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    基因的生物信息學(xué)分析

    2015-10-20 21:02:19高南等
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年9期
    關(guān)鍵詞:水稻

    高南等

    摘要:Shaker類型K+通道在植物鉀的吸收、轉(zhuǎn)運及其他生理過程中發(fā)揮著重要作用。AKT2/3是Shaker類型K+通道中唯一既主導(dǎo)K+內(nèi)流,又允許去極化情況下K+滲漏性外流的通道。水稻OsAKT2/3蛋白的生物信息學(xué)分析表明,OsAKT2/3蛋白含有K+通道的標(biāo)志性序列TxxTxGYGD;該基因分子式為C4219H6693N1179O1233S35,理論等電點為664,氨基酸殘基組成中亮氨酸殘基含量最高;有一定的親水性,為跨膜蛋白;可能存在31個翻譯后修飾位點、5種結(jié)構(gòu)域、52個磷酸化位點,不含信號肽;序列主要構(gòu)件為α-螺旋和折疊延伸;該蛋白與其他植物的AKT2/3家族成員具有較高的同源性。試驗結(jié)果為OsAKT2/3基因生理功能的深入研究提供一定依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:水稻;二級結(jié)構(gòu);磷酸化位點;三級結(jié)構(gòu);系統(tǒng)進(jìn)化

    中圖分類號:Q785;Q945.12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號:1002-1302(2015)09-0025-03

    鉀是植物必需的大量元素,對提高作物產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)起著重要作用。水稻(Oryza sativa L.)對鉀素的需求量較大,不同基因型的水稻對土壤中鉀素的吸收利用存在很大差異[1]。缺鉀可影響細(xì)胞滲透壓平衡,進(jìn)而引起器官機能的破壞,影響植物的正常生長;并通過植物激素調(diào)節(jié)破壞植物體內(nèi)的代謝和轉(zhuǎn)運過程,導(dǎo)致作物的產(chǎn)量和品質(zhì)大幅下降[2]。我國大部分耕地土壤供鉀不足,其中嚴(yán)重缺鉀土壤(速效鉀<50 mg/kg)約2 000萬hm2,占耕地面積的20%以上,且主要分布于我國的水稻產(chǎn)區(qū);因此,需施用鉀素化肥以保證水稻的豐產(chǎn)和品質(zhì),而我國鉀礦資源十分匱乏,95%以上的鉀肥供應(yīng)依賴進(jìn)口[3]。K+通道在植物體內(nèi)的表達(dá)能改良植物的鉀素營養(yǎng)性狀[4-5];因此,挖掘植物中鉀吸收利用的基因并研究其生理功能,對水稻鉀營養(yǎng)性狀的改良及現(xiàn)有鉀素資源的利用具有重要意義。Shaker類型K+通道在植物鉀的吸收、轉(zhuǎn)運及其他生理過程中發(fā)揮著重要作用[2,6-7]。AKT2/3是Shaker類型K+通道中唯一既主導(dǎo)K+內(nèi)流、又允許去極化情況下K+滲漏性外流的通道,其電生理特征表現(xiàn)為弱內(nèi)向整流、能夠感應(yīng)K+水平、受Ca2+和H+調(diào)控[8-9]。其獨有的滲漏型電流,在過量K+迅速吸收進(jìn)入細(xì)胞而導(dǎo)致的膜電位去極化情況下,通過胞內(nèi)K+的滲漏從而實現(xiàn)對膜電位的精確微調(diào)作用[10]。目前,水稻的基因組測序已經(jīng)完成,但關(guān)于水稻K+通道的研究尚較少[11-13]。本研究利用生物信息學(xué)的方法對水稻OsAKT2/3蛋白的理化性質(zhì)、核苷酸序列組成、跨膜結(jié)構(gòu)、親水性、疏水性、亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析,并對其結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,最后進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,以全面了解OsAKT2/3基因,為該基因生理功能的深入研究提供依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1材料

    NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫已注冊水稻OsAKT2/3基因(JN989970.1)、擬南芥[Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.]的AKT2/3(NP_567651.1)、大麥(Hordeum vulgare L.)的HvAKT2(ABE99811.1)、雨樹[Samanea saman (Jacq.)Merr.]的SPICK1(AAD16278.1)和SPICK2(AAD39492.1)、歐美楊(Populus tremula L.×Populus tremuloides Michx.)的PTK2(CAC05489.1)、玉米(Zea mays L.)的ZMK2(NP_001105120.1)。1.2方法

    OsAKT2/3蛋白的理化性質(zhì)使用ProtParam軟件在線分析;蛋白跨膜結(jié)構(gòu)使用TMHMM軟件在線分析;親水性及疏水性使用ProtScale軟件在線分析;蛋白亞細(xì)胞定位使用TargetP軟件、WoLF PSORT軟件在線分析;蛋白序列上潛在的結(jié)構(gòu)域和功能位點使用MotifScan軟件、CCD軟件預(yù)測;蛋白磷酸化位點使用NetPhos軟件在線分析;蛋白信號序列使用SignalP4.1軟件在線分析;蛋白二級結(jié)構(gòu)使用SOPMA軟件在線分析;蛋白三級結(jié)構(gòu)使用Phyre2軟件在線分析;利用MEGA 6.05軟件,采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。上述各分析軟件的網(wǎng)址見表1。

    2結(jié)果與分析

    2.1OsAKT2/3蛋白的理化性質(zhì)分析

    由序列分析結(jié)果可知,OsAKT2/3蛋白含有K+通道的標(biāo)志性序列TxxTxGYGD。用ProtParam軟件分析得知,OsAKT2/3 蛋白共有13 359個原子,分子量為94 783.8,蛋白的分子式為C4219H6693N1179O1233S35,理論等電點為6.64。在855個氨基酸殘基組成中,OsAKT2/3蛋白的N端為蛋氨酸,含量較高的氨基酸殘基包括亮氨酸殘基(10.2%)、纈氨酸殘基(8.5%)、甘氨酸殘基(7.3%)、精氨酸殘基(7.1%)、絲氨酸殘基(7.1%);含量較低的氨基酸殘基包括色氨酸殘基(1.1%)、半胱氨酸殘基(1.4%)等。帶負(fù)電荷的氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)殘基為99個;帶正電荷的氨基酸(精氨酸、賴氨酸)殘基為95個。OsAKT2/3蛋白在哺乳動物、酵母、大腸桿菌中的半衰期分別為30 h(體外)、>20 h(體內(nèi))、>10 h(體內(nèi)),不穩(wěn)定指數(shù)為39.03,該蛋白為穩(wěn)定蛋白。

    2.2OsAKT2/3蛋白的親水性、疏水性、亞細(xì)胞定位

    使用ProtScale軟件預(yù)測OsAKT2/3蛋白的親水性及疏水性可知,氨基酸的最低分值為-2.967,最高分值為3.133(圖1)。整體來看,親水性氨基酸殘基分布于整條肽鏈,且多于疏水性氨基酸殘基。使用TMHMM軟件進(jìn)行預(yù)測,將參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值,可知OsAKT2/3蛋白為跨膜蛋白。WolfPsort軟件預(yù)測該蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)膜上,TargetP軟件預(yù)測該蛋白在葉綠體膜上的可能性為79.6%。

    2.3OsAKT2/3蛋白結(jié)構(gòu)域、功能位點的預(yù)測

    OsAKT2/3蛋白序列上潛在的結(jié)構(gòu)域、功能位點使用MotifScan軟件、CCD軟件進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果表明,該蛋白可能存在的翻譯后修飾位點包括1個酰胺化位點、4個N-糖基化位點、1個cAMP磷酸化位點、11個酪蛋白激酶Ⅱ位點、7個?;稽c、7個蛋白激酶磷酸化位點;發(fā)現(xiàn)5種結(jié)構(gòu)域,分別為錨蛋白重復(fù)(ANK,cd00204)、環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CAP_ED,cd00038)、未知功能的DUF3354超級家族結(jié)構(gòu)域(DUF3354,pfam11834)、離子轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(Ion_trans_2,pfam07885)、電壓依賴的鉀離子通道結(jié)構(gòu)域(PLN03192,PLN03192)(圖2)。該蛋白具有Shaker基因家族的典型特征,即蛋白的N末端包括6個跨膜區(qū)(S1~S6),有電壓感受區(qū)和高度保守的通道孔區(qū)。使用磷酸化位點預(yù)測程序NetPhos 2.0發(fā)現(xiàn)OsAKT2/3蛋白有37個潛在的絲氨酸磷酸化位點、7個潛在的蘇氨酸磷酸化位點、8個潛在的酪氨酸磷酸化位點。使用SignalP 4.1 Server軟件在線分析OsAKT2/3蛋白的信號肽情況,結(jié)果顯示該蛋白不含信號肽序列。

    2.4OsAKT2/3蛋白二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)的分析

    使用SOPMA軟件預(yù)測OsAKT2/3蛋白的二級結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示OsAKT2/3蛋白由43.16%的α-螺旋、17.19%的折疊延伸、8.30%的β-轉(zhuǎn)角、31.35%的無規(guī)則卷曲構(gòu)成,其中折疊延伸和β-轉(zhuǎn)角不均勻分布于整個蛋白質(zhì)的多肽鏈上。依據(jù)模板c2ptmA,采用折疊識別法,使用Phyer2軟件在線預(yù)測OsAKT2/3蛋白序列主鏈原子位置,生成預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)模型(圖3),并依據(jù)能量最小化原理使側(cè)鏈集團處于能量最小的位置。該蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成,與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相似。

    2.5OsAKT2/3編碼基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

    在NCBI上共選取6種植物的7個AKT2/3基因序列,以擬南芥KAT1基因作為外群,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示,水稻OsAKT2/3在進(jìn)化上與單子葉植物玉米的ZMK2、單子葉植物大麥的HvAKT2的親緣關(guān)系較近,與雙子葉植物擬南芥的AKT2/3等有較高的相似度(圖4)。

    3結(jié)論與討論

    蛋白質(zhì)的功能不僅取決于其一級結(jié)構(gòu),在很大程度上也取決于其高級結(jié)構(gòu)。生物信息學(xué)綜合運用數(shù)學(xué)、計算機技術(shù)、生物學(xué)的各種工具,較好地闡明和理解大量數(shù)據(jù)所包含的生物學(xué)意義?;蛐蛄屑捌涮匦苑治觥⒌鞍踪|(zhì)空間結(jié)構(gòu)模擬等是生物信息學(xué)的重要組成部分。利用生物信息學(xué)的原理,通過計算機模擬相關(guān)的輔助信息,可在較短時間內(nèi),用較低成本獲得大量可靠的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能信息[14-15]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)資源,在前期獲得水稻OsAKT2/3的基礎(chǔ)上,應(yīng) 用ProtParam、TMHMM等分析軟件,對OsAKT2/3蛋白的亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點、二級結(jié)構(gòu)等蛋白特性進(jìn)行預(yù)測,并對其三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析模擬,以期盡可能多地獲得該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的信息,為OsAKT2/3基因功能的研究提供更多、更可靠的理論依據(jù)。

    Shaker類型K+通道在植物鉀的吸收、轉(zhuǎn)運及其他生理過程中發(fā)揮著重要作用[2,6,11]。OsAKT2/3蛋白含有K+通道的標(biāo)志性序列TxxTxGYGD;該基因分子式為C4219H6693N1179O1233S35,理論等電點為6.64,氨基酸殘基組成中亮氨酸殘基含量最高;有一定的親水性,為跨膜蛋白;可能存在31個翻譯后修飾位點、5種結(jié)構(gòu)域、52個磷酸化位點,不含信號肽;序列主要構(gòu)件為α-螺旋和折疊延伸;該蛋白與其他植物的AKT2/3家族成員具有較高的同源性。本試驗結(jié)果為OsAKT2/3基因生理功能的深入研究提供一定依據(jù)。然而,同源性僅是基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)上的類似,雖然某些典型功能相近,但來源不同的同源通道常表現(xiàn)出獨特之處。在氨基酸序列、關(guān)鍵結(jié)構(gòu)元件上,玉米的ZmK2.1 K+通道與擬南芥的KAT1通道均高度同源,但其功能特征卻存在顯著差異[16]。與其他AKT2/3型K+通道相比,OsAKT2/3的功能特征是否存在獨特之處仍需進(jìn)一步研究。

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