LEA-motif對(duì)胰島素在低溫干燥過(guò)程中活性保護(hù)的研究

張　燕，李代禧，*，郭柏松，翟　振，劉　立，楊春生，余華星（.上海理工大學(xué)食品科學(xué)與工程研究所，上海00093；.上海東富龍科技股份有限公司，凍干工藝研究室，上海008）

LEA-motif對(duì)胰島素在低溫干燥過(guò)程中活性保護(hù)的研究

張燕1，李代禧1，*，郭柏松2，翟振1，劉立1，楊春生2，余華星1
（1.上海理工大學(xué)食品科學(xué)與工程研究所，上海200093；2.上海東富龍科技股份有限公司，凍干工藝研究室，上海201108）

選用LEA蛋白特征重復(fù)片段（LEA-motif）作為干燥活性保護(hù)劑，以胰島素為研究對(duì)象，研究該天熱保護(hù)劑對(duì)熱敏性胰島素的干燥保護(hù)效果和作用機(jī)理。模擬采用Gromacs軟件及Gromos96（53a6）簡(jiǎn)化原子力場(chǎng)，并采用REMD廣泛采樣分子模擬方法。研究結(jié)果表明，LEA蛋白特征重復(fù)片段對(duì)胰島素的三維活性結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)都有良好的保護(hù)作用。另外，從實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果可知，有LEA-motif保護(hù)的胰島素六聚體活性明顯提高。綜上可知，LEA蛋白特征重復(fù)片段對(duì)熱敏性蛋白藥物有良好的干燥活性保護(hù)作用。

胰島素，LEA-motif，分子模擬，干燥活性保護(hù)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，效價(jià)

胰島素（insulin）是機(jī)體內(nèi)能唯一降低血糖的激素，由51個(gè)氨基酸組成。有A、B兩條肽鏈，通過(guò)兩個(gè)二硫鍵連接起來(lái)［1］。胰島素是糖尿病患者治療的首選藥物。然而，胰島蛋白藥物在常溫下就很容易變性失活，簡(jiǎn)單的低溫冷凍干燥只能減緩其變性過(guò)程，并不能阻止熱敏性藥物的變性［2］，要想更好地保護(hù)熱敏性藥物的生物活性結(jié)構(gòu)，必須尋求一種安全有效的干燥保護(hù)劑來(lái)限制胰島素的有害熱運(yùn)動(dòng)，防止其發(fā)生變性和失活。

胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（Late embryogenesis abundant，LEA）是伴隨著脫水干燥過(guò)程產(chǎn)生的一類(lèi)低分子量、高親水性的無(wú)定型蛋白［3］，由于LEA蛋白的存在，這類(lèi)生物能迅速適應(yīng)高、低溫導(dǎo)致的極度缺水環(huán)境［4］。脫水過(guò)程中，LEA蛋白的無(wú)序部分能形成適應(yīng)其他蛋白的形狀，吸附在其他蛋白表面，形成保護(hù)層，從而防止了蛋白的脫水變性、聚集變性和受熱變性。LEA蛋白一般分為6類(lèi)，其中第3組蛋白分布更廣，同源序列為11個(gè)氨基酸的串聯(lián)重復(fù)排列，可形成親水性的α-螺旋結(jié)構(gòu)。所以對(duì)于第3組LEA蛋白及其特征重復(fù)片段研究具有重要意義。另外，實(shí)驗(yàn)室課題組以LEA蛋白［5］以及構(gòu)成LEA蛋白的氨基酸［6］為保護(hù)劑分別對(duì)胰島素的保護(hù)效果做過(guò)一定研究，研究結(jié)果表明這兩種物質(zhì)作為保護(hù)劑對(duì)胰島素在干燥過(guò)程中的活性保護(hù)效果顯著。然而，Shimizu T［7］報(bào)道，LEA蛋白的11個(gè)氨基酸特征重復(fù)片段才是LEA蛋白對(duì)植物在脅迫環(huán)境下保護(hù)作用的體現(xiàn)者。因此，本課題決定采用第3組LEA蛋白（AaVLEA1）［8］的特征重復(fù)片段（LEA-motif，LEAM）作為保護(hù)劑來(lái)研究其對(duì)熱敏性藥物胰島素在干燥過(guò)程中的活性保護(hù)效果。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

豬胰島素（1306A04） 江蘇徐州萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司；LEA蛋白特征重復(fù)片段（LT130325-LT342888，純度95.47%） 北京澤溪源生物科技有限公司；無(wú)水硫酸鈉（分析純）和乙醇胺上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；磷酸（分析純） 江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司。

高效液相色譜儀、Waters e2695分離模塊和Waters 2998光電二極管檢測(cè)器均購(gòu)自沃特世科技（上海）有限公司（Waters）；LYO-0.2型凍干機(jī)上海東富龍科技股份有限公司；XS205型稱(chēng)重天平梅特勒托利多儀器（上海）有限公司。

1.2模擬方法

胰島素采用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的晶體結(jié)構(gòu)（3inc）作為初始結(jié)構(gòu)（圖1A）。選用第三組LEA蛋白（AaVLEA1）的特征重復(fù)片段11個(gè)氨基酸序（KTAEFRDSAGE）作為胰島素的干燥活性保護(hù)劑（圖1B）。

圖1　胰島素（A）和LEAM（B）結(jié)構(gòu)Fig.1　The structures of insulin（A）and LEAM（B）

在4種不同水分含量下，研究不同數(shù)目保護(hù)劑對(duì)胰島素的干燥活性保護(hù)效果。各體系的詳細(xì)組成如表1所示。

表1　不同水分含量下胰島素體系的組成（wt%）Table 1　The composition of the insulin system at different water content（wt%）for REMD simulation

采用GROMACS軟件包［9］、Gromos96（53a6）［10］簡(jiǎn)化原子力場(chǎng)和REMD（Replica Exchange Molecular Dynamics）［11］方法在周期性邊界為10nm×10nm×10nm的NVT系綜中以2fs的步長(zhǎng)進(jìn)行分子模擬。首先將胰島素分子置于周期性盒子中心，然后在胰島素分子周?chē)鶆蛱砑颖Ｗo(hù)劑和水分子。其中，水分子采用TIP4P模型。范德華分子間相互作用和靜電相互作用的截距分別為1.4nm和1.0nm。并且每10步重建一次鄰近列表。靜電相互作用的遠(yuǎn)程修正采用PME（Particle Mesh Ewald）［12］方法。

各體系首先進(jìn)行5500步的能量最小化，以?xún)?yōu)化體系結(jié)構(gòu)。然后設(shè)定體系溫度為300K，進(jìn)行4ns的預(yù)平衡過(guò)程；預(yù)平衡結(jié)束后，再分別在280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308和310K這16種溫度下進(jìn)行10ns的平衡過(guò)程，從而獲得各對(duì)應(yīng)溫度下穩(wěn)定的胰島素體系。最后，將各溫度下平衡后的結(jié)構(gòu)作為初始構(gòu)象，再進(jìn)行50ns的REMD模擬。以上模擬過(guò)程每2ps交換1次，取最終平衡后5ns的模擬軌跡用來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

1.3凍干實(shí)驗(yàn)

運(yùn)用冷凍干燥實(shí)驗(yàn)研究LEA-motif保護(hù)劑對(duì)豬胰島素六聚體在凍干過(guò)程中的保護(hù)效果。制備實(shí)驗(yàn)用胰島素濃度為5mg/mL，再加入LEA-motif保護(hù)劑，其與胰島素六聚體的摩爾比分別為1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（即LEA-motif與胰島素單體的摩爾比為1∶0、1∶6、1∶12、1∶18、1∶24，與分子模擬的量相匹配）。

采用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥實(shí)驗(yàn)。首先將藥物在-45℃預(yù)凍1h，從而完成冷凍過(guò)程；然后抽真空，一次干燥溫度-35℃，干燥室內(nèi)真空度為0mBar，干燥18h。解析干燥溫度為25℃，直至干燥過(guò)程結(jié)束，這個(gè)過(guò)程共持續(xù)6h。凍干結(jié)束后，用橡皮塞封玻璃瓶，將凍干后的胰島素保存于冰箱中。

1.4效價(jià)測(cè)定

用十八烷基硅烷鍵合硅膠做為填充劑（4.6mm× 250mm，5μm，Waters e2695）；以0.2mol/L硫酸鹽緩沖液（取無(wú)水硫酸鈉28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7mL，乙醇胺調(diào)節(jié)pH至2.3，加水至1000mL）-乙腈（74∶26）為流動(dòng)相；柱溫為40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm；流速1mL/min。凍干胰島素固體用0.01mol/L鹽酸溶液復(fù)溶，制成40U/mL的溶液，注入液相色譜儀20μL，記錄色譜圖；另取未凍干胰島素原液適量為對(duì)照，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算效價(jià)［13］。

2　結(jié)果與分析

2.1干燥前后胰島素三維結(jié)構(gòu)的變化

在藥物凍干實(shí)驗(yàn)中，干燥蛋白藥物的水分含量一般要求在2%［14］左右。因此，我們重點(diǎn)分析水分含量在2%附近的胰島素樣品的干燥情況。沒(méi)有添加任何保護(hù)劑和添加了一定量LEA-motif的干燥胰島素的三維結(jié)構(gòu)如圖2所示。

從圖2中的結(jié)果可以看出，沒(méi)有LEA蛋白特征重復(fù)片段保護(hù)的胰島素樣品，干燥后，整體結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，許多疏水殘基外翻暴露于胰島素單體的分子表面，α-螺旋明顯減少，并大部分轉(zhuǎn)化為無(wú)規(guī)則卷曲和β-扭轉(zhuǎn)，三維結(jié)構(gòu)徹底變形，而且這種變性趨勢(shì)隨著干燥程度的增加而增加，這樣嚴(yán)重變性的胰島素即使在水溶液中也不可能恢復(fù)到初始三維活性結(jié)構(gòu)。然而，添加保護(hù)劑的胰島素的三維活性結(jié)構(gòu)得到了較好的保持，從4種保護(hù)情況來(lái)看，添加6條LEA-motif保護(hù)劑，胰島素三維活性結(jié)構(gòu)也略微發(fā)生了變性，α-螺旋有所減少，這由于添加的保護(hù)劑數(shù)量不足，在干燥過(guò)程中無(wú)法使胰島素得到很好的保護(hù)，但相對(duì)未加任何保護(hù)劑的胰島素而言，添加6條LEA-motif對(duì)胰島素活性結(jié)構(gòu)有一定的保護(hù)效果。然而，添加12、18和24條LEA-motif保護(hù)劑，干燥后的胰島素樣品在整體結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)上都被保護(hù)的較好，尤其添加24條LEA-motif，其胰島素活性結(jié)構(gòu)與初始結(jié)構(gòu)相比沒(méi)有明顯區(qū)別。從以上結(jié)果可以看出，LEA蛋白特征重復(fù)片段對(duì)胰島素的生物活性保護(hù)是顯而易見(jiàn)的。

圖2　干燥后的胰島素的三維結(jié)構(gòu)比較Fig.2　3D structures of dried insulin

2.2胰島素干燥前后的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

圖3中橫坐標(biāo)為添加了不同數(shù)目的LEA-motif保護(hù)劑的胰島素和初始胰島素模型，縱坐標(biāo)為α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲的數(shù)目。從圖3中可以看出，未加任何保護(hù)劑的胰島素α-螺旋數(shù)目（如圖3A）顯著減少，而β-轉(zhuǎn)角卻急劇增加（圖3B），說(shuō)明胰島素二級(jí)結(jié)構(gòu)在干燥過(guò)程中發(fā)生了嚴(yán)重變性，大部分α-螺旋轉(zhuǎn)變成β-轉(zhuǎn)角，胰島素明顯發(fā)生變形。然而，添加LEA-motif的胰島素在干燥過(guò)程中α-螺旋的數(shù)目幾乎保持不變，β-轉(zhuǎn)角雖有增加，但明顯低于未加任何保護(hù)劑的胰島素體系（圖3B），該結(jié)果與圖2中的三維活性結(jié)構(gòu)圖一致。說(shuō)明LEA-motif對(duì)胰島素在干燥過(guò)程中的二級(jí)結(jié)構(gòu)也有較好的保護(hù)效果。從圖3可以看出，添加24條LEA-motif的胰島素α-螺旋在不同水分含量下保持的最穩(wěn)定，二級(jí)結(jié)構(gòu)維持最佳。綜合α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角數(shù)目的變化趨勢(shì)圖，隨著干燥程度的增加，α-螺旋數(shù)目減少，而β-轉(zhuǎn)角有所遞增，說(shuō)明胰島素并不是越干越好，而是有一個(gè)最佳的水分含量范圍。胰島素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定，如果偏離了這個(gè)水分含量，都會(huì)引起一定程度的變性。

圖3　有/無(wú)LEAM保護(hù)下干燥的胰島素中的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化柱狀圖Fig.3　Secondary structure of insulin with/without LEAM protectants

2.3胰島素體系內(nèi)的氫鍵分析

保護(hù)劑對(duì)蛋白藥物的保護(hù)作用主要是通過(guò)分子間相互作用實(shí)現(xiàn)的。其中，氫鍵相互作用是主要的分子間相互作用。在干燥過(guò)程中，隨著水分含量的減少，保護(hù)劑與胰島素之間形成的氫鍵增多（圖4A），說(shuō)明LEA-motif能迅速適應(yīng)缺水環(huán)境，形成適應(yīng)胰島蛋白的形狀，較好地吸附在其表面，形成保護(hù)層，保護(hù)胰島素不因缺水而受到傷害，很好地維持胰島素的活性結(jié)構(gòu)，這與水替代學(xué)說(shuō)基本一致［15］。再者，蛋白質(zhì)多肽主鏈中形成的氫鍵決定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，有LEA-motif保護(hù)的胰島素主鏈間的氫鍵數(shù)目相對(duì)比較穩(wěn)定，且比未加任何保護(hù)劑的胰島素主鏈間形成的氫鍵數(shù)目多（圖4B），主鏈間穩(wěn)定的氫鍵可以保護(hù)胰島素的二級(jí)結(jié)構(gòu)不被破壞，更說(shuō)明LEA蛋白特征重復(fù)片段能維持三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

圖4　胰島素體系內(nèi)氫鍵數(shù)目柱形圖Fig.4　H-bonding number of insulin system

2.4效價(jià)分析

有文獻(xiàn)［16］表明，胰島素的效價(jià)測(cè)定可采用HPLC，通過(guò)峰面積計(jì)算得到。所以本文通過(guò)HPLC測(cè)定效價(jià)，從而分析胰島素凍干前后的活性變化。

在分子模擬研究中，采用胰島素單體，而在本驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，采用豬胰島素六聚體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究LEA-motif在干燥過(guò)程中對(duì)胰島素的保護(hù)效果。這主要是因?yàn)樨i胰島素在制備過(guò)程中，利用鋅離子沉淀法使胰島素形成六聚體，可避免胰島素一定程度的失活，保證高產(chǎn)，然而，若模擬采用六聚體的話，體系分子量太大，且計(jì)算耗費(fèi)時(shí)間太長(zhǎng)。另外更重要的是，LEA-motif對(duì)胰島素六聚體在凍干過(guò)程中的活性保護(hù)效果良好的話，那我們完全可以推論，LEA-motif對(duì)胰島素單體有更好的保護(hù)效果，與模擬結(jié)果一致。

表2　不同濃度保護(hù)劑的熱敏性藥物胰島素凍干前后生物活性變化情況Table 2　Results of potency of initial/dried insulin with/without LEA-motif

表2是未加保護(hù)劑的胰島素六聚體和添加1、2、3、4條LEA-motif的胰島素六聚體各體系（即胰島素單體與LEA-motif的摩爾比分別為1∶6、1∶12、1∶18、1∶24，與模擬一致）的3次平行實(shí)驗(yàn)所得的峰面積和效價(jià)平均值，峰面積大小反應(yīng)了胰島素六聚體干燥后的活性結(jié)構(gòu)保護(hù)效果。然后根據(jù)表3中的峰面積大小計(jì)算胰島素在干燥前后的生物活性變化，如圖5所示。

圖5　添加LEAM的胰島素與未加保護(hù)劑的胰島素凍干后的活性變化Fig.5　Bioactivity of dried insulin with/without LEAM

從圖5可知，凍干后胰島素的效價(jià)均有所降低，說(shuō)明胰島素在凍干過(guò)程中，受溫度和水分的影響，結(jié)構(gòu)有輕微的變化。因?yàn)槲覀儗?shí)驗(yàn)用的胰島素是六聚體，與模擬采用的胰島素單體不同，所以實(shí)驗(yàn)所用胰島素在凍干前后的結(jié)構(gòu)變化程度與模擬得到的結(jié)果有一定的區(qū)別，但是，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，胰島素在凍干前后還是有一定的結(jié)構(gòu)變化的。對(duì)于未加保護(hù)劑的胰島素而言，模擬用的胰島素單體在干燥前后結(jié)構(gòu)有顯著變化，活性完全喪失；在凍干實(shí)驗(yàn)中，未加保護(hù)劑的胰島素凍干后效價(jià)降低了12%左右。然而，當(dāng)添加了保護(hù)劑后，豬胰島素的效價(jià)比明顯提高了。這說(shuō)明在凍干過(guò)程中，LEA-motif對(duì)胰島素的保護(hù)效果是顯而易見(jiàn)的。不論是對(duì)胰島素六聚體還是單體，LEA-motif都體現(xiàn)出良好的保護(hù)效果。

另外，圖中顯示，隨著LEA-motif濃度的增加，胰島素的效價(jià)有增加趨勢(shì)，當(dāng)濃度達(dá)到1∶3條件下，胰島素的效價(jià)達(dá)到最高，此后隨著濃度的增加，胰島素效價(jià)值趨于平穩(wěn)。說(shuō)明胰島素進(jìn)行冷凍干燥，并不是加越多的保護(hù)劑效果越好，應(yīng)該適量的添加保護(hù)劑濃度，節(jié)約成本，并且又能很好地使胰島素活性結(jié)構(gòu)得到保護(hù)。

3　結(jié)論

從分子模擬分析結(jié)果可知，LEA-motif在干燥過(guò)程中能有效限制胰島素的有害熱運(yùn)動(dòng)，很好的保護(hù)其生物活性結(jié)構(gòu)。并且添加保護(hù)劑的胰島素的二級(jí)結(jié)構(gòu)也得到了很好的保持，防止α-螺旋轉(zhuǎn)化為β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲，說(shuō)明添加保護(hù)劑的胰島素具有較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。這主要是由于隨著水分含量的減少，LEA-motif逐漸取代水分子與胰島素形成氫鍵，形成適應(yīng)胰島蛋白的形狀，吸附在胰島素表面，形成保護(hù)層，防止疏水基團(tuán)外翻，保護(hù)了胰島素的活性結(jié)構(gòu)。氫鍵及靜電相互作用對(duì)胰島素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起到了非常重要的作用。另外，從效價(jià)測(cè)定實(shí)驗(yàn)也可以看出，與未加保護(hù)劑的胰島素相比，有LEA-motif保護(hù)的胰島素六聚體凍干后活性更好，更說(shuō)明LEA-motif確實(shí)對(duì)胰島素具有良好的保護(hù)效果?？傊?，LEA-motif是一種有效的凍干保護(hù)劑。

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Investigation on bioactive protection of LEA-motif to insulin during desiccation

ZHANG Yan1，LI Dai-xi1，*，GUO Bai-song2，ZHAI Zhen1，LIU Li1，YANG Chun-sheng2，YU Hua-xing1
（1.Institute of Food Science and Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China；2.Lyophilization Lab，Shanghai Tofflon Science and Technology Co.，Ltd.，Shanghai 201108，China）

In the paper，insulin was taken as the model of heat-sensitive drugs，and LEA-motif as the bioactive protectant.Gromacs software with Gromos96（53a6）forcefield was adopted to investigate the LEA-motif protective effects on insulin by REMD molecular simulation method.Results showed a significant protective effect on 3D structure and secondary structure of insulin with the presence of LEA-motif.In addition，the potency experiment by HPLC showed the bioactivity of the rehydrated insulin with LEA-motif was higher than that of the rehydrated insulin without any protectant.In a word，LEA-motif had shown its great application value as a drying protectant for heat-sensitive protein drugs.

insulin；LEA-motif；molecular simulation；bioactive protection of desiccation；structure stability；potency

TS201.2

A

1002-0306（2015）02-0177-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.029

2014－04－14

張燕（1988-），女，碩士研究生，研究方向：熱敏性藥物的凍干保護(hù)。

李代禧（1975-），男，博士，副教授，研究方向：計(jì)算生物學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金（51076108）；上海市國(guó)際合作項(xiàng)目（12430702000）；上海市自然科學(xué)基金（12ZR1420400）；上海市聯(lián)盟計(jì)劃項(xiàng)目及上海市重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目（T0503和P0502）。