木香超臨界提取物的安全性及功能性研究

張 琨 高 峰 孟令儀 宋昕恬 吳曉剛 張晶瑩

（吉林省疾病預(yù)防控制中心，吉林 長春 130062）

木香超臨界提取物的安全性及功能性研究

張 琨 高 峰 孟令儀 宋昕恬 吳曉剛 張晶瑩

（吉林省疾病預(yù)防控制中心，吉林 長春 130062）

目的 研究一種含木香超臨界提取物軟膠囊的安全性及對胃黏膜損傷保護(hù)作用。方法 采用MTD法以20 g/kg BW進(jìn)行小鼠急性毒性試驗(yàn)；以10、5、2.5 g/kg BW三個(gè)劑量進(jìn)行小鼠骨髓微核及精子畸形試驗(yàn)；以5000、1000、200、40、8微克/皿5個(gè)劑量進(jìn)行Ames試驗(yàn)；以0.83、0.625、0.417 g/kg BW三個(gè)劑量進(jìn)行30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)；以0.25、0.08、0.04 g/kg BW三個(gè)劑量進(jìn)行胃黏膜損傷保護(hù)性研究。結(jié)果 該軟膠囊雌、雄性小鼠MTD＞20.0 g/kg BW，屬無毒級；小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)及Ames試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，無致突變性；30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)未見任何異常表現(xiàn)；0.25，0.08 g/kg BW兩個(gè)劑量組大鼠與模型對照組比較胃黏膜損傷面積明顯降低（P＜0.01），損傷抑制率明顯增加（P＜0.01）。結(jié)論 該軟膠囊未見毒性，且在一定劑量范圍內(nèi)對胃黏膜損傷有保護(hù)作用。

木香超臨界提取物；安全性；胃黏膜損傷；保護(hù)作用

木香系菊科植物木香的干燥根，具有行氣止痛、消食健脾之功效，是治療胃腸疾病的常用藥［1］。而超臨界二氧化碳萃取具有常溫、無毒、使用安全簡便、時(shí)間短、產(chǎn)品質(zhì)量高等特點(diǎn)，能有效提取木香中的活性成分木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯，且其總量＞50%，該活性成分具有松弛平滑肌、解痙、抗菌以及降壓作用［2］。木香的安全性方面我們查閱了文獻(xiàn)：大鼠的腹腔注射LD50總內(nèi)酯為300 mg/kg，二氫木香內(nèi)酯200 mg/kg?？偵飰A小鼠靜脈注射的最大耐受量為100 mg/kg，大鼠為90 mg/kg。木香揮發(fā)油混入大鼠飼料中，每日服量為1.77 mg/kg（雄性）與2.17 mg/kg（雌性），連續(xù)給藥90 d對大鼠的生長、血常規(guī)與血尿素氮均無影響，主要臟器的病理檢查亦未見異常［3］?；谝陨腺Y料，本文對新研制的保健食品進(jìn)行了毒性及功能性評價(jià)。

1　材料與方法

1.1樣品：該提取物軟膠囊內(nèi)容物為6000 g木香采用超臨界二氧化碳法萃取出的提取油加橄欖油混合至1000 g（經(jīng)測定每100 g成品含木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯4 g），樣品為油狀液體，動物實(shí)驗(yàn)各劑量樣品用大豆油配制。

1.2試驗(yàn)動物：SPF級動物Wistar大白鼠及ICR小白鼠由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，批準(zhǔn)證號：SCXK-（吉）2011-0004。飼養(yǎng)條件：實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境設(shè)施合格證，吉?jiǎng)釉O(shè)字10-1005，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK-（吉）2010-0011；溫度20～22 ℃、濕度55%～65%；飼料由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，合格證號：SCXK-（吉）2010-0001。

1.3主要儀器和試劑：德國Sartorius-BL610電子天平，美國ELECTRONIC SCALET1000電子天平，日本Olympus-CH顯微鏡，日本SYSMEX-XT1800i血球分析儀，日本東芝TBA-120FR全自動生化分析儀，Leica病理制片系統(tǒng)等；環(huán)磷酰胺，血液學(xué)指標(biāo)及血生化試劑盒，無水乙醇，甲醛等。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1急性毒性試驗(yàn)［4］采用最大耐受劑量（MTD）法，設(shè)20 g/kg BW一個(gè)劑量組。雌、雄小鼠各10只（體質(zhì)量18～22 g）禁食16 h，不限飲水，經(jīng)口灌胃給予樣品觀察14 d（中樞神經(jīng)系統(tǒng)及軀體運(yùn)動有無改變姿勢、叫聲異常、運(yùn)動失調(diào)等；有無瞳孔放大或縮小、流淚等；有無流鼻涕、潮式呼吸等；胃腸有無氣脹，腹瀉或便秘等），記錄出現(xiàn)中毒癥狀及死亡數(shù)和時(shí)間。對死亡動物做大體解剖。

1.4.2微核試驗(yàn)［4］設(shè)10、5、2.5 g/kg BW三個(gè)劑量組，另設(shè)陰性對照組（大豆油）、陽性對照組（環(huán)磷酰胺40 mg/kg BW），采用間隔24 h兩次經(jīng)口灌胃法，雌、雄小鼠各25只（體質(zhì)量25～30 g），隨機(jī)分組，灌胃量為0.2 mL/10g BW。第二次灌胃后6 h，頸椎脫臼處死小鼠，取股骨以小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，Giemsa染色。光鏡下，每只動物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.3精子畸形試驗(yàn)［4］劑量組及對照組設(shè)置及灌胃量同微核試驗(yàn)，雄性小鼠25只（體質(zhì)量25～30 g），隨機(jī)分組，每日灌胃一次，連續(xù)5 d。在第30天完成最后一次灌胃后將小鼠處死，取附睪制片，伊紅染色，每只動物計(jì)數(shù)1000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子，計(jì)算畸變精子發(fā)生率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.4Ames試驗(yàn)［4］設(shè)5000、1000、200、40、8微克/皿5個(gè)劑量，二甲基亞砜作為溶劑，受試液經(jīng)滅菌（時(shí)間20 min，溫度：121 ℃，壓力：0.103 Mpa）后使用；另設(shè)未處理對照、溶劑對照、陽性對照。測試菌株采用鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102。測試菌液濃度每毫升不少于1×109活菌數(shù)。陽性對照：非活化系統(tǒng)TA97、TA98、TA102為敵克松50.0微克/皿，TA100為疊氮鈉1.5微克/皿?；罨到y(tǒng)TA97、TA98、TA100采用二氨基芴10.0微克/皿，TA102為1，8-二羥基蒽醌50.0微克/皿。采用平板摻入法計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。樣品的回變菌落數(shù)是自發(fā)回變菌落數(shù)2倍以上，并具有劑量-反應(yīng)關(guān)系者則視為陽性。每個(gè)劑量做三個(gè)平行。整套試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)做2次并分別統(tǒng)計(jì)。

表1　樣品對胃黏膜損傷積分及改善程度比較

圖1　樣品對乙醇急性胃黏膜損傷的保護(hù)作用

1.4.530 d喂養(yǎng)試驗(yàn)［4］分為溶劑對照組及三個(gè)劑量組（0.83、0.625、0.417 g/kg BW），每組雌雄各10只。灌胃量1 mL/100g BW。單籠喂養(yǎng)，自由飲食，記錄大鼠每周進(jìn)食量、體質(zhì)量，連續(xù)觀察30 d。包括一般情況觀察（動物的一般表現(xiàn)行為、中毒癥狀及死亡情況，計(jì)算周食物利用率及總食物利用率）；檢測血液學(xué)指標(biāo)（血紅蛋白、紅細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞分類）及血液生化指標(biāo)；病理檢查包括大體解剖、臟器絕對重量和相對重量（臟/體比值）、組織病理檢查。

1.4.6對胃黏膜損傷有輔助保護(hù)功能試驗(yàn)［5］設(shè)0.25、0.08、0.04 g/kg BW三個(gè)劑量組及模型對照組（給予大豆油），灌胃量1 mL/100g BW，每周稱重調(diào)整灌胃量。各組灌胃30 d后，全部動物嚴(yán)格禁食24 h（不禁水）各組動物灌胃給予無水乙醇1毫升/只，1 h之后處死動物，將胃完全暴露，結(jié)扎幽門，灌注適量10%甲醛溶液，固定20 min，然后沿胃大彎剪開，把胃內(nèi)容物清洗干凈，將胃黏膜展開，在體視解剖顯微鏡下或肉眼下用游標(biāo)卡尺測量出血點(diǎn)或彌漫性出血帶的長度和寬度，因?qū)挾人頁p傷的嚴(yán)重性遠(yuǎn)較長度大，故雙倍積分。大體檢查完畢，將每只動物胃黏膜損傷最嚴(yán)重的部位切下，固定于10%甲醛溶液，制常規(guī)片，HE染色，鏡下觀察。以充血、出血、黏膜細(xì)胞變性壞死在整個(gè)黏膜上皮層的累及程度分為5級。充血權(quán)重為1，出血權(quán)重為2，上皮細(xì)胞變性壞死權(quán)重為3。測量及鏡檢后參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。

1.5結(jié)果判定：數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析進(jìn)行均值比較，率的比較采用卡方檢驗(yàn)。認(rèn)為P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1急性毒性試驗(yàn)：各組動物未見中毒癥狀、死亡數(shù)為零。雌、雄性小鼠：MTD＞20 g/kg BW。根據(jù)急性毒性半數(shù)致死劑量分級，屬無毒級。

2.2微核試驗(yàn)：與陰性對照組比較，陽性對照組微核率有高度顯著性差異（P＜0.01），各劑量組微核率無顯著性差異（P＞0.05）；經(jīng)方差分析，各組動物PCE/NCE值無顯著性差異（P＞0.05）。骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果陰性，未見細(xì)胞毒性作用。

2.3精子畸形試驗(yàn)：與陰性對照組比較， 陽性對照組精子畸形率有高度顯著性差異（P＜0.01），各劑量組精子畸形率無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果為陰性。

2.4Ames試驗(yàn)：加與不加S9結(jié)果均為陰性，即未見致突變作用。

2.5對胃黏膜損傷有輔助保護(hù)功能試驗(yàn)：給予樣品30 d，所有大鼠生長、活動無出現(xiàn)異常情況。給予無水乙醇后損傷發(fā)生率均為100%，但0.25，0.08 g/kg BW兩個(gè)劑量組大鼠胃黏膜損傷面積明顯少于模型對照組（P＜0.01），損傷抑制率有明顯增加（P＜0.01），呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系，證實(shí)該樣品對乙醇急性胃黏膜損傷具有保護(hù)作用（表1及圖1）。

3　討 論

本文對新研制的保健食品——含橄欖油的木香提取物軟膠囊進(jìn)行了二階段毒性試驗(yàn)，在確保其安全性基礎(chǔ)上，得出0.25，0.08 g/kg BW兩個(gè)劑量具有對胃黏膜損傷有輔助保護(hù)作用的結(jié)論。分析其機(jī)制與該軟膠囊內(nèi)含有的木香超臨界二氧化碳法萃取油（木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯）的主要作用相關(guān)，此前已有過報(bào)道［6］通過正常小鼠及利血平脾虛小鼠的胃排空和小腸炭末推進(jìn)測定，發(fā)現(xiàn)不同劑量的木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯，胃排空都有明顯改善，加快胃的排空可以減少乙醇在胃內(nèi)的停留繼而輔助保護(hù)胃黏膜，減輕乙醇急性損傷對胃黏膜造成的損害。另外，侯鵬飛等［7］首次發(fā)現(xiàn)木香揮發(fā)油及去氫木香內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯具有抑制二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集活性。而邵蕓等采用小鼠耳廓、足跖炎性腫脹程度測定和大鼠膽汁排泄量測定表明［8］木香醇提取物其具有較好的抗炎、利膽作用，這些也都是該軟膠囊輔助改善乙醇產(chǎn)生的急性胃黏膜損傷保護(hù)作用的機(jī)制所在。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：41-42.

［2］陳虹，鄧修.木香揮發(fā)油的超臨界CO2萃取及質(zhì)量研究［J］.中草藥，1997，28（6）：337.

［3］苗明三，朱飛朋.實(shí)用中藥毒理學(xué)［M］.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2007：379.

［4］中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）［S］.

［5］國食藥監(jiān)?；?012］107號附件2［S］.

［6］侯影，張旭.木香生品、麩煨品及活性單體對小鼠胃腸運(yùn)動的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，24（17）：132-135.

［7］侯鵬飛，陳文星.木香揮發(fā)性成分氣質(zhì)聯(lián)用分析及其抑制血小板聚集作用的研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，7（14）：26-30.

［8］邵蕓，黃芳.木香醇提取物的抗炎利膽作用［J］.江蘇藥學(xué)與臨床研究，2005，4（13）：5-6.

Study on the Safety and Functionality of Supercritical Extract of Aucklandia

ZHANG Kun， GAO Feng， MENG Ling-yi， SONG Xin-tian， WU Xiao-gang， ZHANG Jing-ying
（Jilin Province CDC， Changchun 130062， China）

Objective To study the safety and protective effect to gastric mucosal damage of soft capsule including supercritical extract of Aucklandia. Methods Use the way of maximum tolerated dose 20 g/kg BW to do the acute toxicity test with mice； Use the dose of 10， 5， 2.5 g/kg BW to do marrow micronucleus and teratospermia test with mice； Use the dose of 5000， 1000， 200， 40， 8 μg/dish to do the Ames test. Use the dose of 0.83， 0.625， 0.417 g/kg BW to do the 30 days feed test with rat； Use the dose of 0.25， 0.08， 0.04 g/kg BW to study protective effect after gastric mucosal damage with rat. Result The MTD of this soft capsule is over 20 g/kg BW， it is in non-toxic level. We get the negative result in marrow micronucleus and teratospermia test and Ames test， it means non-mutagenicity. Abnormal phenomenon were not be seen in the 30 days feed test. In the test of protective effect after gastric mucosal damage with rat， we can see obvious reduce of gastric mucosal damage area and marked increase of damage inhibition ratio with the dose of 0.25， 0.08 g/kg BW compared with modelcontrol group. Conclusion This kind of soft capsule is safe and can protect the gastric mucosal damage with some range of dose.

Supercritical extract of Aucklandia； Safety； Gastric mucosal damage； Protective effect

R9

B

1671-8194（2015）012-0027-02