黑米花色苷的分離純化及其抗氧化性的研究

王巧娥，謝　丹，錢　潔，任海毅，董銀卯（.北京工商大學(xué)理學(xué)院/北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京00048；.天津科技大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，天津300457）

黑米花色苷的分離純化及其抗氧化性的研究

王巧娥1，謝丹1，錢潔2，任海毅1，董銀卯1
（1.北京工商大學(xué)理學(xué)院/北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京100048；2.天津科技大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，天津300457）

對黑米花色苷進行分離純化并研究不同部分的抗氧化活性。首先采用溶劑萃取的方法將黑米花色苷粗提取物依極性大小分成石油醚可溶部位、乙酸乙酯可溶部位、正丁醇可溶部位和水可溶部位，并對各部位清除2，2-二苯基-1-苦味肼基自由基（DPPH·）和羥基自由基（·OH）的活性進行了分析，確定了抗氧化能力最強的組分是水可溶部分。其次用大孔樹脂柱層析的方法對水可溶部位進行了細分，得到C1、C2、C3、C4、C5五個組分，并對各組分清除DPPH·和·OH的活性進行了分析，確定了各組分抗氧化能力從大到小依次為：C2＞C3＞C4＞C1＞C5。研究發(fā)現(xiàn)，黑米花色苷水可溶部位中20%～40%乙醇洗脫的部分（C2、C3）具有更強的抗氧化活性。

花色苷，黑米，溶劑萃取，柱層析，抗氧化

近年來，活性氧和自由基的研究成為現(xiàn)代生命科學(xué)的前沿和熱點［1］，作為天然的抗氧化劑，花色苷類化合物被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥［2-4］、食品、化妝品、電化學(xué)等很多領(lǐng)域［5-6］。黑米花色苷屬黃酮多酚類物質(zhì)，是由花青素與一個或多個葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等通過糖苷鍵結(jié)合形成的糖苷，主要包括錦葵素、天竺葵-3，5-二葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷（其結(jié)構(gòu)見圖1），一般是幾種花色苷并存［7］。研究表明，黑米花色苷具有很強的抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗過敏、降血脂等多種功能，而且其生物活性因其B環(huán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同而存在一定的差異［8］，這就需要對黑米中花色苷的單體組成進行明確并深入研究其抗氧化活性等生理功能。

目前，有關(guān)黑米花色苷的研究多集中于黑米花色苷的提取方法。Toshio K等［9］用純水提取黑米花色苷，建立了用提取液在可見光區(qū)的最大吸收強度檢測提取液黑米花色苷濃度的新方法；發(fā)現(xiàn)黑米花色苷的提取率與提取溫度呈正線性相關(guān)。陳小全等［10］采用有機溶劑浸泡法和超聲波輔助技術(shù)從黑米中提取色素，比較發(fā)現(xiàn)超聲波作用下能夠縮短提取時間，降低提取溫度。張吉祥等［11］采用正交實驗法，研究超聲波功率、浸提時間、浸提劑體積分數(shù)及料液比對黑米色素提取率的影響，優(yōu)化了黑米花色苷的最佳超聲輔助提取工藝。然而目前對黑米花色苷的分離純化方法的研究較少，對其抗氧化活性的研究也不深入。本文按照極性大小對黑米花色苷進行萃取分部，比較各部分的體外抗氧化效果，并對抗氧化活性最強的部分進一步分離純化，比較每一組分的體外抗氧化活性，對黑米花色苷的開發(fā)和綜合利用有重要的指導(dǎo)意義。

圖1　四種黑米花色苷結(jié)構(gòu)圖Fig.1　The constitutional formula of anthocyanins from black rice

1　材料與方法

1.1材料與儀器

AB-8型大孔吸附樹脂北京慧德易科技有限責(zé)任公司；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、維生素C、DPPH、七水合硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、鹽酸、氫氧化鈉等試劑均為常用分析純；去離子水、超純水均為自制；黑米花色苷粗提物參考張志輝等［12］的方法，取一定量粉碎、過篩后的黑米粉于燒瓶中，以料液比1∶8加入70%乙醇溶液（pH2～3），在溫度50℃、功率70W時，超聲波提取30min。提取液過濾后50℃減壓濃縮，冷凍干燥后冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；Advantage-ES冷凍干燥機美國VIRTIS公司；BSA124S分析天平SARTORIUS公司；UV2300紫外分光光度儀上海天美科學(xué)儀器有限公司；LIH-SI-NI電熱恒溫水浴鍋北京長安科技儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1黑米花色苷的溶劑萃取分級取一定量黑米花色苷粗提物，用200mL水溶解后置于500mL分液漏斗中，加入200mL石油醚萃取3次脫脂［7］。

脫脂后的花色苷（水相）置于500mL分液漏斗中，加入200mL乙酸乙酯，振搖，靜置，待溶液完全分層后，分相。用同法再萃取2次，收集并合并3次乙酸乙酯相，35℃減壓濃縮，冷凍干燥，得到紫色粉末，為黑米花色苷乙酸乙酯可溶部位。

乙酸乙酯萃取剩余后的水溶液，按上述同樣的方法用正丁醇萃取3次，將上層的正丁醇萃取液合并，減壓濃縮，冷凍干燥，得到深紫色粉末，為黑米花色苷正丁醇部位。正丁醇萃取后的剩余水溶液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到深紫色粉末，為黑米花色苷水可溶部位。

1.2.2主活性部分的大孔樹脂柱層析分離［13-14］

1.2.2.1裝柱與預(yù)處理取柱體積為250mL的大孔樹脂于事先裝有去離子水的敞口容器中，使去離子水高于樹脂層2～3cm，浸泡過夜，待樹脂充分溶脹后濕法裝柱。裝好的大孔樹脂柱首先用2BV 95%乙醇以2BV/h的流速通過樹脂層，浸泡過夜，第2d用95%乙醇以2BV/h的流速通過樹脂層，洗至流出液加水不呈白色渾濁，用去離子水以2BV/h的流速洗凈乙醇；其次用2BV 4%鹽酸溶液以5BV/h的流速通過樹脂層，浸泡3h后用去離子水洗至出水pH中性；再次用2.5BV 5%NaOH溶液以5BV/h的流速通過樹脂層，浸泡3h后用去離子水洗至出水pH為中性。

1.2.2.2上樣采用干法上樣。將黑米花色苷水可溶部位粉末用少量去離子水溶解后加入少量大孔樹脂，拌勻，靜置，將帶有樣品的大孔樹脂加到柱子頂層。

1.2.2.3洗脫依次用2～3BV去離子水、20%乙醇溶液、40%乙醇溶液、60%乙醇溶液、80%乙醇溶液以2BV/H的流速洗脫，收集洗脫液。

1.2.2.4洗脫液的處理5種洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，濃縮液冷凍干燥，得到水可溶部位5種洗脫液的花色苷固體粉末，依次標(biāo)記為C1、C2、C3、C4、C5，密閉保存，備用。

1.2.3抗氧化能力的測定

1.2.3.1DPPH法測定不同極性部位和水可溶部位不同組分的抗氧化能力將黑米花色苷乙酸乙酯、正丁醇和水可溶部位以及水可溶部位大孔樹脂分離后得到的C1～C55個組分分別配成適當(dāng)濃度梯度的溶液，在517nm下檢測其清除DPPH·的能力，繪制DPPH·清除率對抗氧化劑濃度曲線，并計算出IC50的值，比較不同部位和組分的抗氧化能力，確定清除DPPH·能力最強的部位。用維生素C作為陽性對照，具體實驗方法見文獻［15-16］。

1.2.3.2·OH法測定不同極性部位的抗氧化能力將黑米花色苷乙酸乙酯、正丁醇和水可溶部位以及水可溶部位大孔樹脂分離后得到的C1～C55個組分分別配成相同濃度梯度的溶液，依次加入所需試劑，在510nm下檢測其清除羥基自由基（·OH）的能力，繪制·OH清除率對抗氧化劑濃度曲線，比較不同部位和組分的抗氧化能力。用維生素C作為陽性對照，具體實驗方法見文獻［17-18］。

2　結(jié)果與討論

2.1不同極性部位的抗氧化能力

體外的抗氧化活性研究［1］表明，黑米花色苷不同極性部位均具有一定的還原能力和抗氧化能力。本文通過評價其對DPPH·和·OH的清除能力，探討黑米花色苷不同極性部位的抗氧化活性。

2.1.1不同極性部位清除DPPH·的能力抗氧化劑對DPPH·自由基的淬滅能力可有效地評價其抗氧化活性，在國內(nèi)外被廣泛用于天然抗氧化劑的篩選［9］。通過清除DPPH·能力評價抗氧化活性的方法簡便、快速，同時DPPH·較長的半衰期使此方法保持了良好的重現(xiàn)性。本文即通過測試黑米花色苷不同極性部位對DPPH·的清除能力來評價其抗氧化能力［17］，并采用DPPH·清除率為50%時所需抗氧化劑的濃度，即IC50值表示待測組分對DPPH·的清除能力。通常IC50值越小，表明該物質(zhì)清除自由基的能力越強。

將冷凍干燥后的黑米花色苷乙酸乙酯、正丁醇和水可溶部位配成相同濃度梯度的溶液，以濃度（mg/mL）作為橫坐標(biāo)，DPPH·清除率（%）作為縱坐標(biāo)，繪制待測樣品DPPH·清除率對其濃度曲線（見圖2），其中維生素C為陽性對照。根據(jù)圖2，計算得出其IC50值，見圖3。

圖2　維生素C和黑米花色苷不同溶劑可溶部位清除DPPH·曲線Fig.2　The DPPH free radical scavenging lines of vitamin C and different solvent soluble fractions of anthocyanins from black rice

圖3　黑米花色苷不同溶劑可溶部位清除DPPH·自由基的IC50值Fig.3　The DPPH free radical scavenging IC50value of the different polar solvent soluble fractions

圖2和圖3的結(jié)果表明：黑米花色苷乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位均有一定的DPPH·清除能力，且其清除能力的大小均與其濃度呈正線性相關(guān)；由圖3可知，3個不同極性部位的IC50值有顯著性差異（p＜0.05），水可溶部位顯著優(yōu)于正丁醇部位和乙酸乙酯部位，黑米花色苷不同極性部位對DPPH·清除能力的大小關(guān)系為：水部位＞正丁醇部位＞乙酸乙酯部位。表明黑米花色苷中極性越大的組分，其清除DPPH·的能力越強。

2.1.2不同極性部位清除·OH的能力抗氧化劑對·OH自由基的淬滅能力可有效地評價其抗氧化活性。本文通過測試黑米花色苷不同極性部位對·OH自由基的清除能力來評價其抗氧化能力。以各部位濃度（mg/mL）作為橫坐標(biāo)，·OH自由基清除率（%）作為縱坐標(biāo)，繪制待測樣品·OH清除率對其濃度曲線見圖4。

圖4　黑米花色苷各極性部位清除·OH曲線Fig.4　The Hydroxyl radical scavenging lines of the different polar solvent soluble fractions

圖4的結(jié)果表明：黑米花色苷乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位均有清除羥自由基的活性，且各極性部位對·OH的清除能力隨著濃度升高而升高；就各極性部位清除·OH的能力而言，水可溶部位略優(yōu)于正丁醇部位，乙酸乙酯部位最差，表明黑米花色苷中極性越大的組分，其清除·OH的能力越強。這與清除DPPH·的結(jié)果一致。

綜合各部位清除DPPH·和·OH的能力，可以得出結(jié)論：不同極性黑米花色苷的抗氧化活性不同，極性越大，抗氧化能力越強；黑米花色苷不同極性部位的抗氧化活性在一定濃度范圍內(nèi)均具有劑量—效應(yīng)關(guān)系。

2.2水可溶部位各組分的抗氧化能力

2.2.1水可溶部位各組分清除DPPH·的能力將經(jīng)過大孔樹脂分離得到的C1、C2、C3、C4、C5五個組分均配制成濃度為0.04、0.05、0.0667、0.1、0.2mg/mL水溶液，以各組分濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，DPPH·清除率（%）作為縱坐標(biāo)，繪制待測樣品DPPH·清除率對其濃度曲線（見圖5）。根據(jù)圖5，計算得出其IC50值，見圖6。

圖5　黑米花色苷水可溶部位各組分清除DPPH·曲線Fig.5　The DPPH free radical scavenging lines of the parts of the black rice anthocyanin water soluble fractions

圖6　黑米花色苷水可溶部位不同組分清除DPPH·自由基的IC50值Fig.6　The DPPH free radical scavenging IC50value of the parts of the black rice anthocyanin water soluble fractions

圖5、圖6表明，黑米花色苷水可溶部位經(jīng)大孔樹脂分離得到的C1、C2、C3、C4、C5五種組分均具有DPPH自由基清除活性，且其清除率均和樣品濃度成正線性相關(guān)；C2（20%乙醇洗脫的組分）、C3（40%乙醇洗脫的組分）的抗氧化能力高于黑米花色苷水可溶部位的抗氧化能力，而C1（水洗脫的組分）、C4（60%乙醇洗脫的組分）、C5（80%乙醇洗脫的組分）的抗氧化能力則低于黑米花色苷水可溶部位的抗氧化能力，這說明20%～40%乙醇洗脫的組分抗氧化能力最強。

2.2.2水可溶部位各組分清除·OH的能力將經(jīng)過大孔樹脂分離得到C1、C2、C3、C4、C5均配制成0.2、0.25、0.333、0.5、1.0mg/mL水溶液，與FeSO4溶液和H2O2反應(yīng)生成的·OH反應(yīng)，計算不同濃度下各溶液對·OH的清除率。以溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，清除率（%）為縱坐標(biāo)，繪制C1、C2、C3、C4、C55個組分對·OH的清除率對其濃度曲線見圖7。

圖7　黑米花色苷水可溶部位AB-8樹脂分離后各組分清除·OH曲線Fig.7　The Hydroxyl radical scavenging lines of the parts of the black rice anthocyanin water soluble fractions

圖7的結(jié)果表明：黑米花色苷水可溶部位經(jīng)過AB-8大孔樹脂分離后得到的5個組分均有清除羥自由基的活性，且組分對·OH自由基的清除能力隨著濃度升高而升高；就各組分清除·OH自由基的能力而言，從大到小依次為C2＞C3＞C4＞C1＞C5，且其中C2（20%乙醇洗脫的組分）、C3（40%乙醇洗脫的組分）兩個組分對·OH自由基的清除能力大于分離前的水可溶部位，而C1（水洗脫的組分）、C4（60%乙醇洗脫的組分）、C5（80%乙醇洗脫的組分）三個組分對·OH自由基的清除能力小于分離前的水可溶部位。這說明20%～40%乙醇洗脫的組分抗氧化能力最強，與清除DPPH·的結(jié)果一致。

綜合各部位清除DPPH·和·OH的能力，可以得出結(jié)論：黑米花色苷水可溶部位經(jīng)AB-8大孔樹脂分離后得到的五個組分均具有一定的抗氧化活性，且其抗氧化能力在一定濃度范圍內(nèi)存在劑量效應(yīng)關(guān)系；不同濃度乙醇洗脫得到的各組分的抗氧化活性不同，從大到小依次為C2＞C3＞水可溶部位＞C4＞C1＞C5，這說明黑米花色苷水可溶部位中20%～40%乙醇洗脫的部分（C2、C3）具有更強的抗氧化活性。

3　結(jié)論

將黑米花色苷粗提物通過溶劑萃取按極性大小分成三個部位：乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位，通過分析各部位清除DPPH·和·OH的能力，確定抗氧化活性最高的部位為水部位。

對抗氧化活性最好的水部位，采用AB-8大孔吸附樹脂柱進一步分離純化，得到C1、C2、C3、C4、C55個組分，通過分析這五種組分清除DPPH·和·OH的能力，確定黑米花色苷水可溶部位中20%～40%乙醇洗脫的組分（C2、C3）具有更強的抗氧化活性。

經(jīng)AB-8型大孔吸附樹脂分離后并未得到黑米花色苷單體，目前作者所在的課題組正對C2、C3進行進一步的分離純化，希望得到具抗氧化活性的花色苷單體2～4種，從而為構(gòu)效關(guān)系研究及在化妝品、食品中的高附加值應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Study on separation of anthocyanins from black rice and their antioxidation

WANG Qiao-e1，XIE Dan1，QIAN Jie2，REN Hai-yi1，DONG Yin-mao1
（1.School of Sciences，Beijing Key Lab of Plant Resource Research and Development，Beijing Technology and
Business University，Beijing 100048，China；2.Faculty of Chemistry and Materials Science，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Anthocyanins from black rice were separated and their antioxidation was evaluated.Anthocyanin crude extract of black rice was separated to petroleum ether part，ethyl acetate part，n-butyl alcohol part and water soluble part by solvent extraction method.The DPPH radical and hydroxyl radical-scavenging activities were used to determine the antioxidant capacity of each part，the water soluble part was confirmed to have the most significant antioxidation.Then it was separated to five fractions which were C1，C2，C3，C4，C5by macroporous resin column chromatography method and the DPPH radical and hydroxyl radical-scavenging activities of each fraction were analyzed.The results showed that the antioxidant capacity in a descending order as：C2，C3，C4，C1，C5.Among the water soluble part，the fraction eluted by 20%～40%ethanol solution had the highest antioxidant capacity.

anthocyanin；black rice；solvent extraction；column chromatography；antioxidaion

TS210.1

A

1002-0306（2015）02-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.025

2014-04-23

王巧娥（1976-），女，博士，副教授，研究方向：天然功效成分提取、分離和活性研究。

北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助項目（2012D005003000008）。