交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）對山核桃多酚去除效果的毒理學(xué)評價(jià)

周　瑜，黃堅(jiān)欽，高　飛，王向軍，錢永常

（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安311300）

交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）對山核桃多酚去除效果的毒理學(xué)評價(jià)

周瑜，黃堅(jiān)欽，高飛，王向軍，錢永常*

（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安311300）

有關(guān)植物源飲料和食品原料中多酚的去除已有報(bào)道，但大多數(shù)是用多酚去除率等理化指標(biāo)進(jìn)行效果評估，很少有用生物學(xué)毒性指標(biāo)來評估多酚去除的效果。本研究以山核桃鮮果仁水提物為例，用PVPP吸附法去除山核桃水提物中的多酚，并利用神經(jīng)細(xì)胞模型的毒理學(xué)檢測，評估PVPP去除多酚的效果。數(shù)據(jù)顯示，用PVPP吸附法處理山核桃水提物可以顯著地去除多酚（p＜0.01），以40mg PVPP對500mg山核桃仁的比例處理10min，多酚去除率可達(dá)到84.6%。進(jìn)一步用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和MTT法測定細(xì)胞活力的細(xì)胞毒理學(xué)測定表明，未經(jīng)PVPP處理的山核桃水提物顯著（p＜0.01）地增加了人類SH-SY5Y-EGFP神經(jīng)腫瘤細(xì)胞和人類HUVEC正常細(xì)胞的死亡率，并呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)；而PVPP去除多酚的山核桃水提物沒有顯著地引起SH-SY5Y-EGFP神經(jīng)腫瘤細(xì)胞和HUVEC正常細(xì)胞的死亡（p＞0.05）。以上結(jié)果表明山核桃鮮果仁水提物因?yàn)楹休^多的多酚物質(zhì)，對人類腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞都具有顯著的體外細(xì)胞毒性（p＜0.01），以此為毒理學(xué)評估指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)PVPP處理可以大量地去除多酚，降低山核桃果仁水提物中多酚的細(xì)胞毒性。

山核桃，交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，毒理學(xué)評價(jià)，多酚

山核桃（Carya cathayensis Sarg.），胡桃科山核桃屬落葉喬木，屬胡桃科山核桃屬，集中分布在中國江浙、湖南、湖北一帶，是極具特色和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的林產(chǎn)品。山核桃種仁含蛋白質(zhì)7.8%～9.6%，含油率69.8%～74.01%，其中不飽和脂肪酸占88.38%～95.78%，并含有豐富的人體所必須的礦質(zhì)元素。山核桃油味清香、營養(yǎng)豐富，是優(yōu)良的食用油，具有潤肺、滋補(bǔ)和康復(fù)之功效，還可降低血脂，預(yù)防心腦血管疾病。山核桃種仁中主要營養(yǎng)成分有17種氨基酸，8種脂肪酸，在營養(yǎng)價(jià)值和保健作用方面具有更獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，是極具開發(fā)和研究價(jià)值的植物源天然產(chǎn)物［1-2］。

近幾年，山核桃及其他植物源功能食品和保健產(chǎn)品增長十分迅速。然而對許多植物源天然產(chǎn)物而言，如山核桃、余甘果、三葉青、茶、鐵皮石斛等，為了更好地提升其在食品飲料工業(yè)或生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用，要解決的一個(gè)難題是如何去除較高濃度的多酚類物質(zhì)，其中山核桃多酚含量高達(dá)300～600mg/100g干質(zhì)量核桃仁［3-5］。這些多酚類物質(zhì)不僅能產(chǎn)生澀味，而且可引起飲料、啤酒、茶等產(chǎn)生沉淀，影響食品口感及美觀。除此之外，多酚類物質(zhì)還具有潛在的細(xì)胞毒性，大量研究證實(shí)較高濃度的多酚對體外腫瘤細(xì)胞株和正常細(xì)胞都具有顯著的細(xì)胞毒性［6-9］。因此很多研究者用不同的方法對植物源天然產(chǎn)物提取物中多酚的去除效果和工藝進(jìn)行了研究。但是，目前的研究只是著眼于植物源天然產(chǎn)物本身并對其多酚去除率等指標(biāo)進(jìn)行研究。在食品安全問題越發(fā)引人關(guān)注的今天，很少有人用生物學(xué)方法對去除多酚后植物源天然產(chǎn)物的細(xì)胞毒性進(jìn)行毒理學(xué)評價(jià)。本研究擬以新鮮山核桃為原材料，通過PVPP吸附法去除其中的多酚，用人源神經(jīng)腫瘤細(xì)胞系和人源正常細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性為指標(biāo)，對植物源天然產(chǎn)物的多酚去除效果進(jìn)行評價(jià)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

當(dāng)年新產(chǎn)未加工的新鮮山核桃臨安天則山核桃有限公司采購；表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP）的人類神經(jīng)母（SH-SY5Y-EGFP）細(xì)胞株、人臍靜脈正常內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC） 杭州紐龍生物科技有限公司；沒食子酸、福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑、PVPP（交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮）、MTT試劑盒上海生工生物工程有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、ECM培養(yǎng)基、青霉素（100mg/L）、鏈霉素（100mg/L） Gibco公司；96孔板康寧公司；胎牛血清杭州四季青生物工程有限公司。

M illi-Q超純水系統(tǒng)美國M illipore公司；CF16RXⅡ高速冷凍離心機(jī)日本HITACHI公司；ClassⅡBSC生物安全柜新加坡ESCO公司；MCO-18AIC細(xì)胞培養(yǎng)箱日本三洋公司；PM I-3000B熒光倒置相差顯微鏡德國徠卡公司；MULTISKAN-FC酶標(biāo)儀Thermo公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1山核桃水溶性成分的提取取山核桃仁15g，用液氮快速冷凍處理后研磨至粉狀，加入0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，pH7.2）30m L，置37℃搖床上以210r/m in的速度孵育2h。用移液器收集上清液，并用0.45μm濾膜處理上清液得到山核桃水提物溶液。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制稱取20mg沒食子酸，用去離子水定容至100m L。從中分別取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3和1.5m L，用去離子水定容至5m L，并各取1m L，在其中加入1m L福林酚試劑。靜置1min后加入1mol/L的Na2CO3溶液2m L，置于30℃恒溫水浴鍋中顯色1h。取300μL反應(yīng)液加入96孔酶標(biāo)板，于酶標(biāo)儀上765nm波長處測定吸光度，每樣品設(shè)置5個(gè)機(jī)械重復(fù)，用測得的吸光度扣除孔板本底后的平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［10-12］。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=0.032x+ 0.063，回歸系數(shù)為R2=0.999。

1.2.3總多酚的含量測定采用福林酚比色法［10-12］測定總多酚含量，即取1m L制備得到的水溶性成分待測樣品，加入1m L福林酚試劑，靜置1min，加入0.1g/m L的Na2CO3溶液2m L，置于30℃恒溫水浴鍋中孵育1h，于酶標(biāo)儀中765nm處測定吸光度，并將吸光度擬合到標(biāo)準(zhǔn)曲線可得多酚含量。

1.2.4人類神經(jīng)母瘤細(xì)胞（SH-SY5Y-EGFP）及人臍靜脈正常內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）培養(yǎng)在專用的細(xì)胞瓶中培養(yǎng)，分別用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基和ECM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱的條件設(shè)置為5%的環(huán)境CO2、37℃的環(huán)境溫度，每兩天更換一次培養(yǎng)基。

1.2.5山核桃水提液中多酚細(xì)胞毒性觀察與測定取生長對數(shù)期細(xì)胞以每孔2×104細(xì)胞的初始密度接種于96孔板中，2d后更換細(xì)胞培養(yǎng)基。再加入未經(jīng)PVPP處理的山核桃水提液，使山核桃水提液最終體積濃度分別為1%、5%、10%，對應(yīng)的山核桃質(zhì)量濃度（按生藥量計(jì)算）分別為5、25和50mg/m L，空白對照組設(shè)置為加同樣體積的PBS，陽性組則為100μg/m L的沒食子酸。處理24h后，用倒置熒光電子顯微鏡觀察SHSY5Y-EGFP細(xì)胞的存活量及狀態(tài)（細(xì)胞帶有EGFP，在熒光顯微鏡下可直接觀察），并用MTT試劑盒法檢測SH-SY5Y-EGFP和HUVEC細(xì)胞相對存活率［13-15］。

1.2.6PVPP對山核桃水提物中多酚的吸附處理分別稱取10、20、30、40、50、60、70、80mg PVPP，加入1m L去離子水，室溫?fù)u床孵育過夜使PVPP充分吸漲。12000r/min離心5min并棄上清。每管中加入山核桃水提物1m L（山核桃仁0.5g），混勻之后搖床上處理1h，12000r/min離心5m in，收集上清。另取10m L干凈離心管分別加入1m L上述上清，1m L福林酚試劑以及2m L濃度為1mol/L的新鮮Na2CO3溶液，30℃條件下處理1h，取300μL反應(yīng)液加入96孔酶標(biāo)板，于酶標(biāo)儀上765nm波長處測定吸光度，每樣品設(shè)置5個(gè)機(jī)械重復(fù)。參照1.2.2制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算PVPP不同量處理對山核桃水提物中多酚吸附的影響［16-17］。

稱取8份40mg PVPP，分別加入1m L去離子水，室溫?fù)u床孵育過夜使PVPP充分吸漲。12000r/min離心5m in并棄盡上清。每管中加入山核桃水提物1m L（山核桃仁0.5g），混勻之后分別在搖床上孵育1、3、5、10、20、30、50、70m in，12000r/m in離心5m in，吸取上清。另取10m L干凈離心管分別加入1m L上述上清，1m L福林酚試劑以及2m L濃度為1mol/L的新鮮Na2CO3溶液，30℃條件下處理1h，取300μL反應(yīng)液加入96孔酶標(biāo)板，于酶標(biāo)儀上765nm波長處測定吸光度，每樣品設(shè)置5個(gè)機(jī)械重復(fù)。參照1.2.2制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算PVPP不同處理時(shí)間對去除山核桃水提物中多酚的影響［16-17］。

1.3多酚去除率及細(xì)胞死亡率計(jì)算

分別測定處理前山核桃水提物中的多酚含量（A）和處理后山核桃水提物中的多酚含量（B）；空白組細(xì)胞存活量（C），處理組細(xì)胞存活量（D）。按照下式計(jì)算：

多酚去除率（%）=（1-B/A）×100細(xì)胞死亡率（%）=（1-D/C）×100

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS l3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，各組之間的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的多因素方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1總多酚含量測定

通過對比標(biāo)準(zhǔn)曲線，用福林酚法測得去殼未加工的新鮮山核桃仁中總多酚濃度為1.1mg/g。

2.2PVPP不同量處理對去除山核桃水提物中多酚的影響

不同量PVPP處理山核桃水提物后，用福林酚試劑法測定水提物中多酚殘留來評估其去除效果。由圖1可知，10mg PVPP處理1m L山核桃水提物（0.5g山核桃仁）明顯地降低了水提物的多酚含量。隨著PVPP量的增加，山核桃水提物中多酚去除率逐漸趨向飽和，PVPP的量達(dá)到40mg時(shí)多酚去除率不再明顯增加。對不同量PVPP處理后山核桃水提物的多酚去除率進(jìn)行測算，結(jié)果顯示PVPP的量為10mg時(shí)多酚的去除率達(dá)到67%，隨著PVPP量的增加，多酚的去除率快速上升。PVPP的量為40mg時(shí)去除率達(dá)到85%，此后去除率上升趨勢變慢，PVPP的量為80mg時(shí)多酚去除率達(dá)到88.9%。

圖1　PVPP不同量對多酚去除率的影響Fig.1　Effectof amountof PVPP treatment on removal of polyphenols

2.3PVPP不同處理時(shí)間對山核桃水提物中多酚吸附的影響

根據(jù)PVPP不同量去除山核桃水提物多酚含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取40mg為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理用量，對處理不同時(shí)間后山核桃水提物與福林酚反應(yīng)液的吸光度計(jì)算多酚去除率。結(jié)果如圖2所示，在1～10m in的處理時(shí)間段內(nèi)，山核桃水提物中多酚的去除率明顯增加，至10m in時(shí)去除率達(dá)到84.6%。此后多酚去除率隨處理時(shí)間的增加并無太大變化。

圖2　PVPP不同處理時(shí)間對多酚去除率的影響Fig.2　Effectof time of PVPP treatmenton removal of polyphenols

圖3　PVPP處理前后山核桃水提液對SH-SY5Y-EGFP細(xì)胞的影響Fig.3　Effectof hickory nutswater extracts treated with and without PVPP on SH-SY5Y-EGFP cells

圖4　PVPP處理前后山核桃水提液對HUVEC細(xì)胞的影響Fig.4　Effectof hickory nutswater extracts treated with and without PVPP on HUVEC cells

2.4PVPP處理前后山核桃水提液對SH-SY5YEGFP及HUVEC細(xì)胞存活的影響

PVPP處理前后的山核桃水提物用PBS稀釋后，按濃度梯度處理細(xì)胞，使山核桃水提液最終體積濃度分別為1%、5%、10%，對應(yīng)的山核桃質(zhì)量濃度（按生藥量計(jì)算）分別為5、25和50mg/m L。從圖3可以看出，用PVPP未處理過的山核桃水提物處理SH-SY 5YEGFP細(xì)胞，其細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯低于PVPP處理過的山核桃水提物實(shí)驗(yàn)組。由圖5A可以看出，通過MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率發(fā)現(xiàn)，山核桃水提物PVPP未處理組的細(xì)胞存活率顯著低于處理組（p＜0.01），且有劑量效應(yīng)。由圖4和圖5B可以看出，在HUVEC正常細(xì)胞中，山核桃水提物PVPP未處理組不僅細(xì)胞數(shù)量明顯低于處理組，而且細(xì)胞形態(tài)明顯畸形，MTT檢測發(fā)現(xiàn)PVPP未處理組細(xì)胞存活率明顯低于處理組（p＜0.01），說明癌細(xì)胞株和正常細(xì)胞對山核桃多酚呈現(xiàn)同樣的毒性反應(yīng)。同時(shí)也說明PVPP處理前的山核桃水提液的細(xì)胞毒性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于處理后的，因此用PVPP可以有效地將多酚去除到一個(gè)對細(xì)胞安全的水平。

圖5　PVPP處理前后山核桃水提液對SH-SY5Y-EGFP及HUVEC細(xì)胞死亡率的影響Fig.5　Effectof hickory nutswater extracts treated with and without PVPP on cells death rate

3　結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)利用福林酚試劑法測得山核桃鮮果仁多酚含量。利用PVPP吸附技術(shù)對山核桃鮮果仁多酚含量進(jìn)行去除，并研究PVPP用量及處理時(shí)間對山核桃多酚去除率的影響。分析得出新鮮山核桃仁中總多酚濃度為1.1mg/g，去除其多酚時(shí)，最佳量效比為8%（40mgPVPP/500mg鮮山核桃），時(shí)間為10m in，一次去除率可達(dá)84.6%。質(zhì)量比為16%（80mgPVPP/500mg鮮山核桃），時(shí)間為1h時(shí)，去除率達(dá)到88.9%。對比之前關(guān)于多酚吸附的其他方法［18-20］，發(fā)現(xiàn)PVPP有一系列優(yōu)勢，如表1所示。

表1　PVPP去除多酚的優(yōu)勢Table 1　The advantages of PVPP to remove polyphenols

再對比之前PVPP對其他植物多酚去除效率［21-22］的報(bào)道，比如對綠茶飲料中茶多酚以及余甘果汁中多酚的去除，其最佳去除率分別約為50%和89.2%，而本實(shí)驗(yàn)最佳去除率達(dá)到88.9%，用PVPP去除山核桃中多酚的效果已經(jīng)達(dá)到之前文獻(xiàn)報(bào)道的最佳水平。進(jìn)一步，用生物毒理學(xué)評估方法驗(yàn)證PVPP去除多酚達(dá)到了一個(gè)生物安全的水平。

通過建立體外細(xì)胞模型，檢測PVPP處理前后的山核桃水提液對細(xì)胞的毒性。未處理的山核桃水提物體積濃度為1%～10%時(shí)，無論是SH-SY5Y-EGFP腫瘤細(xì)胞還是HUVEC正常細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡，細(xì)胞死亡率從40%左右上升到70%左右，具有明顯的劑量效應(yīng)，說明山核桃含有的多酚對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞均具極為明顯的細(xì)胞毒性。相反，PVPP處理后的山核桃鮮果仁水提物對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞均未呈現(xiàn)細(xì)胞毒性，說明腫瘤細(xì)胞株可以用來替代正常細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性評估，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞繁殖更快，所以可以節(jié)省毒理學(xué)評估時(shí)間，節(jié)約成本。PVPP處理方法可以將以山核桃為代表的植物源天然產(chǎn)物水溶性成分中多酚去除到一個(gè)對人體細(xì)胞安全的水平，有效消除可能會對人體產(chǎn)生的潛在危害。

由以上分析可知，按照文中的評估方法，用PVPP去除多酚并創(chuàng)新性地結(jié)合體外細(xì)胞模型，不僅得到更好的時(shí)間以及量效關(guān)系，而且體外細(xì)胞模型可以用來評估多酚去除到什么程度就達(dá)到安全水平，為工業(yè)界在多酚去除工藝上做到既降低成本又保障安全提供一種既科學(xué)，又簡單、省錢的評價(jià)方法。為此類物質(zhì)在食品和飲料等工業(yè)或者生物技術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)一步利用和研究提供了更多的選擇，也為多酚研究開創(chuàng)了新思路。

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Toxicologicalevaluation of polyphenol removal from hickory nuts by polyvinylpolypyrolidone（PVPP）

ZHOU Yu，HUANG Jian-qin，GAO Fei，WANG Xiang-jun，QIAN Yong-chang*
（Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，School of Forestry and Biotechnology，Zhejiang A&FUniversity，Lin’an 311300，China）

There were many studies for the removal of polyphenols in beverage and food industries which used fresh p lant-derived natural p roducts as raw materials.Most of the studies had used the percentage as an ind icator to assess the removal of polyphenols and there was a rare study to use any toxicological ind icator to evaluate the removal of p lant-derived polyphenols.This study used PVPP to remove polyphenols from water extracts of fresh hickory nuts and a neuronal cellmodel to test cytotoxicity of polyphenols for evaluation the efficiency of polyphenol removal by PVPP.Data showed that PVPP treatment could significantly remove polyphenols and the efficiency of removal reached at 84.6%when 40mg PVPP was used to treat the water extract from 500mg of fresh hickory nuts for 10m in.The efficiency of polyphenol removalwas further confirmed by observation of neuronal cellmorphology with fluorescencem icroscopy and determ ination of cell viability with MTT assay.Data showed that the extract w ithout PVPP treatment significantly（p＜0.01）induced cell death in both SH-SY5Y-EGFP tumor cell line and HUVEC p rimary cell cultures in a dose-dependent manner.In contrast，the extractw ith PVPP treatmenthad no significant influence on viability of both SY5Y cells and HUVEC cells.These results suggested that the extrac t from hickory nuts contains polyphenols had showed a significant cytotoxicity to both tumor cells and normal cells.PVPP treatment could efficiently remove polyphenols and significantly reduced cytotoxicity ofwater extrac t from hickory nuts.

Carya cathayensis Sarg；polyvinylpolypyrolidone；toxicologicalevaluation；polyphenols

TS255.6

A

1002-0306（2015）06-0104-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.015

2014-06-09

周瑜（1989-），男，在讀碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物活性因子的開發(fā)和利用方面的研究。

錢永常（1962-），男，博士，主要從事神經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤細(xì)胞生物學(xué)及天然藥物方面的研究。

浙江農(nóng)林大學(xué)科研發(fā)展基金（2012FR017）；浙江省自然科學(xué)基金（LQ14H280007）；浙江農(nóng)林大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基礎(chǔ)項(xiàng)目（3122013240287）。