實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)食品中狗源性成分

高曉麗，楊昕霆，薛晨玉，王　丹，趙琳娜，侯彩云，*（.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京00083；.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京0004）

實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)食品中狗源性成分

高曉麗1，楊昕霆2，+，薛晨玉2，王丹2，趙琳娜2，侯彩云1，*
（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京100041）

根據(jù)狗線粒體NADH氧化還原酶亞基2基因（ND2）中的序列設(shè)計(jì)了狗特異性引物和Taqman探針，建立了食品中狗源性成分的實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)剑≧eal-time PCR）檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)表明，該方法可以很好地區(qū)分狗與其他常見(jiàn)的14個(gè)物種，引物、Taqman探針特異性良好，檢測(cè)靈敏度可達(dá)100fg，適用于食品中狗源性成分的快速鑒定。

Real-time PCR，線粒體ND2基因，狗源性成分

近年來(lái)，食品中肉制品的安全問(wèn)題日益突出，如國(guó)內(nèi)的“假牛、羊肉事件”、“假鴨血事件”，國(guó)外的“馬肉風(fēng)波”、“假鱈魚事件”。食品中的摻雜作假現(xiàn)象，不僅嚴(yán)重侵害消費(fèi)者的權(quán)益，引發(fā)對(duì)食品安全的信任危機(jī)，一些疫情的發(fā)生與傳播也往往起因于不安全的動(dòng)物食品［1-2］。我國(guó)針對(duì)飼料、明膠、化妝品中含有的豬、牛、羊、馬、驢、兔、狗等動(dòng)物源性成分制定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［3］，但關(guān)于食品中動(dòng)物源性成分的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)并不完善。因此，建立準(zhǔn)確、快速的食品中動(dòng)物源性成分篩查方法至關(guān)重要。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要基于PCR方法對(duì)動(dòng)物源性成分的鑒定進(jìn)行了研究，大量報(bào)道了豬、牛、羊、雞、火雞、鴨、鵝、馬、驢等常見(jiàn)物種的普通PCR［4-10］和熒光PCR［11-18］研究，但針對(duì)狗源性成分鑒定的研究報(bào)道還不多。Tobe等［19］基于線粒體cytb基因建立了18個(gè)歐洲常見(jiàn)物種（狗、貓、牛、馬、驢、狐貍、山羊等）的多重PCR檢測(cè)方法，能夠鑒別混合肉中各物種340fg的模板DNA。Martin等［20］建立了食品和飼料中狗、貓、鼠源性成分鑒定的普通PCR方法，檢測(cè)限為0.1%。我國(guó)國(guó)標(biāo)中只制定了動(dòng)物源性飼料中狗源性成分的普通PCR定性檢測(cè)方法，檢出限為0.1%［21］。

在食品中動(dòng)物源性成分的鑒定方面，與普通PCR和多重PCR法相比，實(shí)時(shí)熒光PCR法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好、有效降低污染、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用較普遍的方法之一［22］。本研究設(shè)計(jì)了狗線粒體ND2基因特異性引物和Taqman探針，建立了食品中狗源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。該方法可為保障食品安全、制定相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)等提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉等動(dòng)物材料購(gòu)自北京市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或超市；駱駝肉、馬肉、驢肉、狗肉、貓肉等動(dòng)物材料為實(shí)驗(yàn)室自存；20個(gè)牛羊肉串樣品購(gòu)自北京市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；Tris-平衡酚、氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇、乙酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純；CTAB提取緩沖液（20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.02mol/L Na2EDTA，0.1mol/L Tris-HCl，pH=8.0）、TE緩沖溶液（10mmol/L Tris-HCl，pH=8.0，1mmol/L EDTA）由本實(shí)驗(yàn)室配制；Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混合液（Premix Ex Taq）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；狗ND2基因序列特異的上下游引物、Taqman探針由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

核酸蛋白定量分析儀（分光光度計(jì)）德國(guó)Eppendorf公司；核酸自動(dòng)提取儀QIA Cube美國(guó)QIA Gene公司；3K18冷凍離心機(jī)德國(guó)Sigma公司；MyiQ單色實(shí)時(shí)定量PCR儀美國(guó)伯樂(lè)公司；超低溫冰箱（-40℃）Biomedical freezer日本SANYO公司；Mili-Q純水器美國(guó)Milipore公司。

1.2動(dòng)物組織基因組DNA的提取［23］

用滅菌手術(shù)剪分別剪取適量的豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、狗肉、貓肉的肌肉組織，剪碎置于研缽中（注意防止交叉污染）；加入石英砂，用液氮充分研磨至粉末狀，迅速取2g左右于2.0mL離心管中，立即加入1mL CTAB，混勻；置于核酸自動(dòng)提取儀中加熱振蕩，消化30min；離心取600μL上清液于新的2.0mL離心管中，加入等體積的氯仿和Tris-平衡酚各300μL（1∶1，V/V），用力振蕩5min，使其充分反應(yīng)，12000r/min室溫離心10min；取上清，加入600μL氯仿，同上，12000r/min室溫離心10min；取上清，加10%體積3mol/L乙酸鈉和2倍體積無(wú)水乙醇，輕緩顛倒數(shù)次，可見(jiàn)白色絮狀DNA，12000r/min室溫離心10min，棄上清液；加入1mL 70%乙醇洗滌沉淀2次，12000r/min室溫離心10min，棄乙醇；待DNA沉淀干燥后，將DNA溶于50～100μL無(wú)菌水中，用核酸蛋白定量分析儀測(cè)定DNA濃度，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物與Taqman探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)已注釋的、不同品系的狗（Canis lupus familiaris）線粒體序列（Accession Number：NC_002008，GI：17737322）和豬、牛、山羊、綿羊、雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉、兔、駱駝、馬、驢、貓等物種的線粒體序列，分析生物進(jìn)化樹(shù)的規(guī)律，使用DNAMAN軟件比對(duì)以上所有基因序列。選擇種內(nèi)保守、種間差異較大的基因片段，根據(jù)引物和Taqman探針的設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用Primer Express軟件，設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，將設(shè)計(jì)的引物和探針序列在NCBI的Blast中搜索、比對(duì)，最后選取既可以保證種內(nèi)保守，又能保證種間特異的狗源性成分引物和Taqman探針。

1.4引物和Taqman探針特異性的驗(yàn)證

以狗肉基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，豬、牛、山羊、綿羊、鴨、雞等14個(gè)物種基因組DNA為陰性對(duì)照，空白對(duì)照中以水代替DNA模板。所有DNA模板的質(zhì)量濃度均稀釋至100ng/μL。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為20μL，具體包括：Premix buffer（2×）10μL、上游引物（10μmol/L）0.5μL、下游引物（10μmol/L）0.5μL、Taqman探針（10μmol/L）1μL、DNA模板1μL、無(wú)菌水將體系補(bǔ)充至總體積20μL。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s；60℃延伸30s，記錄熒光值，40個(gè)循環(huán)。

在實(shí)時(shí)熒光PCR中，Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺損設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即threshold=10XSD cycle 6～15。因此，以Ct值小于35為陽(yáng)性，Ct值大于35為陰性。特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)重復(fù)三遍。

1.5靈敏度和擴(kuò)增效率檢測(cè)

在檢測(cè)該方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)中，將狗肉基因組DNA溶液分別稀釋為102、101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5ng/μL，每個(gè)濃度進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置空白對(duì)照。根據(jù)各梯度的擴(kuò)增曲線Ct值，建立Ct值-lg［DNA］的標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)擴(kuò)增效率計(jì)算公式Efficiency（%）=（-1+10［-1/slope］）×100，得到PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率。以Ct值為判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定檢出的最低濃度，作為該反應(yīng)體系的檢測(cè)靈敏度。

1.6市售肉制品中狗源性成分的檢測(cè)

在北京農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)中隨機(jī)取樣20個(gè)牛、羊肉串，檢驗(yàn)是否有摻雜摻假狗肉的情況。提取樣本基因組DNA，按照實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)體系，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。

2　結(jié)果與分析

2.1陽(yáng)性物種樣本的鑒定

以CO1基因的DNA條形碼［24-25］擴(kuò)增狗肉基因組DNA，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI中Blast搜索，結(jié)果如圖1所示。序列相似性為99%，從而確定狗物種樣本的真實(shí)性。

2.2引物和Taqman探針的特異性檢測(cè)結(jié)果

在特異性實(shí)驗(yàn)中，用狗ND2基因特異性引物和Taqman探針體系分別擴(kuò)增豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、鴨肉、雞肉、鵝肉、鴿子肉、鴕鳥肉、鵪鶉肉、兔肉、馬肉、驢肉、貓肉的基因組DNA模板。結(jié)果表明，非目標(biāo)物種基因組DNA的擴(kuò)增曲線的Ct值均大于35，說(shuō)明狗引物和Taqman探針特異性良好，如圖2所示。

2.3靈敏度、擴(kuò)增效率檢測(cè)結(jié)果

以10倍為稀釋梯度，狗基因組DNA分別稀釋為102、101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5ng/μL。在10-5ng/μL濃度下，未檢測(cè)到目標(biāo)物種。在102～10-4ng/μL濃度范圍內(nèi)，建立Ct值-lg［DNA］的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.9957，線性相關(guān)度良好。PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率為108%。DNA濃度為10-4ng/μL時(shí)，Ct值為34.6。該引物、Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)體系可檢出10-4ng的模板DNA量。因此，靈敏度為100fg。

2.4市售樣本的檢測(cè)結(jié)果

在對(duì)市售的20個(gè)牛、羊肉串檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。檢測(cè)樣本、陰性對(duì)照、空白對(duì)照中并未檢出狗源性成分，陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增曲線完好。說(shuō)明，狗引物、Taqman探針具有很強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3　結(jié)論與討論

線粒體DNA是高等動(dòng)物唯一的核外遺傳物質(zhì)，是檢測(cè)中比較理想的靶基因，而且細(xì)胞中均含有大量的線粒體。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于線粒體的測(cè)序及其他研究已經(jīng)非常透徹，在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中有大量已發(fā)表并做注釋的線粒體序列，便于針對(duì)不同的物種進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要以線粒體中cytb、D-loop、12S rRNA、16S rRNA、ND1、ND2等基因作為目標(biāo)基因位點(diǎn)，本研究通過(guò)篩查狗線粒體中的不同基因，并將設(shè)計(jì)的引物和探針序列在NCBI的Blast中搜索、比對(duì)，最終在狗線粒體ND2基因位點(diǎn)上，發(fā)現(xiàn)既可以保證種內(nèi)保守，又可保證種間特異的引物和探針序列。因此，選取了狗線粒體ND2基因序列片段設(shè)計(jì)了引物和Taqman探針。

圖1　DNA條形碼擴(kuò)增產(chǎn)物在NCBI中Blast搜索比對(duì)結(jié)果Fig.1　Sequence alignment of sequence amplification product

圖2　狗源性引物探針實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性檢測(cè)結(jié)果圖Fig.2　Specific detection of real-time PCR for dog

圖3　Ct值-lg［DNA］的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Standard curve showing ct values in relation to the concentration of initial target gene copies

在實(shí)際樣本的檢測(cè)中，通過(guò)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)樣本中并未檢出狗源性成分。需要注意點(diǎn)是，由于該方法的靈敏度較高，根據(jù)動(dòng)物源性成分檢出量，不能判斷是意外污染還是蓄意添加。因此，需要結(jié)合其他方法進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，以便更好的判斷摻雜作假的程度。此外，該Taqman探針的熒光PCR反應(yīng)體系是否適用于肉骨粉、明膠、化妝品中的狗源性成分的檢測(cè)，還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，狗ND2基因特異性引物、Taqman探針的熒光PCR反應(yīng)體系特異性好，靈敏度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，實(shí)用性強(qiáng)，適用于食品中狗源性成分的檢測(cè)，可為食品安全檢測(cè)、打擊摻假摻雜等違法行為提供技術(shù)參考。

［1］卜登攀，王加啟，賀云霞，等.動(dòng)物源性飼料檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2008，35（2）：54-59.

［2］陳文炳，邵碧英，廖憲彪，等.加工食品中若干動(dòng)物成分的PCR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用研究［J］.食品科學(xué)，2005，26（8）：338-342.

［3］李家鵬，喬曉玲，田寒友，等.食品和飼料中動(dòng)物源性成分檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2011，32（9）：340-347.

［4］張慧霞，張利平，吳建平，等.鵪鶉源性成分PCR檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2008，38（4）：346-349.

［5］陳穎，吳亞軍，徐寶梁，等.食品及飼料中馬屬動(dòng)物源性成分的PCR檢測(cè)研究［J］.中國(guó)生物工程雜志，2004，24（5）：78-83.

［6］Colombo F，Viacava R，Giaretti M.Differentiation of the species ostrich（Struthio camelus）and emu（Dromaius novaehollandiae）by polymerase chain reaction using an ostrich-specific primer pair［J］.Meat Science，2000，56（1）：15-17.

［7］Wan Q H，F(xiàn)ang S G.Application of species-specific polymerase chain reaction in the forensic identification of tiger species［J］.Forensic Science International，2003，131（1）：75-78.

［8］Chen Y，Wu Y J，Xu B L，et al.Species-specific polymerase chain reaction amplification of camel（Camelus）DNA extracts［J］. Journal of Aoac International，2005，88（5）：1394-1398.

［9］Haunshi S，Basumatary R，Girish P S，et al.Identification of chicken，duck，pigeon and pig meat by species-specific markers of mitochondrial origin［J］.Meat Science，2009，83（3）：454-459.

［10］Rodriguez M A，Garcia T，González I，et al.PCR identification of beef，sheep，goat，and pork in raw and heat-treated meat mixtures［J］.Journal of Food Protection?，2004，67（1）：172-177.

［11］Ahmad A I，Ghasemi J B.New FRET primers for quantitativereal-time PCR［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，387（8）：2737-2743.

［12］Jonker K M，Tilburg J，H?gele G H，et al.Species identification in meat products using real-time PCR［J］.Food Additives and Contaminants，2008，25（5）：527-533.

［13］Laube I，Zagon J，Broll H.Quantitative determination of commercially relevant species in foods by real-time PCR［J］. International Journal of Food Science&Technology，2007，42（3）：336-341.

［14］K?ppel R，Zimmerli F，Breitenmoser A.Heptaplex real-time PCR for the identification and quantification of DNA from beef，pork，chicken，turkey，horse meat，sheep（mutton）and goat［J］. European Food Research and Technology，2009，230（1）：125-133.

［15］Hanna S E，Connor C J，Wang H H.Real-time Polymerase ChainReactionfortheFoodMicrobiologist：Technologies，Applications，and Limitations［J］.Journal of Food Science，2005，70（3）：R49-R53.

［16］Sawyer J，Wood C，Shanahan D，et al.Real-time PCR for quantitative meat species testing［J］.Food Control，2003，14（8）：579-583.

［17］Kesmen Z，Gulluce A，Sahin F，et al.Identification of meat species by TaqMan-based real-time PCR assay［J］.Meat Science，2009，82（4）：444-449.

［18］Chisholm J，Sánchez A，Brown J，et al.The development of species-specific real-time PCR assays for the detection of pheasant and quail in food［J］.Food Analytical Methods，2008，1（3）：190-194.

［19］Tobe S S，Linacre A M T.A multiplex assay to identify 18 European mammal species from mixtures using the mitochondrial cytochrome b gene［J］.Electrophoresis，2008，29（2）：340-347.

［20］Martín I，García T，F(xiàn)ajardo V，et al.Technical Note：Detection of cat，dog，and rat or mouse tissues in food and animal feed using species-specific polymerase chain reaction［J］.Journal of Animal Science，2007，85（10）：2734-2739.

［21］中國(guó)人民共和國(guó)山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，中華人民共和國(guó)遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，等.GB/T 21105-2007動(dòng)物源性飼料中狗源性成分定性檢測(cè)方法PCR方法［S］.2007.

［22］Fajardo V，González I，Rojas M，et al.A review of current PCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species［J］.Trends in Food Science&Technology，2010，21（8）：408-421.

［23］Sambrook J，薩姆布魯克，Russell D W，et al.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京：科學(xué)出版社，2002.

［24］Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L.Biological identifications through DNA barcodes［J］.Proceedings of the Royal Society of London.Series B：Biological Sciences，2003，270（1512）：313-321.

［25］Hebert P D N，Ratnasingham S，de Waard J R.Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species［J］.Proceedings of the Royal Society of London.Series B：Biological Sciences，2003，270（S1）：96-99.

Detection for dog-derived components in foods by real-time polymerase chain reaction

GAO Xiao-li1，YANG Xin-ting2，+，XUE Chen-yu2，WANG Dan2，ZHAO Lin-na2，HOU Cai-yun1，*
（1.School of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；2.Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring，Beijing 100041，China）

A rapid and highly species-specific real-time polymerase chain reaction（PCR）assay had been developed for the detection of dog-derived components in meat and meat mixtures.Primers and Taqman probe were designed on the mitochondrial ND2，and the performance of the method was tested.Results showed that no cross-reaction was observed between the dog and non-target species，and this method revealed a high sensitivity and could detect 100fg of dog template DNA.In conclusion，this real-time PCR assay could be a rapid and straightforward method for the accurate identification of dog-derived components in food.

Real-time PCR；mitochondrial ND2 gene；dog-origin ingredient

TS201.6

A

1002-0306（2015）02-0061-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.004

2014－04－09+為并列第一作者

高曉麗（1990-），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。楊昕霆（1986-），男，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物源性成分檢測(cè)。

侯彩云（1963-），女，博士研究生，教授，研究方向：食品科學(xué)與加工技術(shù)。

北京市科技計(jì)劃課題（Z131100005613005）。