量影響的顯著性。

1.5.2最陡爬坡實(shí)驗(yàn)最陡爬坡法以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長(zhǎng)，能快速、經(jīng)濟(jì)的逼近最佳區(qū)域［13］。

1.5.3響應(yīng)面分析法根據(jù)Box-behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，使用Minitab 15軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合。15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)可以分為兩類(lèi)：其一是析因點(diǎn)，自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有12個(gè)析因點(diǎn)；其二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差［13］。

以篩選出的玉米漿、尿素、pH3個(gè)主要因素為自變量，以檸檬酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定實(shí)驗(yàn)中心和水平，實(shí)驗(yàn)因素與水平的選取見(jiàn)表1。

表1　響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1　Factors and level value of response surface analysis

表2　N=12的Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Placket-Burman design and responding value of N=12

2　結(jié)果與討論

2.1確定影響檸檬酸產(chǎn)量的主要因素

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種二水平的多因子設(shè)計(jì)方法，能用最少實(shí)驗(yàn)次數(shù)從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素。根據(jù)前期對(duì)黑曲霉清料生產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基的初步優(yōu)化，選用N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)初始總糖（X1）、玉米漿（X2）、尿素（X3）、pH（X4）、磷酸氫二鉀（X5）、硫酸鎂（X6）6個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素分別取兩個(gè)水平（-1，+1），響應(yīng)值為檸檬酸產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及檸檬酸產(chǎn)率結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表3　各因素效應(yīng)值及顯著性分析Table 3　Effect of different factors

采用Minitab15對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，各因素效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，實(shí)驗(yàn)選取的6個(gè)因素對(duì)檸檬酸產(chǎn)率影響的顯著性順序?yàn)椋河衩诐{、尿素、pH、初始總糖、磷酸氫二鉀和硫酸鎂。其中玉米漿的可信度在95%以上，具有顯著性影響（p＜0.05），尿素和pH對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響較X1、X5、X6大，所以選取玉米漿、尿素、pH三個(gè)因素做爬坡實(shí)驗(yàn)。

2.2最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

由Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)可知，玉米漿、尿素、pH這3個(gè)因素對(duì)檸檬酸的產(chǎn)量影響較大，其中尿素和pH為正效應(yīng)，應(yīng)增加，玉米漿為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)降低。根據(jù)這三個(gè)因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向以及步長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4　Experimental design and results of steepest asent

從表4中可以看出，沿著變化方向，檸檬酸的產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后后下降的趨勢(shì)，第三步時(shí)的檸檬酸產(chǎn)量達(dá)到最高值（142.11g/L），因此選擇該步對(duì)應(yīng)的變量因子作為下一步Box-Behken設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

2.3響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)

2.3.1二次回歸模型擬合及方差分析根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，利用Minitab 15軟件設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以玉米漿、尿素、pH3個(gè)因素為自變量，以檸檬酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，中心組合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。

以檸檬酸的產(chǎn)量為響應(yīng)值，根據(jù)表5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用Minitab軟件進(jìn)行多元回歸分析，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)Minitab軟件獲得擬合方程：

表5　中心組合響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5　Response surface central composite design and corresponding response

回歸方程的方差分析及模型顯著性分析結(jié)果見(jiàn)表6、表7。

表6　回歸方程的方差分析Table 6　Analysis of variance for the regression equation

表7　回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 7　The significance test for the regression equation

從表6中可以看出，模型回歸高度顯著（p＜0.01），R2=0.9645，失擬項(xiàng)不顯著（p=0.2603），說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合很好，調(diào)整后的R2為0.9005，即表明模型可以解釋90.05%的發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸水平的變化，進(jìn)一步說(shuō)明了回歸方程的擬合程度較好。方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響極顯著（p＜0.01），整體交互作用不顯著（p=0.649）。表7中p值表明，此處X1X3（p=0.251）、X2X3（p=0.799）不顯著，且X1X2（p=0.933）也是不顯著的，此數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證表6中“交互作用”項(xiàng)不顯著的結(jié)果。

由響應(yīng)面回歸分析和回歸方程擬合可以繪出響應(yīng)面圖形，見(jiàn)圖1～圖3。

圖1　Y=f（X1，X2）的響應(yīng)面立體分析Fig.1　Surface layer Analysis of X1and X2

圖2　Y=f（X1，X3）的響應(yīng)面立體分析Fig.2　Surface layer Analysis of X1and X3

圖3　Y=f（X2，X3）的響應(yīng)面立體分析Fig.3　Surface layer Analysis of X2and X3

2.3.2最佳培養(yǎng)基成分的確定為了求得培養(yǎng)基最佳的濃度，對(duì)所得的回歸擬合方程分別對(duì)各自的變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，并令其為0可得到曲面的穩(wěn)定點(diǎn)，即最大點(diǎn)：

以上代碼值換算可得：X1=5.15g/L，X2=1.83g/L，X3=4.15，在此條件下理論預(yù)測(cè)檸檬酸產(chǎn)量可達(dá)148.3g/L。2.3.3最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的驗(yàn)證為了確定建立的模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否相符，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的主要影響因素濃度來(lái)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，并于玉米粉帶渣發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。

表8　檸檬酸淀粉清料發(fā)酵與帶渣發(fā)酵對(duì)照Table 8　The contrast between Clarifying and unrefined starch fermentation

黑曲霉產(chǎn)檸檬酸的平均產(chǎn)量為147.52g/L，與預(yù)測(cè)值接近，同優(yōu)化前產(chǎn)量128g/L相比，提高了約12.19%。表明所得的模型有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。與帶渣發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，檸檬酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都提高了約10%，發(fā)酵殘?zhí)墙档土思s88%。這可能是由于玉米渣中含有部分不能被黑曲霉利用的多糖所致。另一方面，清料發(fā)酵的溶氧效果增強(qiáng)等原因造成的。

3　結(jié)論與討論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析對(duì)淀粉液化清液的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，確定了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和較優(yōu)培養(yǎng)條件：最佳培養(yǎng)基組成為：玉米漿5.15g/L、尿素1.83g/L、初始pH=4.15、磷酸氫二鉀0.4g/L、硫酸鎂0.2g/L。在最優(yōu)培養(yǎng)基條件下，黑曲霉產(chǎn)檸檬酸的平均產(chǎn)量為147.52g/L，同優(yōu)化前產(chǎn)率128g/L相比，提高了約12.19%。說(shuō)明了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的有效性。與玉米粉帶渣發(fā)酵相比，檸檬酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都提高了約10%，發(fā)酵殘?zhí)墙档土思s88%。

淀粉清料發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸技術(shù)，使檸檬酸提取工序的色譜分離技術(shù)的廣泛使用成為可能，從而實(shí)現(xiàn)檸檬酸行業(yè)的零污染［3］。此外，清料發(fā)酵還可以提高玉米和菌絲體附加值，優(yōu)化發(fā)酵工藝控制等，從而實(shí)現(xiàn)清潔高效生產(chǎn)。本研究主要采用搖瓶發(fā)酵的方法，很多因素（如溶氧、轉(zhuǎn)速等）難以有效控制，不能充分發(fā)掘淀粉清料發(fā)酵的潛力，對(duì)于清料發(fā)酵的放大以及相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)，有待于進(jìn)一步的研究，最終能夠工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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［11］杜彬，李鳳英，范長(zhǎng)軍，等.響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄皮渣中可溶性膳食纖維的酸法提取工藝［J］.食品科學(xué)，2011，32（22）：128-134.

［12］羅章，孫術(shù)國(guó)，方軍，等.楊梅渣膳食纖維提取工藝［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（3）：215-219.

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Response surface optimization of medium components for citric acid production using clarifying solution of starch

QIAO Jun1，ZHAO Xiang-ying1，MA Qin-yuan2，ZHANG Jia-xiang1，HAN Yan-lei1，LIU Jian-jun1，*
（1.Food&Fermentation Engineering Key Lab of Shandong Province，Ji’nan 250013，China；2.Weifang Ensign Industry Co.Ltd.，Weifang 250013，China）

Response surface methodology（RSM）had been employed to optimize the clarifying starch medium for citric acid production by Aspergillus niger.Firstly，according to the results of amono-factor experiment，a Plackett-Burman design was used to investigate the effects of different factors in the ferment medium，with the three statistically significant factors being identified as：corn steep liquor，urea and pH.Secondly，the steepest ascent procedure wasemployed to define the optimal response region for these three factors.Finally，the Box-Behnken method was employed to design the reaction system.The results of the experiments were analyzed by RSM with Minitab15.0 software.The optimal fermentation medium for production of citric acid consisted of the following（g/L）：corn steep liquor 5.15g/L，urea 1.83g/L，pH4.15，MgSO40.2g/L，K2HPO40.4g/L.The average yield and conversion rate of citric acid，compared with unrefined starch culture，improved about 10%，meanwhile，the total residual sugar reduced about 88%.

citric acid；clarifying fermentation；media optimization；response surface methodology

TS201.3

A

1002-0306（2015）02-0231-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.041

2014－05－26

喬君（1985-），男，碩士研究生，助理工程師，研究方向：生物發(fā)酵。

劉建軍（1962-），男，博士研究生，研究員，研究方向：生物發(fā)酵。

山東省自主創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)（2012CX20505）。