四種酵母甘露聚糖合成與釋放特性的比較

劉金龍，倪靖岳，趙國群，*，李志敏（.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050000；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050000）

四種酵母甘露聚糖合成與釋放特性的比較

劉金龍1，2，倪靖岳1，趙國群1，2，*，李志敏1
（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050000；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050000）

比較了產(chǎn)朊假絲酵母、畢赤酵母、面包酵母和啤酒酵母培養(yǎng)過程中細(xì)胞壁甘露聚糖的合成與釋放特性。結(jié)果表明：四種酵母的甘露聚糖合成均為生長偶聯(lián)型；不同類型酵母的甘露聚糖合成能力差異顯著（p＜0.05），合成能力最強(qiáng)的啤酒酵母細(xì)胞壁甘露聚糖含量最高可達(dá)0.62g/L發(fā)酵液，而合成能力最弱的畢赤酵母僅為0.47g/L發(fā)酵液。四種酵母的甘露聚糖最大釋放量均出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長中期，并且不同類型酵母釋放效率差異較大，最高值畢赤酵母甘露聚糖釋放量達(dá)到了0.27g/L發(fā)酵液，最低值啤酒酵母僅有0.15g/L發(fā)酵液。乙醇顯著刺激四種酵母的甘露聚糖釋放（p＜0.05），其中對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母的影響最顯著且在5%乙醇濃度下，與對(duì)照相比，其甘露聚糖釋放量和釋放率分別大幅提高了152%和120%。

酵母，甘露聚糖，合成，釋放

酵母甘露聚糖是酵母細(xì)胞壁外包被的一層具有生物活性的多糖聚合物，其主鏈由甘露糖以α-（1，6）糖苷鍵形成的糖鏈組成，主鏈上連有豐富的由α-1，2或α-1，3連接的支鏈［1-2］。通常酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)類似于三明治，外層為甘露聚糖，內(nèi)層為β-葡聚糖，內(nèi)外兩層細(xì)胞壁多糖均以共價(jià)鍵的形式與中間夾層的蛋白質(zhì)分子相連。目前市售的甘露聚糖產(chǎn)品通常是由5%～20%蛋白質(zhì)，80%～90%甘露糖組成，因此又稱之為甘露聚糖蛋白［3-6］。

酵母甘露聚糖是迄今發(fā)現(xiàn)的免疫功能最強(qiáng)的細(xì)胞壁多糖，它能顯著增加機(jī)體免疫力，刺激腸道益生菌生長、抑制和減少病原菌滋生，并具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等活性功能，是一種極具潛力的功能性食品與飼用添加劑［7-10］。另外，在葡萄酒釀造過程中，添加酵母甘露聚糖對(duì)酒的口感、香氣、色澤以及整體結(jié)構(gòu)有很好的改善作用［11-13］。

鑒于顯著的生物活性和廣泛的應(yīng)用前景，酵母甘露聚糖制備成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，而掌握酵母甘露聚糖的合成與釋放的規(guī)律，是合理構(gòu)建制備工藝的前提。酵母在液態(tài)培養(yǎng)過程中，細(xì)胞壁多糖-甘露聚糖合成與釋放的特性鮮有報(bào)道。鑒于此，本文選取廣泛應(yīng)用于食品與飼料工業(yè)的產(chǎn)朊假絲酵母、畢赤酵母、面包酵母和啤酒酵母四種菌株作為研究對(duì)象，系統(tǒng)比較其酵母甘露聚糖合成與釋放的異同點(diǎn)，從中發(fā)掘共性規(guī)律，為后續(xù)制備工藝提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）、面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）、畢赤酵母（pichia pastoris）和啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心提供；蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂粉購自上海國藥集團(tuán)，BR級(jí)；硫酸、氫氧化鈉、碳酸鋇、葡萄糖購自天津江天化工技術(shù)有限公司，分析純；甘露糖購自Sigma，色譜純。

1220分析型高效液相色譜儀美國安捷倫科技有限公司；液相色譜柱Sugar-Pak I沃特世公司；752型紫外分光光度計(jì)上海光譜儀有限公司；ZWY-1102型雙層恒溫?fù)u床上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YXQ-LS-18SI型自動(dòng)手提式滅菌器上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；XS-18型光學(xué)顯微鏡北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸膏20，自然pH，瓊脂20；種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸膏20，自然pH；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖12，蛋白胨2，無水硫酸鎂0.5，K2HPO40.3，KH2PO40.3，尿素2，自然pH。

1.2.2培養(yǎng)方法

1.2.2.1種子培養(yǎng)將1～2環(huán)斜面酵母培養(yǎng)物接種至裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，溫度30℃，培養(yǎng)8～10h。

1.2.2.2發(fā)酵培養(yǎng)500mL三角瓶添加發(fā)酵培養(yǎng)基體積為100mL，接種量為10%，置于溫度為30℃轉(zhuǎn)速為180r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)器中，培養(yǎng)3d。

1.2.3發(fā)酵液預(yù)處理取1mL發(fā)酵培養(yǎng)液，8000r/min離心10min，吸取0.1mL上清液，加入3mL的4mol/L硫酸100℃水解10h，甘露聚糖被降解為甘露糖，然后加入過量的碳酸鋇中和，離心取上清液，定容至10mL，0.2μm膜過濾，得到濾液1備用；發(fā)酵液離心得到的菌體沉淀物采用與上清液相同方式的處理后，得到濾液2備用。

1.2.4甘露聚糖濃度測定以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC法測定濾液1和濾液2的甘露聚糖濃度，采用沃特世公司Sugar-Pak I色譜柱，示差折光檢測器（RID）檢測，流動(dòng)相為純水，流速0.5mL/min，進(jìn)樣量20μL，柱溫80℃。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=362583x-467.26（R2= 0.9998）。

1.2.5菌體干重測定取1mL發(fā)酵培養(yǎng)液，8000r/min離心10min，離心的發(fā)酵液沉淀物在80℃烘箱中烘干至恒重為菌體干重。

1.2.6酵母細(xì)胞壁甘露聚糖含量的測算酵母細(xì)胞壁甘露聚糖含量定義為每毫升發(fā)酵液離心菌體沉淀中甘露聚糖的濃度，用M1表征。酵母細(xì)胞壁甘露聚糖含量M1=濾液2甘露聚糖濃度×體積稀釋倍數(shù)，其中濾液2按1.2.3所述方法獲得，甘露聚糖濃度按1.2.4方法測定。

1.2.7酵母甘露聚糖釋放的測算甘露聚糖釋放量定義為每毫升發(fā)酵液離心上清中甘露聚糖的濃度，用M2表征。甘露聚糖釋放量M2=濾液1甘露聚糖濃度×體積稀釋倍數(shù)，其中濾液1由1.2.3所述方法獲得，甘露聚糖濃度由1.2.4方法測定。

2　結(jié)果與討論

2.1四種酵母細(xì)胞壁甘露聚糖含量與生長的關(guān)聯(lián)性

酵母菌產(chǎn)朊假絲酵母、畢赤酵母、面包酵母和啤酒酵母的生長過程曲線如圖1所示。從圖1可以看出，四種酵母生長過程曲線的整體趨勢基本一致：0～6h處于適應(yīng)期，而6～20h是典型的對(duì)數(shù)生長期，菌體生長迅速，20h之后菌體生長速度開始明顯減緩，第45h后，菌體生長開始停止，菌體濃度呈穩(wěn)定或下降趨勢。四種酵母在生長速率以及最大菌體濃度上存在差異，啤酒酵母最終菌體濃度達(dá)到5.6g/L，而畢赤酵母最大菌體濃度只有3.9g/L。

圖1　不同類型酵母的生長過程曲線Fig.1　Growth curve of different yeasts

圖2為酵母液態(tài)培養(yǎng)過程中細(xì)胞壁甘露聚糖含量的變化趨勢，從圖中可以看出，不同類型酵母細(xì)胞甘露聚糖含量在生長過程中的變化趨勢基本與菌體濃度的變化一致。畢赤酵母細(xì)胞甘露聚糖含量最低，菌體細(xì)胞中最終含有的甘露聚糖的僅為0.47g/L發(fā)酵液；啤酒酵母甘露聚糖含量最高，甘露聚糖含量最終達(dá)到了0.62g/L發(fā)酵液，比前者高出32%。綜合圖1和圖2的結(jié)果，可以看出四種酵母合成甘露聚糖的過程均與菌體生長緊密偶聯(lián)。

劉媛媛等利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立了酵母甘露聚糖合成的發(fā)酵過程數(shù)學(xué)模型，通過模型預(yù)測得出：酵母的細(xì)胞壁甘露聚糖含量在對(duì)數(shù)期快速積累，之后基本處于停滯狀態(tài)，這一趨勢與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符，進(jìn)一步印證了甘露聚糖合成與菌體生長的關(guān)聯(lián)性［14］。

圖2　不同類型酵母細(xì)胞壁甘露聚糖含量的變化Fig.2　Changes of mannan content in different types of yeasts

2.2四種酵母培養(yǎng)液中甘露聚糖的釋放特性

圖3所示的四種酵母培養(yǎng)液中甘露聚糖釋放量的變化。整體趨勢顯示出較大的波動(dòng)性，四種酵母在第12h一致出現(xiàn)一個(gè)波峰，但不同類型的酵母峰值差異顯著（p＜0.05），最高值畢赤酵母甘露聚糖釋放量達(dá)到了0.27g/L發(fā)酵液，最低值啤酒酵母甘露聚糖釋放量僅有0.15g/L發(fā)酵液。緊接著大約在20～45h范圍不同類型酵母甘露聚糖釋放量先后出現(xiàn)波谷，數(shù)值范圍從0.07～0.17g/L不等。在此波谷之后，不同類型酵母甘露聚糖釋放量出現(xiàn)不同幅度的回升。將圖3與圖2數(shù)據(jù)綜合計(jì)算，可得到酵母甘露聚糖釋放率，最高值畢赤酵母甘露聚糖釋放率達(dá)到了47.5%，意味著接近一半的甘露聚糖同細(xì)胞壁脫離，釋放到發(fā)酵液中。

圖3　不同類型酵母甘露聚糖釋放量的變化Fig.3　Changes of releasing amount of mannan in different types of yeasts

甘露聚糖在酵母培養(yǎng)過程中的釋放呈現(xiàn)一定規(guī)律的波動(dòng)性，不同類型酵母甘露聚糖釋放的最大峰值均出現(xiàn)在對(duì)數(shù)中期12h左右，此時(shí)間點(diǎn)正處于菌體生長速率增加最為顯著的階段，四種酵母的比生長速率此刻基本都處于最高水平，意味著該時(shí)間點(diǎn)是酵母細(xì)胞出芽繁殖速率最快的時(shí)刻。酵母在出芽生殖過程中，子代細(xì)胞從母體細(xì)胞內(nèi)部的出芽需要貫穿突破細(xì)胞壁，為減少出芽的阻力，細(xì)胞壁在此階段釋放大量細(xì)胞壁多糖，使厚實(shí)致密的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變輕薄疏松，從而使酵母的芽殖得以順利進(jìn)行［15］。酵母的這一生理特征可以說明甘露聚糖釋放的峰值出現(xiàn)在出芽生殖最為劇烈的對(duì)數(shù)中期的原因，在該時(shí)間節(jié)點(diǎn)，甘露聚糖的最高釋放率接近50%。

圖4　乙醇對(duì)不同類型酵母甘露聚糖釋放的影響Fig.4　Effect of alcohol on the mannan release in different types of yeast

2.3乙醇對(duì)四種酵母甘露聚糖釋放的影響

目前關(guān)于酵母甘露聚糖的釋放的報(bào)道大部分集中于葡萄酒釀造的研究中，甘露聚糖的釋放伴隨釀酒過程的進(jìn)行，為了研究乙醇是否會(huì)對(duì)甘露聚糖的釋放產(chǎn)生影響，本文進(jìn)一步考察了乙醇對(duì)不同類型酵母甘露聚糖釋放的影響。

用初始培養(yǎng)基乙醇分別為0、5%、10%、15%四個(gè)濃度梯度進(jìn)行培養(yǎng)，以對(duì)數(shù)中期甘露聚糖釋放量和釋放率為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)測，結(jié)果如圖4所示。乙醇對(duì)四種酵母甘露聚糖的釋放率和釋放量均有不同程度的促進(jìn)作用。產(chǎn)朊假絲酵母在5%乙醇濃度下，釋放量和釋放率最高，分別從空白對(duì)照的0.17g/L發(fā)酵液和24.7%提高到0.43g/L發(fā)酵液和53.7%，大幅提高了152%和120%，這說明乙醇對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母甘露聚糖的促釋放效果十分顯著（p＜0.05）（圖4A）；而畢赤酵母在10%的乙醇濃度下，釋放量和釋放率最高，分別達(dá)到了0.513g/L和64.3%，比對(duì)照提高了95%和35%（圖4B）。乙醇對(duì)于面包酵母的釋放效果影響明顯不如前兩種酵母，釋放量和釋放率最大提高幅度分別僅為18.3%和22.4%（圖4C）。當(dāng)乙醇濃度5%時(shí)，啤酒酵母甘露聚糖的釋放量最大，達(dá)到了0.29g/L，比對(duì)照提高了92.1%，當(dāng)乙醇濃度10%時(shí)，啤酒酵母甘露聚糖的釋放率最大，達(dá)到了41.7%，比對(duì)照提高了68.1%（圖4D）。

3　結(jié)論

不同類型酵母合成甘露聚糖的過程與菌體生長緊密偶聯(lián)，總體變化趨勢平穩(wěn)。不同類型酵母釋放甘露聚糖的釋放的最大峰值均出現(xiàn)在對(duì)數(shù)中期即酵母細(xì)胞出芽繁殖最為旺盛的時(shí)間節(jié)點(diǎn)上，最高釋放率接近50%。培養(yǎng)體系中5%～10%濃度的乙醇對(duì)四種酵母細(xì)胞壁甘露聚糖的釋放均有顯著促進(jìn)作用（p＜0.05）。

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Comparation on synthesis and release of mannan in four yeasts

LIU Jin-long1，2，NI Jing-yue1，ZHAO Guo-qun1，2，*，LI Zhi-min1
（1.Research Center for Fermentation Engineering of Hebei，Shijiazhuang 050000，China；2.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050000，China）

The synthesis and release rules of mannan on cell walls was compared during the cultivation process of candida utilis，pichia pastoris，bread yeast and beer yeast in this research.It was found that the syntheses of mannan in these four yeasts were all growth coupling type.Synthetic ability of mannan in different types of yeast were significantly different（p＜0.05）.The synthetic ability of mannan in beer yeast，which had the strongest synthetic ability among these four yeasts，was 0.62g/L fermentation broth，while that in pichia pastoris was only 0.47g/L fermentation broth.It was indicated that all the maximal releasing rates of mannan in four kinds of yeasts appeared in the middle period of logarithmic growth and the maximal releasing rates of mannan in different types of yeasts differed significantly，i.e.，the maximal releasing amount of mannan in pichia pastoris，which was highest among these four kinds of yeasts，reached to 0.27g/L fermentation broth，while the maximal releasing amount of manna in beer yeast，which was the lowest among these four kinds of yeasts，was only 0.15g/L fermentation broth.It was showed that alcohol significantly stimulated the releasing of mannan in four kinds of yeasts（p＜0.05）.Candida utilis in the alcohol with a concentration of 5%was affected most significantly.The releasing amount and releasing rate of mannan in it were respectively increased by 152%and 120%as compared with the control（p＜0.05）.

yeast；mannan；synthesis；release

TS201.3

A

1002-0306（2015）02-0199-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.034

2014－05－21

劉金龍（1980-），男，博士研究生，講師，主要從事微生物多糖與農(nóng)用微生物菌劑的研究與開發(fā)。

趙國群（1963-），男，博士研究生，教授，主要從事生化工程方面的研究。