雙波長(zhǎng)比色法測(cè)定不同產(chǎn)地和品種青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量

譚　亮，董　琦，耿丹丹，胡風(fēng)祖（中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧810001）

雙波長(zhǎng)比色法測(cè)定不同產(chǎn)地和品種青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量

譚亮，董琦，耿丹丹，胡風(fēng)祖*
（中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧810001）

利用一種更簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的雙波長(zhǎng)比色法來(lái)測(cè)定不同產(chǎn)地和品種青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量，以此代替以往復(fù)雜繁瑣的樣品前處理過(guò)程。根據(jù)雙波長(zhǎng)比色原理——若溶液中某溶質(zhì)在兩個(gè)波長(zhǎng)下均有吸收，則兩個(gè)波長(zhǎng)的吸收差值與該溶質(zhì)濃度成正比，以及根據(jù)直鏈淀粉和支鏈淀粉與碘試劑作用分別產(chǎn)生純藍(lán)色和紫紅色的性質(zhì)，用紫外分光光度計(jì)對(duì)兩種淀粉與碘試劑的反應(yīng)液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（450～900nm），用作圖法在同一個(gè)坐標(biāo)系里確定其各自的測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)。結(jié)果測(cè)得直鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)分別為560nm和506nm，支鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)分別為545nm和722nm。青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉分別在0.20～0.59mg和0.50～3.00mg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R2=0.9993和R2=0.9995），平均加樣回收率分別為91.14%和91.73%，RSD分別為1.70%和2.25%（n=9）。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，適用于測(cè)定青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量，可為青稞的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

雙波長(zhǎng)比色法，不同產(chǎn)地和品種，青稞，直鏈淀粉，支鏈淀粉，含量測(cè)定

青稞是生長(zhǎng)在我國(guó)西北、西南特別是西藏、青海、甘肅等地的一種重要的高原谷類作物，亦稱裸大麥、米大麥、元麥，其學(xué)名是Hordeum vulgare L.var. nudum Hook.f.，屬禾本科小麥族大麥屬大麥變種之一［1］。青稞作為藏民傳統(tǒng)的主要農(nóng)作物，已經(jīng)由幾百年前的“農(nóng)牧民專用”，到近年來(lái)隨著人們觀念的轉(zhuǎn)變，綠色食品的大力提倡，受到了都市人的寵愛(ài)。但傳統(tǒng)觀念中我國(guó)藏民主要將青稞制成糌粑，口感較粗糙，不易被人體吸收，如果能將青稞深加工成口感好易吸收的食品，其利用空間將會(huì)拓寬。淀粉是青稞的主要成分之一，占籽粒干重的65%左右，它包括直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種。淀粉成分獨(dú)特，普遍含有74%～78%的支鏈淀粉，有些甚至接近100%［2］。支鏈淀粉的含量增加使淀粉品質(zhì)整體優(yōu)化，還可作為優(yōu)良的增稠劑、乳化劑、黏著劑、懸浮劑而廣泛地應(yīng)用于食品、造紙、紡織和黏著劑工業(yè)［3］；直鏈淀粉含量是影響糧食感官品質(zhì)和加工特性的一個(gè)重要因素，其含量的高低，可作為評(píng)價(jià)糧食品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)［4］。所以，直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量測(cè)定對(duì)糧食的合理加工，淀粉的合理利用，農(nóng)業(yè)選種、育種等均具有重要意義。

目前，關(guān)于青稞淀粉研究的內(nèi)容有：青稞淀粉化學(xué)組成及工藝性質(zhì)、淀粉顆粒特性、淀粉酶法提取工藝、抗性淀粉制備、青稞淀粉粒蛋白多態(tài)性及其與淀粉含量的關(guān)系以及基因型與環(huán)境效應(yīng)對(duì)青稞淀粉含量的影響［5-10］等，而關(guān)于青稞中淀粉的含量以及組成淀粉的直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量測(cè)定未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。測(cè)定淀粉含量的方法有間接測(cè)定法（包括酶解法、酶解-蒽酮比色法、試劑盒法、HPLC法等）和直接測(cè)定法（包括CaCl2-HOAC浸提法、雙波長(zhǎng)比色法、近紅外光譜分析法等）［11-24］。這些方法大多存在使用試劑、儀器成本高，操作步驟繁瑣費(fèi)時(shí)的問(wèn)題，并且只能測(cè)定總淀粉含量。本文采用雙波長(zhǎng)比色法快速、準(zhǔn)確地測(cè)定出不同產(chǎn)地青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量，進(jìn)而由二者之和得出總淀粉的含量。該方法測(cè)定成本低、精度較高、結(jié)果較準(zhǔn)確、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，同時(shí)可得到直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉3組數(shù)據(jù)，極大地提高了工作效率，適用于大批量樣品的測(cè)定，也為青稞淀粉的含量測(cè)定提供了確實(shí)可行的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

青稞39批不同品種的青稞樣品采自西藏和青海不同產(chǎn)地（見(jiàn)表1），經(jīng)中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所分析測(cè)試中心胡風(fēng)祖教授鑒定確認(rèn)為正品（樣品預(yù)處理：將收集的樣品陰干，粉碎，裝入密封袋中密封，置干燥器中保存）；直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品上海惠誠(chéng)生物科技有限公司（純度≥98%）；支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品上?；菡\(chéng)生物科技有限公司（純度≥98%）；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、碘、碘化鉀、冰乙酸均為分析純。

表1　不同產(chǎn)地和品種的青稞樣品（n=3）Table 1　Hullessbarley samples collected from different habitats and varieties（n=3）

Cary300Bio型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)美國(guó)Varian公司；PL203型電子天平、MS205DU型精密電子天平瑞士梅特勒-托利多公司；pHS-3E型pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；XW-80A型渦旋混合器上海之信儀器有限公司；ML-1.5-4型數(shù)顯電加熱板北京中科奧博科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1碘試液的配制稱取碘化鉀2.0g，溶于少量蒸餾水中，再加碘0.2g，待溶解后用蒸餾水稀釋定容至100mL。

1.2.2直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.2.2.1直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備稱取直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品50mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，加入1mol/L氫氧化鈉溶液10mL，置沸水浴中溶解分散后，取出，冷卻至室溫，加入蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即濃度為1.0mg/mL的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液（實(shí)際配制濃度為0.9896mg/mL）。

1.2.2.2支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備稱取支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品50mg，精密稱定，按“1.2.2.1”項(xiàng)下操作方法制備成濃度為1.0mg/mL的支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液（實(shí)際配制濃度為0.9996mg/mL）。

1.2.3直鏈淀粉、支鏈淀粉測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)的確定

1.2.3.1直鏈淀粉吸收曲線繪制準(zhǔn)確移取上述直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL，置于25mL容量瓶中，加入蒸餾水15mL，以1mol/L冰乙酸溶液調(diào)節(jié)pH為3.5左右，加入碘試劑0.25mL，繼續(xù)加入蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。靜置15min后，以蒸餾水為對(duì)照，用雙光束分光光度計(jì)在450～900nm波段范圍內(nèi)掃描，繪制直鏈淀粉吸收曲線。

1.2.3.2支鏈淀粉吸收曲線繪制準(zhǔn)確移取上述支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL，置于25mL容量瓶中，按“1.2.3.1”項(xiàng)下操作方法繪制支鏈淀粉吸收曲線。

1.2.3.3直鏈淀粉和支鏈淀粉測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)的確定將上述兩種淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收曲線疊加繪制在同一個(gè)坐標(biāo)系里（450～900nm），依據(jù)溶液中某溶質(zhì)在兩個(gè)波長(zhǎng)下均有吸收，則兩個(gè)波長(zhǎng)的吸收差值與該溶質(zhì)濃度成正比的原理，通過(guò)等吸收點(diǎn)消除法確定測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)：

a.確定支鏈淀粉吸收曲線中相同吸光度A支1和A支2，其對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)分別為λ1和λ2，λ2處對(duì)應(yīng)直鏈淀粉吸收曲線上較大的A值（A直2），故λ2作為直鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)；λ1處對(duì)應(yīng)直鏈淀粉吸收曲線上較小的A值（A直1），故λ1作為直鏈淀粉的參比波長(zhǎng)；

b.確定支鏈淀粉吸收曲線中Amax所對(duì)應(yīng)的λ4作為支鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)；在λ4處找到相應(yīng)直鏈淀粉吸收曲線上A直4，繼續(xù)在該曲線上找到與A直4相同的吸光度A直3，在支鏈淀粉吸收曲線上找到與A直3相同的λ3作為支鏈淀粉的參比波長(zhǎng)。

1.2.4雙波長(zhǎng)直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.4.1雙波長(zhǎng)直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確移取上述直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL分別置于6個(gè)25mL容量瓶中，加入蒸餾水15mL，以1mol/L冰乙酸溶液調(diào)節(jié)pH為3.5左右，加入碘試劑0.25mL，繼續(xù)加入蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。靜置15min后，以蒸餾水為對(duì)照，分別在λ1、λ2兩波長(zhǎng)下測(cè)定Aλ1和Aλ2，以△A直=Aλ2-Aλ1為縱坐標(biāo)，直鏈淀粉質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制雙波長(zhǎng)直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2雙波長(zhǎng)支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確移取上述支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0mL分別置于6個(gè)25mL容量瓶中，以下按“1.2.4.1”項(xiàng)下操作方法操作，以蒸餾水為對(duì)照，分別在λ3、λ4兩波長(zhǎng)下測(cè)定Aλ3和Aλ4，以△A支=Aλ4-Aλ3為縱坐標(biāo)，支鏈淀粉質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制雙波長(zhǎng)支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5供試品溶液的制備和含量測(cè)定稱取0.1g已粉碎過(guò)60目篩的青稞樣品，置于25mL容量瓶中，精密稱定，加入0.5mL無(wú)水乙醇，渦旋以潤(rùn)濕樣品。加入1mol/L氫氧化鈉溶液2mL，渦旋混勻，置沸水浴中加熱l0min，取出，冷卻至室溫，加入蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾。準(zhǔn)確移取兩份濾液各1.0mL置于25mL容量瓶中（一份作為樣品空白對(duì)照液，另一份作為樣品測(cè)定液），按“1.2.4.1”項(xiàng)下操作方法操作。其中，樣品測(cè)定液中加入0.25mL碘試劑，樣品空白對(duì)照液中不加碘試劑，均加入蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。靜置15min后，以各樣品空白液為對(duì)照，分別測(cè)定λ1、λ2、λ3、λ4處的吸光度值A(chǔ)λ1、Aλ2、Aλ3和Aλ4，得△A直=Aλ2-Aλ1和△A支=Aλ4-Aλ3。分別在直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)△A值所對(duì)應(yīng)的淀粉質(zhì)量，即可計(jì)算出青稞樣品中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量，二者之和即為總淀粉含量。

1.2.6方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取已制備好的樣品溶液（西藏甘孜藏青25），按“1.2.5”項(xiàng)下操作方法操作，室溫下放置，于λ1、λ2、λ3、λ4下每隔1h測(cè)定吸光度Aλ1、Aλ2、Aλ3和Aλ4，計(jì)算直鏈淀粉和支鏈淀粉的RSD值，檢測(cè)溶液的穩(wěn)定性。

1.2.6.2重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確吸取同一青稞樣品所提取的供試品溶液（西藏甘孜藏青25），按“1.2.5”項(xiàng)下操作方法操作，于λ1、λ2、λ3、λ4下測(cè)定吸光度Aλ1、Aλ2、Aλ3和Aλ4，計(jì)算直鏈淀粉和支鏈淀粉的RSD值，檢測(cè)方法的重現(xiàn)性。

1.2.6.3回收率實(shí)驗(yàn)采用加樣回收法，在已知淀粉含量的青稞樣品供試液中按低、中、高濃度分別精密加入直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度3份，并按“1.2.5”項(xiàng)下操作方法操作，于λ1、λ2、λ3、λ4下測(cè)定吸光度Aλ1、Aλ2、Aλ3和Aλ4，計(jì)算直鏈淀粉和支鏈淀粉的平均回收率和RSD值，檢測(cè)方法的回收率。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)西藏和青海青稞中總淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1直鏈淀粉和支鏈淀粉測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)的確定

當(dāng)試液中含有兩種吸收光譜相互重疊的組分時(shí)，一般需進(jìn)行萃取分離或加掩蔽劑的方法才能完成測(cè)定。如單波長(zhǎng)法雖能對(duì)多組分物質(zhì)進(jìn)行定量分析，但其測(cè)定的準(zhǔn)確度、靈敏度、選擇性和測(cè)定過(guò)程的簡(jiǎn)單性均無(wú)法同雙波長(zhǎng)法相比。采用的雙波長(zhǎng)法僅用一個(gè)吸收池，且用試液本身作參比液，完全能消除吸收池和參比液等因素引起的誤差，提高了測(cè)定的準(zhǔn)確度，又因測(cè)定的是試液在兩波長(zhǎng)處的吸光度差值，故可提高測(cè)定的靈敏度和選擇性。所以采用雙波長(zhǎng)法測(cè)定直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量是最合適的，也得到了很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

將兩種淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收曲線疊加繪制在同一個(gè)坐標(biāo)系里（450～900nm），可得如圖1所示的結(jié)果。由結(jié)果可確定直鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)、參比波長(zhǎng)分別為λ2=560nm和λ1=506nm；支鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)、參比波長(zhǎng)分別為λ4=545nm和λ3=722nm。

圖1　直鏈淀粉和支鏈淀粉吸收曲線掃描圖（450～900nm）Fig.1　Scanning spectrum of absorption curve of amylose and amylopectin（450～900nm）

2.2雙波長(zhǎng)直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.1雙波長(zhǎng)直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線以△A直=Aλ2-Aλ1為縱坐標(biāo)，直鏈淀粉質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。由圖2可知，直鏈淀粉含量在0.20～0.59mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.3019x-0.0132，R2=0.9993。

圖2　直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curve of amylase

2.2.2雙波長(zhǎng)支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線以△A支=Aλ4-Aλ3為縱坐標(biāo)，支鏈淀粉質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。由圖3可知，支鏈淀粉含量在0.50～3.00mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.1418x+0.0098，R2=0.9995。

圖3　支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Standard curve of amylopectin

2.3方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取已制備好的樣品溶液，按“1.2.5”項(xiàng)下操作方法操作，室溫下放置，于506、545、560、722nm下每隔1h測(cè)定吸光度A506nm、A545nm、A560nm和A722nm，結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好，計(jì)算得直鏈淀粉和支鏈淀粉的RSD值分別為2.0%和2.3%。

2.3.2重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確吸取同一青稞樣品所提取的供試品溶液，按“1.2.5”項(xiàng)下操作方法操作，于506、545、560、722nm下測(cè)定吸光度A506nm、A545nm、A560nm和A722nm，結(jié)果表明檢測(cè)方法的重現(xiàn)性良好，計(jì)算得直鏈淀粉和支鏈淀粉的RSD值分別為1.6%和1.8%。

2.3.3回收率實(shí)驗(yàn)采用加樣回收法，在已知淀粉含量的青稞樣品供試液中按低、中、高濃度分別精密加入直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度3份，并按“1.2.5”項(xiàng)下操作方法操作，于506、545、560、722nm下測(cè)定吸光度A506nm、A545nm、A560nm、A722nm，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。計(jì)算得直鏈淀粉和支鏈淀粉的平均回收率分別為91.14%和91.73%，RSD分別為1.70%和2.25%，結(jié)果表明檢測(cè)方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表2　直鏈淀粉回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=9）Table 2　Results of recovery test of amylose（n=9）

表3　支鏈淀粉回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=9）Table 3　Results of recovery test of amylopectin（n=9）

2.4不同產(chǎn)地和品種青稞中兩種淀粉的含量測(cè)定

2.4.1最佳實(shí)驗(yàn)條件考察通過(guò)對(duì)碘試劑與兩類淀粉顯色反應(yīng)的條件考察，確定符合實(shí)驗(yàn)的最佳樣品取用量、酸度條件（pH）、堿溶時(shí)間，極大地提高了分析檢測(cè)的速度和準(zhǔn)確度。有文獻(xiàn)中報(bào)道稱樣量為200mg，而這樣的稱樣量至少需要好幾粒種子，本實(shí)驗(yàn)分別考察了稱樣量為25、50、100、200、300mg的情況。結(jié)果隨著稱樣量的增加提取率也隨之增加，當(dāng)超過(guò)100mg時(shí)提取率又隨之減少，其原因是稱樣量小時(shí)稱量的誤差大，稱樣量大時(shí)提取又不完全，超過(guò)了可將淀粉完全提取的飽和狀態(tài)，又考慮到樣品、試劑的用量和成本，選擇稱樣量為100mg作為最佳取用量；當(dāng)維持其他條件不變時(shí)，根據(jù)pH對(duì)淀粉-碘絡(luò)合物的影響情況，溶液的酸度在pH2.0～5.0范圍內(nèi)吸光值總體變化不大，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且當(dāng)pH為3.5時(shí)有最大吸光值；在用氫氧化鈉溶液溶解青稞樣品中的淀粉時(shí)，分別考察了在沸水浴中的加熱時(shí)間5、10、15、20min，結(jié)果在10min時(shí)測(cè)得含量最高，分析原因是堿溶時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致淀粉水解，使測(cè)量結(jié)果偏低，堿溶時(shí)間過(guò)短可能使淀粉不能完全溶解，所以確定最佳堿溶時(shí)間為10min。

2.4.2青稞中兩種淀粉含量測(cè)定結(jié)果采用雙波長(zhǎng)比色法測(cè)定不同產(chǎn)地和品種青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量結(jié)果見(jiàn)表4，二者之和即為總淀粉含量。由表4可知：所有青稞中支鏈淀粉含量均高于直鏈淀粉含量，其含量約高出2.6倍。在西藏青稞中，來(lái)自西藏海南的藏青690青稞總淀粉含量最高為67.55%，來(lái)自西藏日客則的柴青1號(hào)青稞總淀粉含量最低為55.00%；在青海青稞中，來(lái)自青海稱多的湟源藍(lán)青稞總淀粉含量最高為68.53%，來(lái)自青海玉樹的長(zhǎng)芒白青稞總淀粉含量最低為58.14%。

表4　不同產(chǎn)地和品種青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 4　Determination results of amylose and amylopectin in hullessbarley samples collected from different habitats and varieties（n=3）

2.5不同產(chǎn)地青稞中淀粉含量統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)SPSS 16.0軟件對(duì)西藏和青海青稞中總淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表5～表7。結(jié)果分析如下：由表5可知Levene方差齊性檢驗(yàn)F=1.347，p=0.253＞0.05，說(shuō)明兩樣本方差相等；進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)時(shí)，t=24.532，自由度df=37，雙尾檢驗(yàn)概率p=0.000＜0.05，說(shuō)明西藏和青海青稞中直鏈淀粉含量具有顯著性差異，西藏青稞中直鏈淀粉平均含量（21.52%）約高出青海青稞中直鏈淀粉平均含量（9.93%）2.2倍；由表6可知Levene方差齊性檢驗(yàn)F=0.023，p=0.880＞0.05，說(shuō)明兩樣本方差相等；進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)時(shí)，t=-15.084，自由度df=37，雙尾檢驗(yàn)概率p=0.000＜0.05，說(shuō)明西藏和青海青稞中支鏈淀粉含量具有顯著性差異，青海青稞中支鏈淀粉平均含量（53.01%）約高出西藏青稞中支鏈淀粉平均含量（39.22%）1.4倍；由表7可知Levene方差齊性檢驗(yàn)F=1.894，p=0.177＞0.05，說(shuō)明兩樣本方差相等；進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)時(shí)，t=-1.904，自由度df=37，雙尾檢驗(yàn)概率p=0.065＞0.05，兩組數(shù)據(jù)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明西藏和青海青稞中總淀粉含量無(wú)顯著性差異，西藏青稞總淀粉平均含量（60.74%）略低于青海青稞總淀粉平均含量（62.75%）。

表5　不同產(chǎn)地青稞中直鏈淀粉含量的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)Table 5　Independent samples test of amylose content in hullessbarley samples collected from different habitats

表6　不同產(chǎn)地青稞中支鏈淀粉含量的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)Table 6　Independent samples test of amylopectin content in hullessbarley samples collected from different habitats

表7　不同產(chǎn)地青稞中總淀粉含量的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)Table 7　Independent samples test of total starch content in hullessbarley samples collected from different habitats

3　結(jié)論

本研究中淀粉含量測(cè)定結(jié)果顯示：所有青稞中支鏈淀粉平均含量高于直鏈淀粉2.6倍；西藏青稞中藏青690總淀粉含量最高為67.55%，柴青1號(hào)總淀粉含量最低為55.00%；青海青稞中湟源藍(lán)青稞總淀粉含量最高為68.53%，長(zhǎng)芒白青稞總淀粉含量最低為58.14%；西藏青稞中直鏈淀粉平均含量顯著高出青海青稞中直鏈淀粉平均含量，而青海青稞中支鏈淀粉平均含量顯著高出西藏青稞中支鏈淀粉平均含量，西藏和青海青稞中總淀粉含量相當(dāng)，無(wú)顯著性差異。雙波長(zhǎng)分光光度法作為一種淀粉含量的快速測(cè)定方法，具有樣品用量少、堿溶溫度低、環(huán)境污染小、省時(shí)省力、快捷、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、便于樣品的批量測(cè)定等特點(diǎn)。該方法可以同時(shí)得到直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉含量3組數(shù)據(jù)，既提高了實(shí)驗(yàn)效率，又節(jié)省了樣品用量，適宜于大批量樣品分析，對(duì)于優(yōu)異青稞品種材料的選育工作具有十分重要的意義。

［1］謝宗萬(wàn).本草綱目藥物彩色圖鑒［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：221.

［2］臧靖巍，闞建全，陳宗道，等.青稞的成分研究及應(yīng)用狀況［J］.中國(guó)食品添加劑，2004（4）：43-46.

［3］雷宏，王曉曦，曲藝.面粉中直鏈淀粉對(duì)面制品品質(zhì)的影響［J］.糧油加工，2009，36（3）：73-75.

［4］鐘連進(jìn)，程方民.水稻籽粒鮮樣品的直鏈淀粉含量測(cè)定方法［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2002，28（1）：33-36.

［5］臧靖巍.青稞淀粉和蛋白質(zhì)的化學(xué)組成及其工藝性質(zhì)研究［D］.重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［6］史一一，達(dá)瓦，張文會(huì).青稞淀粉顆粒特性研究［J］．西藏科技，2010（3）：17-18.

［7］史一一，達(dá)瓦，余耀斌，等.青稞淀粉酶法提取工藝研究［J］．西藏農(nóng)業(yè)科技，2009，31（2）：12-16.

［8］肖新龍.青稞淀粉理化特性及其抗性淀粉制備研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

［9］潘志芬，鄒弈星，趙桃，等.青藏高原栽培青稞淀粉粒蛋白多態(tài)性及其與淀粉含量的關(guān)系［J］．遺傳，2007，29（5）：599-606.

［10］吳昆侖.基因型與環(huán)境效應(yīng)對(duì)青稞淀粉含量的影響［J］．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，24（2）：422-424.

［11］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB/T 5009.9-2008，食品中淀粉的測(cè)定［S］．2009.

［12］Englyst H N，Cummings J H.Improved method for measurement of dietary fibre as non-starch polysaccharides in plant foods［J］.Journal of the Association of Official Analytical Chemists International，1988，71（4）：808-814.

［13］McCleary B V，Gibson T S，Mugford D C.Measurement of total starch in cereal products by amyloglucosidase-A-amylase method：Collaborative study［J］.Journal of the Association of Official Analytical Chemists International，1997，80（3）：571-579.

［14］黃光文，沈玉平，李常健.甘薯淀粉含量測(cè)定的新方法［J］．湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（17）：109-111.

［15］于魯浩，楊俊慧，孟慶軍，等.玉米粉中淀粉含量的快速測(cè)定方法［J］．山東科學(xué)，2012，25（1）：19-23.

［16］禹萍，范世賓，朗秋美，等.酶電極法測(cè)定谷物淀粉含量的研究［J］．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2000，10（5）：515-517.

［17］董學(xué)暢，喬永峰，孫海林，等.高效液相色譜法測(cè)定煙草中的淀粉含量［J］．云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，12（4）：210-211.

［18］廖燕芝，楊代明，張繼紅，等.氣相色譜法測(cè)定魔芋食品中葡甘聚糖及淀粉含量［J］．食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008，27（4）：66-69.

［19］林媚，溫明霞，馮先桔，等.CaCl2-HOAC浸提法測(cè)定溫州蜜柑樹根中淀粉含量的研究［J］．浙江柑橘，2006，23（2）：32-33.

［20］Gibson T S，Solah V A，McClearly B V.A procedure to measure amylose in cereal starched and flours with concanavalin A［J］.Journal of Cereal Science，1997，25：111-119.

［21］石海信，郝媛媛，方懷義，等.雙波長(zhǎng)法測(cè)定木薯淀粉中直鏈和支鏈淀粉的含量［J］．食品科學(xué)，2011，32（21）：123-127.

［22］沈林峰，沈掌泉.應(yīng)用近紅外光譜和偏最小二乘回歸法預(yù)測(cè)玉米中淀粉含量［J］．化學(xué)分析計(jì)量，2008，17（6）：26-28.

［23］王喜萍，李長(zhǎng)生，張文英.淀粉含量測(cè)定方法的研究初探［J］．糧油食品科技，2001，9（2）：37-38.

［24］展海軍，崔麗偉，李婕.用差熱分析法測(cè)定玉米中淀粉含量［J］．河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，33（6）：31-35.

Determination of amylase and amylopectin in hullessbarley from different habitats and varieties by dual-wavelength colorimetric method

TAN Liang，DONG Qi，GENG Dan-dan，HU Feng-zu*
（Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810001，China）

A more simple，accurate dual-wavelength colorimetric method was developed to determine the contents of amylose and amylopectin in hullessbarley from different habitats and varieties.It was replaced the previous complicated sample pre-treatment process.The reaction solution that reacted by two ingredient of starch and iodine reagents were scanned from 450nm to 900nm by UV spectrophotometer to determine its detection wavelength and reference wavelength in the same coordinate system which according to the principle of the dual-wavelength colorimetry——the difference was proportional to the concentration of solute while there were two absorption peaks at two different wavelengths from the same solute in the solution，as well as characteristic of blue appearance that amylase encountered with iodine reagents and purple red as amylopectin.The results indicated that the detection wavelength and reference wavelength were 560nm and 506nm for amylase，545nm and 722nm for amylopectin，respectively.The method had good linear relationship within the ranges of 0.20～0.59mg for amylose（R2=0.9993），0.50～3.00mg for amylopectin（R2=0.9995），respectively.The average recoveries（n=9）were 91.14%（RSD=1.70%）for amylose and 91.73%（RSD=2.25%）for amylopectin.The assay demonstrated that the method had adequate simple，accurate，good stability and reproducibility.It was suitable for the determination of amylose and amylopectin contents in hullessbarley.In addition，it could be used to assist the quality evaluation of hullessbarley.

dual-wavelengthcolorimetry；differenthabitatsandvarieties；hullessbarley；amylose；amylopectin；assay

TS237

A

1002-0306（2015）02-0079-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.008

2014－06－04

譚亮（1984-），男，碩士研究生，工程師，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。

胡風(fēng)祖（1955-），女，大學(xué)本科，研究員，研究方向：藏藥、民族保健食品、核心資源食品的研制開發(fā)。

中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重要方向項(xiàng)目（KSCX2-EW-J-26）；農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)公共技術(shù)服務(wù)平臺(tái)（2012-T-Y19）。