白酒抗氧化性的初步研究

石亞林，范文來，徐　巖（江南大學生物工程學院釀酒微生物與應用酶學實驗室，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

白酒抗氧化性的初步研究

石亞林，范文來*，徐巖
（江南大學生物工程學院釀酒微生物與應用酶學實驗室，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

測定了幾種不同香型白酒的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基清除率、總的抗氧化力、還原力、金屬螯合力。結果表明：白酒具有一定的抗氧化能力，但是相比于其他酒類，其抗氧化能力較低。白酒DPPH自由基清除率平均值為7.80%±2.31%，氧化抑制率平均值為20.50%±8.08%，金屬鰲合能力平均值為1.60%±0.84%，還原能力為0.18±0.06。

白酒，抗氧化力，DPPH，還原力，金屬螯合力

白酒是我國傳統(tǒng)的蒸餾酒，也是世界七大蒸餾酒之一［1］。白酒是以淀粉或糖為原料，加入糖化發(fā)酵劑，經(jīng)固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾兌而制成的蒸餾酒［2］，在我國具有悠久的歷史。

隨著人民生活水平的不斷提高，具有抗氧化作用的營養(yǎng)素引起了人們的重視［3］。目前普遍使用的人工合成抗氧化劑二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、丁基羥基茴香醚［3（2）-tert-Butyl-4-hydroxyanisole，BHA］、沒食子酸丙酯（Propyl gallate，PG）及特丁基對苯二酚（tert-Butylhydroquinone，TBHQ）有較多的毒副作用，許多國家都相繼對其使用進行了限制［4］。因此天然抗氧化劑的研究、開發(fā)和利用尤其重要［5］。有研究者對葡萄酒［6-7］、黃酒［8］、啤酒［9］的抗氧化力進行了研究。但目前國內外對白酒的抗氧化性能研究非常少，更沒有系統(tǒng)的方法來檢測白酒的抗氧化活性。因此，本文采用4種不同的抗氧化檢測方法對白酒進行測定，最終選出一種適合衡量白酒抗氧化活性并能準確、快速、方便的檢測方法（DPPH），并對其進行優(yōu)化改良，為建立規(guī)范的白酒抗氧化活性測定方法提供技術參數(shù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、亞油酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫氰酸銨、氯化亞鐵、鹽酸均購自國藥集團化學試劑有限公司；吐溫-20、BHA、BHT、α-生育酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、Ferrozine、乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）、檸檬酸美國sigma-aldrich公司；實驗所需要的5種不同香型（醬香型、清香型、濃香型、芝麻香型和老白干香型）酒樣由各相應酒廠提供。

電熱鼓風干燥箱上海實驗儀器廠有限公司；PB2002-N電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱恒溫水浴鍋上海華連醫(yī)療器械有限公司；超聲波清洗儀德國Elma公司；UV-2802S型紫外/可見分光光度計尤尼柯（上海）儀器有限公司；Thermo酶標儀Thermo Electron Corporation。

1.2實驗方法

1.2.1DPPH自由基清除能力的測定參照Shimada等［10］的方法略作改動。配制0.1mmol/L的DPPH自由基溶液、1g/L的BHA、BHT、α-生育酚標準溶液，避光4℃保存，現(xiàn)配現(xiàn)用?？瞻妆壬苤屑尤?mL超純水，100μL待測樣品，混勻。最后向上述體系中準確加入2mL DPPH自由基溶液，充分混勻。于室溫避光靜置30min后，在517nm處測定吸光值變化。用1g/L人工合成抗氧化劑BHA、BHT、α-生育酚作為陽性對照。按下式計算清除率：

其中：A1為待測樣存在時的吸光度；A0為對照樣的吸光度。

1.2.2總抗氧化能力的測定使用亞油酸體系進行測定［11］。準確量取2.5mL K3PO4緩沖液（0.04mol/L，pH7.0）和2.5mL亞油酸乳狀液于5mL比色管中，混勻。向上述體系中加入200μL待測酒樣，充分混勻。將混合反應液放入37℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每12h取樣100μL，總共取10次。用硫氰酸鹽方法檢測反應體系的氧化程度。檢測方法：取樣品溶液100μL加入到4.7mL乙醇（75%vol）中，然后加入100μL硫氰酸銨（30%）和100μL FeCl2（濃度為20mmol/L，溶于3.5% HCl中）混勻，在500nm處測定吸光值變化。用2.5mL的K3PO4緩沖液與2.5mL的亞油酸乳狀液混合液作空白對照，用1g/L人工合成抗氧化劑BHA、BHT、α-生育酚作為陽性對照。按下式計算氧化抑制率：

其中：A1為待測酒樣存在時的吸光度；A0為對照樣的吸光度。

1.2.3還原力的測定參照Oyaizu等［12］的方法略作改動?？瞻妆壬苤屑尤?mL超純水，向其中加入200μL待測樣，再加入2.5mL磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH6.6）和2.5mL 1%鐵氰化鉀，混合體系于50℃恒溫20min。加入1mL 10%三氯乙酸，3000r/min離心分離10min。取上層清液2.5mL，加蒸餾水2.5mL和0.1% FeCl30.5mL，混合均勻。在700nm處測定吸光值變化。用1g/L人工合成抗氧化劑BHA、BHT、α-生育酚100μL作為陽性對照。

1.2.4金屬鰲合能力的測定參照Decker等［13］的方法略作改動。配制2mmol/L的FeCl2溶液、5mmol/L Ferrozine溶液，比色管中加入4.7mL超純水，再向其中加入200μL待測樣、0.1mL 2mmol/L的FeCl2、0.2mL 5mmol/L Ferrozine。將上述體系置于室溫下，反應20min，562nm處測定吸光值變化。用1mmol/L EDTA和檸檬酸作為陽性對照。按下式計算金屬螯合力：

其中：A1為待測酒樣存在時的吸光度；A0為對照樣的吸光度。

1.3數(shù)據(jù)處理

實驗中所有的數(shù)據(jù)都是經(jīng)過3個重復所得。數(shù)據(jù)采用Origin8.5統(tǒng)計軟件進行處理。

2　結果與討論

2.1DPPH自由基清除率

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的深紫色自由基，在517nm處有最大吸光值，當其從能夠釋放質子的物質處得到質子時，會形成一種穩(wěn)定的反磁性分子，其517nm處吸光值會變小。釋放質子是物質抗氧化的機理之一，通過測定物質對DPPH自由基的清除能力，可以較迅速地評價物質的抗氧化能力［14］。

從圖1可以看出，在相同條件下，100μL BHA、BHT、α-生育酚、濃香型、清香型、醬香型、芝麻香型和老白干香型白酒對DPPH的清除率分別是51.80%± 1.14%、40.20%±0.25%、66.60%±0.33%、4.10%±0.55%、9.70%±0.43%、7.10%±0.13%、5.30%±2.12%、4.40%± 2.24%，均值為7.80%±2.31%。結果表明，白酒具有一定的DPPH自由基清除能力，但是遠遠小于已知人工合成抗氧化劑，不同香型白酒的自由基清除能力順序為清香型＞醬香型＞芝麻香型＞老白干香型＞濃香型。文獻報道，葡萄酒的DPPH自由基清除率為73.80%±0.11%［7］，黃酒為45.20%±0.24%［8］，啤酒為90%±0.31%［9］，幾種酒的DPPH自由基清除率大小順序為啤酒＞葡萄酒＞黃酒＞白酒。

圖1　待測樣品對DPPH自由基的清除率Fig.1　Clearance rate of DPPH free radical activities of samples to be tested

2.2總抗氧化能力

在亞油酸的自氧化過程中會產(chǎn)生過氧化物，氧化Fe2+為Fe3+，F(xiàn)e3+與SCN-形成絡和物，于500nm處有最大吸光值。因此，吸光值越高，表明亞油酸自氧化的程度越高。加入待測酒樣后，通過硫氰酸鹽法測定的亞油酸自氧化程度的吸光值［15］。

圖2　待測樣品的總抗氧化能力Fig.2　Inhibiting percentages of samples to be tested

從圖2可以看出，100μL BHA、α-生育酚、濃香型、清香型、醬香型、芝麻香型和老白干香型白酒，反應時間為120h時，氧化抑制率分別為74.50%±0.15%、84.10%±1.22%、26.50%±2.33%、22.80%±2.06%、22.20%±3.12%、24.40%±4.21%、6.30%±2.12%，均值為20.50%±8.08%。有學者研究發(fā)現(xiàn)黃酒的氧化抑制率為99.60%±1.35%［8］。這說明，白酒雖具有一定的抗氧化能力，但是比黃酒低很多。不同香型白酒的氧化抑制率順序為濃香型＞芝麻香型＞清香型＞醬香型＞老白干香型。

2.3還原力

還原性是一種物質抗氧化能力的一個重要指標，也是物質抗氧化機理之一。實驗中，F(xiàn)e3+被抗氧化物質還原成為Fe2+，測定結果中吸光值越大，表明還原能力越強［16］。從圖3可以看出100μL BHA、BHT、α-生育酚、濃香型、清香型、醬香型、芝麻香型和老白干香型白酒的吸光值分別是0.15±0.02、1.00±0.01、0.61±0.12、0.16±0.26、0.17±0.04、0.28±0.09、0.13±0.01、0.15±0.02，均值為1.60%±0.84%。分析幾組數(shù)據(jù)的差異性，發(fā)現(xiàn)醬香型白酒的還原能力明顯高于其他香型的白酒，但是明顯低于黃酒的還原力0.40±0.03［8］。濃香型、清香型、芝麻香型和老白干香型白酒還原能力幾乎沒有差異。

圖3　待測樣品的還原能力Fig.3　Reducing activity of samples to be tested

2.4金屬螯合力

一些金屬離子，如鐵離子、銅離子在脂質的氧化過程中起催化作用，因此具有金屬螯合作用的物質可以間接地起到抗氧化的作用［16］。Ferrozine能夠與Fe2+形成紫紅色的絡合物，當其他有競爭力的絡合劑存在時，紫紅色會變淺。因此通過絡合物顏色的變化，可以評價物質對Fe2+的絡和能力。

從圖4可以看出，白酒金屬螯合能力非常有限。100μL濃香型、清香型、醬香型、芝麻香型和老白干香型白酒的金屬螯合能力分別是2.73%±0.34%、2.38% ±0.22%、2.37%±0.14%、0.60%±0.03%、1.68%±0.25%，均值為0.18%±0.06%。低于黃酒的金屬螯合力0.90% ±0.03%［8］，而同樣用量的陽性對照EDTA，其金屬螯合能力達到66.32%±2.35%。這說明對白酒的抗氧化能力不能通過金屬螯合力衡量。

圖4　待測樣品的還原能力Fig.4　Chelating activity of samples to be tested

3　結論

通過DPPH自由基清除能力、總抗氧化能力、還原能力、金屬螯合力4種測量指標間接測定白酒的抗氧化能力。研究結果表明，白酒有較弱的總抗氧化能力、還原能力、DPPH自由基清除力，但是金屬螯合能力非常有限，不同香型白酒的抗氧化能力不同。4種測量指標的測量結果表明，DPPH自由基法能夠準確清晰地反映白酒的抗氧化活性。初步推測酚類化合物是引起白酒抗氧化活性的主要物質，但是存在于白酒中的其他物質也可能具有抗氧化能力，關于白酒中的具體抗氧化活性物質還有待進一步研究。以天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑仍是今后食品工業(yè)的發(fā)展趨勢，開發(fā)實用、高效、成本低廉的天然抗氧化劑仍是研究的熱點之一［17］。

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Preliminary study on antioxidant activity of Chinese liquor

SHI Ya-lin，F(xiàn)AN Wen-lai*，XU Yan
（Lab of Brewing Microbiology and Applied Enzymology，Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In this study，2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH），total antioxidant activity，reducing capacity，and chelating capacitywere used to evaluate the antioxidant activity of Chinese liquor.According to each method under study，Chinese liquors had lower antioxidant activity than synthetic antioxidants.The scavenging activity of Chinese liquor was 7.80%±2.31%.The inhibiting percentage was 20.50%±8.08%.The chelating activity was 1.60%±0.84%.The reducing capacity was 0.18±0.06 expressed by absorbance.

liquor；antioxidant activity；DPPH；reducing capacity；chelating activity

TS262.3

A

1002-0306（2015）02-0095-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.011

2014－04－24

石亞林（1991-），女，碩士研究生，研究方向：生物工程。

范文來（1966-），男，碩士研究生，研究員，研究方向：釀酒工程與發(fā)酵工程。

國家“863”計劃項目（2013AA102108）。