側(cè)枝萌發(fā)誘導(dǎo)基因（LIF）的原核表達與農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化麻風(fēng)樹幼

葉宗樺等

摘要：麻風(fēng)樹（Jatropha curcas L.）的有限分枝是限制麻風(fēng)樹油產(chǎn)量的最主要因素之一，為了奠定基因調(diào)控麻風(fēng)樹分枝的基礎(chǔ)，研究并優(yōu)化了側(cè)枝萌發(fā)誘導(dǎo)基因LIF（lateral shoot-inducing factor ）的原核表達條件，并成功獲得了重組蛋白。通過研究農(nóng)桿菌濃度、抗生素濃度建立了穩(wěn)固高效的麻風(fēng)樹農(nóng)桿菌（（LBA4404）高效轉(zhuǎn)化體系；將LIF基因轉(zhuǎn)入麻風(fēng)樹基因組中，通過GUS染色、PCR、Southern blot檢測，確定了LIF基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化入麻風(fēng)樹基因組中，獲得了高達（23.91±5.78）%的轉(zhuǎn)化率。

關(guān)鍵詞：麻風(fēng)樹；側(cè)枝萌發(fā)誘導(dǎo)基因（LIF）；幼葉；農(nóng)桿菌

中圖分類號：Q943.2 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0014-06

收稿日期：2014-08-28

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：51308464）；西南交通大學(xué)科技創(chuàng)新項目（編號：A0920502051405-62）。

作者簡介：宗樺（1981—），女，江蘇宜興人，博士，講師，主要從事植物學(xué)研究。E-mail：14744632@qq.com。屬于大戟科的麻風(fēng)樹（Jatropha curcas L.）是一類具有極強抗旱性的大灌木或小喬木，其種子中含油豐富，并能較容易地轉(zhuǎn)化成純度能滿足美國和歐洲標準的生物柴油[1]。此外，麻風(fēng)樹油還可應(yīng)用于制造肥皂、化妝品、染料等產(chǎn)品[2-4]。然而，由于麻風(fēng)樹的種子產(chǎn)量較低，極大地限制了麻風(fēng)樹油的推廣應(yīng)用。迄今為止，提高麻風(fēng)樹種子的產(chǎn)量仍是一件十分困難的事情，這是由于麻風(fēng)樹的種子產(chǎn)量受到多種因素影響，如自然環(huán)境[5]、麻風(fēng)樹的分枝形態(tài)[6]、基因型[7]、經(jīng)營管理方法[8]等。在這些因素當(dāng)中，麻風(fēng)樹結(jié)果母枝的分枝形態(tài)被認為是最重要的制約因素之一，因此許多學(xué)者認為增加麻風(fēng)樹結(jié)果母枝的數(shù)量就能有效地提高麻風(fēng)樹種子的產(chǎn)量[8-9]。

近年來，世界各國都開始關(guān)注植物分枝發(fā)育控制機理的研究，通過采用包括突變體分離、定位、克隆相關(guān)基因和相關(guān)基因分析等分子生物技術(shù)等方法，不斷加深對植物分枝發(fā)育的認識。目前在許多物種，如矮牽牛[10-11]、煙草[12]、番茄、豌豆、玉米、水稻和擬南芥[13]中都開展了突變體作為分枝的變化模式研究。2005年，Nakagawa等從矮牽牛中克隆出了側(cè)枝萌發(fā)誘導(dǎo)基因LIF，是目前唯一一個被報道的分枝基因[14]。

Nakagawa等研究發(fā)現(xiàn)，LIF基因在矮牽牛、煙草、擬南芥中過量表達均可以導(dǎo)致植株分枝明顯增多，高度明顯降低，葉片小化[14]，由此Nakagawa等推斷，LIF基因在雙子葉植物中能保守地表達，可以調(diào)控雙子葉植物的分枝[14]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，LIF編碼的蛋白屬于一種TFⅢA型鋅指蛋白，具有這種類型結(jié)構(gòu)域的蛋白一般是結(jié)合DNA作為轉(zhuǎn)錄因子參于多種植物的調(diào)控過程。然而由于LIF被發(fā)現(xiàn)的時間短，因此針對LIF誘導(dǎo)的蛋白的功能研究還未開展。再加上植物分枝的形成是一個受多種因素影響的復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，因此，針對單個基因開展蛋白純化研究對于了解其在植物形態(tài)構(gòu)成上的功能有一定的難度。而通過重組的方式在大腸桿菌中進行原核表達為LIF基因的功能研究提供了一個良好的途徑。眾所周知，大腸桿菌是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中最常用的材料之一，目前除了己經(jīng)掌握了它的分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方面的大量資料外，在基因表達方面也有深入研究。大腸桿菌遺傳背景清楚，容易培養(yǎng)，能大規(guī)模發(fā)酵，并具有大量可供選擇利用的克隆和高效表達載體[15]。

本研究構(gòu)建了LIF原核表達載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，將轉(zhuǎn)化子進行誘導(dǎo)表達，獲得重組蛋白，摸索表達的最優(yōu)條件，為進一步探討LIF的功能奠定基礎(chǔ)。同時，將LIF基因轉(zhuǎn)入麻風(fēng)樹基因組，了解LIF基因在麻風(fēng)樹中的表達方式，為基因調(diào)控麻風(fēng)樹的分枝做好準備工作。

1材料與方法

1.1植物材料和菌株

試驗所用矮牽牛（Petunia hybrida Vilm）種苗種植在溫室（14 h光照/10 h黑暗，室溫22 ℃）中。成熟麻風(fēng)樹種子來源于攀枝花市。種苗種植于盛滿沙和營養(yǎng)土的塑料盆缽中，于溫室中生長2個月（16 h光照/8 h黑暗，室溫28 ℃）后，取第1～3節(jié)上的葉片用作試驗。滅菌后的麻風(fēng)樹幼葉切成為 1 cm2 的小塊，接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2 d。

Escherichia coli菌株BL21、農(nóng)桿菌菌株LBA4404均為筆者所在實驗室保存。

1.2矮牽牛LIF基因開放閱讀框獲得和原核表達載體構(gòu)建

1.2.1LIF基因ORF的擴增提取矮牽牛的RNA，用Oligo （dT）18為引物進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，設(shè)計引物lof33、lof52進行PCR擴增ORF序列。酶切位點（下劃線部分）分別為BamHⅠ、HindⅢ。引物序列如下：lof33：5′-CCCAAGCTTTCATAAGAACTTTCTTGTGCCTAAACC-3′；lof52：5 ′-CGCGGATCCATGGAAACTAGTAAAAATCAGCCGTC-3′；反轉(zhuǎn)錄引物：Oligo （dT）18：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG （T）18-3′。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物電泳后進行回收，回收按照DNA膠回收試劑盒的說明步驟進行。

1.2.2原核表達載體的構(gòu)建原核表達所用質(zhì)粒載體選用pET32[16]，含有T7啟動子、6個His標簽，具有Amp抗性。將膠回收的片段連接到pMD19-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)獲得轉(zhuǎn)化子pMD19-T-LIF，搖菌1 h后涂LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。于第2天挑菌，搖菌后送樣測序。經(jīng)測序檢測獲得LIF的ORF片段后，搖菌提質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ雙酶切載體pET32，膠回收線性載體。用T4連接酶連接目的片段與線性載體（均帶有BamHⅠ、HindⅢ黏性末端）。16 ℃連接過夜，獲得重組子pET-LIF （簡稱PL）。隨后將重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞獲得轉(zhuǎn)化子PLB，搖菌后提取質(zhì)粒，采用酶切、菌落PCR和測序等手段檢驗?zāi)康钠问欠裾_。同時也將空載pET32用同樣的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21以獲得空白對照轉(zhuǎn)化子pET32-Empty （簡稱PE）。引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3PLB的誘導(dǎo)表達

挑取重組菌PLB、PE分別接種到15 mL的AMP-LB液體培養(yǎng)基中，放置于37 ℃下振蕩培養(yǎng)12 h。再從過夜培養(yǎng)物種各取500 μL菌液接種于新鮮的10 mL AMP-LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下振蕩培養(yǎng)直到菌液的D600 nm= 0.6～0.7。隨后將PLB菌液均分后放置于不同的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間和添加不同濃度的IPTG中進行誘導(dǎo)（表1）。

1.3矮牽牛LIF基因蛋白編碼序列 （coding sequence，CDS）和植物表達載體的構(gòu)建

1.3.1CDS的擴增首先在GenBank搜索出矮牽牛LIF基因的編碼蛋白（accession number：AB035093），根據(jù)其蛋白序列設(shè)計出C1、C2引物序列用于擴增矮牽牛CDS，酶切位點分別為XbaⅠ、SmaⅠ酶切位點（酶切位點見下劃線）。引物序

1.3.2植物表達載體的構(gòu)建將LIF基因的CDS插入表達載體pBI121[17]中，LIF基因的插入位置見圖1，獲得重組載體pBI121-LIF。pBI121載體含有Npt Ⅱ基因，抗卡拉霉素（Kan）；含GUS基因作為報告基因；含CaMV35S啟動子（筆者所在實驗室保存）。提取重組子pBI121-LIF質(zhì)粒后，用反復(fù)凍融法[18]將其轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌LBA4404[19]感受態(tài)細胞中，同時也將空載pBI121以同樣的方法轉(zhuǎn)入2種農(nóng)桿菌感受態(tài)中以獲得空白對照，獲得轉(zhuǎn)化子pBI121-Empty （簡稱PBE）。檢驗后的含有LIF基因的農(nóng)桿菌單菌落接種到1 mL YEB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入50 μg/mL鏈霉素（Str ）、100 μg/mL 利福平（Rif）、100 μg/mL Kan，于恒溫搖床上 27 ℃、200 r/min搖培過夜。取出500 μL培養(yǎng)過夜的菌液轉(zhuǎn)入新配制的有同樣抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)直到D600 nm=1.0時，用新鮮的MS液體培養(yǎng)基（pH值5.4～5.8）分別稀釋為D600 nm=0.1～0.5用于轉(zhuǎn)化。

1.4培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件

試驗中外植體培養(yǎng)均選用MS培養(yǎng)基[20]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中蔗糖質(zhì)量濃度為3%，瓊脂質(zhì)量濃度為0.8%，pH值為58。外植體的培養(yǎng)均在28 ℃的溫室中進行，并保持16 h光照、8 h黑暗交替。具體培養(yǎng)基配方如下[21]：愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（CI）：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L 2，4-D；愈傷組織再生培養(yǎng)基（PR）：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L GA3；生根培養(yǎng)基（RM）：MS+02 mg/L IBA；大腸桿菌LB培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl，pH值7.0。固體LB培養(yǎng)基在以上成分中添加15 g/L瓊脂粉。

1.5外植體的轉(zhuǎn)化和選擇培養(yǎng)

預(yù)培養(yǎng)之后的幼葉外植體浸入30 mL含LIF基因的農(nóng)桿菌菌液體中，在28 ℃、200 r/min的搖床上侵染10 min。用干燥的無菌濾紙吸去多余菌液后將外植體轉(zhuǎn)移到CI培養(yǎng)基中，在全暗的溫室（28 ℃）中共培養(yǎng)2～7 d。隨后，將外植體轉(zhuǎn)入加入了300 mg/L頭孢霉素（Cef）的新鮮CI培養(yǎng)基中，繼續(xù)暗培養(yǎng)3周。待愈傷組織產(chǎn)生后，馬上轉(zhuǎn)入加入了Kan（0、10、20、30、40 mg/L）、150 mg/L Cef的新鮮PR培養(yǎng)基中誘導(dǎo)抗性叢生芽。經(jīng)過4周的篩選后，將抗Kan（KanR）的麻風(fēng)樹再生單芽切下并轉(zhuǎn)入加入Kan的RM生根培養(yǎng)基中。經(jīng)3～4周誘導(dǎo)后，將生根的植株移入放置于溫室中的培養(yǎng)缽中，培養(yǎng)缽中加入珍珠巖 ∶沙 ∶土=1 ∶1 ∶1（體積比）的混合基質(zhì)中練苗2周后移入大田。

1.6轉(zhuǎn)基因植株的鑒別

GUS染色：將共培養(yǎng)后的葉盤、愈傷組織和抗Kan的叢生苗切成小塊后放在1.5 mL的離心管中，加入GUS染液，37 ℃ 水浴16 h[22]。植株材料用70%的乙醇脫色2～3次，在解剖鏡和顯微鏡下進行觀察和拍照。

PCR檢測：采用CTAB法[23]提取轉(zhuǎn)基因麻風(fēng)樹的DNA，設(shè)計引物擴增檢驗是否獲得轉(zhuǎn)基因植株。首先設(shè)計了2條引物：qc1：5′-ACCGTCGGGCAAAGACAGATT-3′；qc2：5′-GACCGCATCGAAACGCAGCAC-3′，預(yù)期擴增的長度為 538 bp。擴增序列中包含LIF基因中246 bp的序列和GUS基因中長度為292 bp的序列，PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s，62 ℃40 s，72 ℃ 1 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

Southern blot檢測：為了進一步確定LIF基因已經(jīng)插入麻風(fēng)樹基因組，先從PCR檢測呈陽性 （PCR+）的植株中提出DNA（20 μg），隨后用EcoRⅠ、HindⅢ于37 ℃酶切過夜。EcoRⅠ、HindⅢ在質(zhì)粒pBI121上各僅有1個酶切位點。以重組質(zhì)粒pBI121-LIF為模板用引物qc1、qc2擴增LIF基因的ORF，按照PCR Digoxigenin （DIG） Probe Synthesis Kit（Roche Diagnostics）說明制作探針。雜交的具體操作按照Raffeiner的報道[24]進行，3 d后進行拍照（Kodak 8-10 X-Omat AR，Rochester）。

1.7數(shù)據(jù)分析

研究中用到的相關(guān)計算公式如下：

存活率=有分化能力的幼葉外植體數(shù)量/外植體總數(shù)×100%；

GUS的瞬時表達率=GUS顯陽性（GUS+）的存活外植體數(shù)量/外植體總數(shù)×100%。

所有的數(shù)據(jù)均使用SPSS統(tǒng)計軟件（ver.11.0）進行Duncans多重分析比較。

2結(jié)果與分析

2.1原核表達載體的獲得

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用引物lof33、lof52進行PCR擴增LIF基因的ORF序列，獲得了1條650 bp的片段（圖2-A），膠回收后與載體pMD19-T相連接，并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)獲得轉(zhuǎn)化子pMD19-T-LIF；提取pMD19-T-LIF轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒雙酶切后的片段（650 bp），與BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后的pET32載體連接，獲得重組子pET-LIF；將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)，經(jīng)過菌落PCR、雙酶切（圖2-B）和測序驗證，證明獲得了轉(zhuǎn)化子PLB，原核表達載體PLB構(gòu)建成功。

2.2PLB誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化研究

通過圖3的SDS-PAGE分析，比較得出了在不同的誘導(dǎo)條件下重組菌的最佳表達條件，并成功誘導(dǎo)重組蛋白的表達。在不同的誘導(dǎo)溫度梯度下，PLB均比對照多出1條約為43 ku的目的條帶；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為設(shè)置為37 ℃時，目的條帶十分明顯；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃時，也能看到目的條帶，但比37 ℃稍弱；20 ℃下誘導(dǎo)的PLB表達最弱。在不同的誘導(dǎo)時間梯度下，PLB都比對照多出1條約為43 ku的目的條帶，說明在2、4、6 h 3個處理時間內(nèi)，PLB均有表達。但3個處理時間下的誘導(dǎo)表達量有所不同，誘導(dǎo)2 h的條帶最弱；而誘導(dǎo)4、6 h的條帶都很亮，說明這2個時間內(nèi)的融合蛋白誘導(dǎo)表達最強；隨著時間從4 h延長到6 h，表達量沒有隨之增加，表明誘導(dǎo)4 h為最佳收獲時間。如果菌體過度培養(yǎng)，一方面由于Amp逐漸失活，失去選擇壓后質(zhì)?？焖賮G失，不能增加表達產(chǎn)量； 另一

方面由于菌體老化和代謝產(chǎn)物的影響，菌體不但不繼續(xù)生長，反而會死亡、分解，使目的蛋白丟失[25]。由圖3-C可以看出，只要加入了IPTG，PLB就能產(chǎn)生大小約為43 ku的重組蛋白。不同濃度的IPTG對PLB的誘導(dǎo)效果有差異，其中IPTG為0.120 g/L時誘導(dǎo)的重組蛋白量最大，其次是0.240 g/L，0.024 g/L誘導(dǎo)PLB表達的量最少，無IPTG時無重組蛋白產(chǎn)生。根據(jù)表達載體pET32的分子量、LIF基因ORF成熟肽分子量的估算，融合蛋白的總分子量應(yīng)為43 ku。

2.3農(nóng)桿菌侵染最佳濃度

本研究發(fā)現(xiàn)，菌液濃度是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。由表2可見，當(dāng)用D600 nm=0.1的LBA4404菌液侵染后，愈傷組織產(chǎn)生了數(shù)量最多的藍斑（GUS+）；隨著濃度的升高（D600 nm>0.1），多余的菌體改變了培養(yǎng)基的pH值，并抑制了愈傷組織的產(chǎn)生，嚴重制約轉(zhuǎn)化效率。這一現(xiàn)象與Yong等的研究結(jié)論相一致，他們認為高濃度的農(nóng)桿菌液反而會產(chǎn)生較低的轉(zhuǎn)化效率[26-27]。因此，本研究結(jié)果表明，D600 nm=0.1的農(nóng)桿菌LBA4404最適于麻風(fēng)樹幼葉轉(zhuǎn)化。

2.4Kan的篩選效果

在許多木本植物的轉(zhuǎn)化過程中，Kan都被用于篩選轉(zhuǎn)基因植株[28-31]，Kan的敏感性取決于植物種類、外植體類型[32]。本研究表明，不同的濃度梯度（20、30、40 mg/L）的Kan均能篩選出PCR檢驗呈陽性（PCR+）的植株（表3）。雖然40 mg/L Kan對愈傷組織再生有一定抑制作用，但只有高濃度的Kan才能完全抑制未轉(zhuǎn)化叢生芽的再生。相比之下，在加入20、30 mg/L Kan的培養(yǎng)基中會有部分未轉(zhuǎn)化的叢生芽產(chǎn)生，稱之為“逃離”。因此，本研究表明40 mg/L是Kan用于篩選的最佳濃度。Kan能有效地篩選出麻風(fēng)樹轉(zhuǎn)基因植株，與Li等提出的Kan不適于用于麻風(fēng)樹的篩選的結(jié)論相悖[33]。培養(yǎng)4周后，待抗Kan的叢生芽（圖4-C）長至2～3 cm 高時，轉(zhuǎn)入加入40 mg/L Kan的RM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根（圖4-D）。用Kan持續(xù)篩選能有效抑制未轉(zhuǎn)化植株的逃離，持續(xù)篩選非常必要[34]。培養(yǎng)1個月后，生根的植株移入培養(yǎng)缽中進行2周的煉苗（圖4-E）。

2.5GUS 染色分析

為了確認轉(zhuǎn)化子，誘導(dǎo)出的愈傷組織和KanR再生植株都需要進行GUS染色。經(jīng)GUS染色后，發(fā)現(xiàn)有68%的愈傷組織出現(xiàn)藍斑，表明呈現(xiàn)GUS+（表2）。愈傷培養(yǎng)4周后， 有35%的GUS+愈傷組織分化出KanR叢生芽。用40 mg/L Kan篩選出的所有植株都呈現(xiàn)GUS+（表3）。此外，筆者發(fā)現(xiàn)KanR植株的藍斑都沿著莖節(jié)和葉柄分布（圖5-e至圖5-h），在愈傷組織上則是隨機分布（圖5-b），在根系中無活性。這一現(xiàn)象與Nakagawa等在LIF基因超表達的矮牽牛中GUS藍斑的分布趨勢一致[14]。Nakagawa等推斷，LIF基因可能參與了矮牽牛葉腋處的細胞分裂素的產(chǎn)生過程。此外，本研究在對照植株中未觀察到GUS藍斑（圖5-c、圖5-d）。

2.6PCR和Southern檢測

GUS+再生苗首先采用PCR法一步驗證基因轉(zhuǎn)入的真實性。PCR檢測提取了轉(zhuǎn)基因植株的DNA為模板，所以消除了殘留菌株的干擾，比GUS染色更可靠。由圖6-A可以看出，隨機抽取的GUS+再生苗均擴增出了預(yù)期0.54 kb大小片段，未轉(zhuǎn)基因的對照植株無任何條帶出現(xiàn)。通過PCR檢測證明，201個葉盤在經(jīng)過3個月的轉(zhuǎn)化后，有48個產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因植株，所占比例達到（23.91±5.78）%（表3），轉(zhuǎn)化效率明顯高于Li等報道的13%的轉(zhuǎn)化率[34]。隨后，根據(jù)PCR的檢測結(jié)果，進一步使用Southern Blot最終檢測轉(zhuǎn)基因植株。本研究隨機抽取了12個PCR+植株以GUS基因的部分片段為探針進行Southern雜交，預(yù)期的雜交片段約為3.6 kb， 圖6-B顯

示了3株P(guān)CR+植株的雜交結(jié)果，均獲得了預(yù)期雜交帶。未轉(zhuǎn)基因的對照無任何條帶產(chǎn)生，說明載體c重組載體pBI121-LIF已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化入麻風(fēng)樹基因組DNA中。植株1產(chǎn)生了7條雜交帶，說明基因組中插入了多個拷貝，其中有2個條帶的長度明顯>3.6 kb，推測可能有完整的T-DNA拷貝插入；同時觀察到有4條雜交帶<3.6 kb，說明T-DNA有部分插入的拷貝存在，T-DNA的部分插入是轉(zhuǎn)基因過程中的常見現(xiàn)象。植株2、植株3均只有1條3.6 kb的雜交帶，說明轉(zhuǎn)化為單拷貝，T-DNA也是部分插入。不同數(shù)目的拷貝證明植株為獨立個體。

3結(jié)論與討論

植物分枝發(fā)育在植物形態(tài)建成中具有非常重要的地位，植物的分枝是控制作物結(jié)實并進而影響最終產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一，分枝多的植株結(jié)實部位多，但影響群體通風(fēng)透光狀況，分枝與主莖的夾角直接影響群體透光性和對光能的利用。然而，由于分枝的基因調(diào)控影響因素眾多，且機理復(fù)雜，因此目前僅處于探索階段。LIF基因由于發(fā)現(xiàn)時間較晚，其具體功能和作用機理仍未明確。目前只有1例進行LIF類鋅指蛋白的功能研究，即通過洋蔥表皮細胞的瞬時表達GFP-LIF-GUS蛋白的研究表明LIF基因被轉(zhuǎn)運到細胞核中，為證實LIF是1種轉(zhuǎn)錄因子提供了有力的證據(jù)[14]。本試驗采用pET32為表達載體，構(gòu)建了LIF基因原核表達載體，并將轉(zhuǎn)化子進行誘導(dǎo)表達獲得了重組蛋白，分析得出了LIF所對應(yīng)蛋白表達的最佳條件，為進一步探討LIF的功能奠定了基礎(chǔ)。

麻風(fēng)樹作為一種能源植物，已經(jīng)引起了世界各國的高度關(guān)注。但由于其為木本植物，目前大部分的研究成果都集中在麻風(fēng)樹再生體系的研究上。本研究以麻風(fēng)樹為幼葉研究對象，通過摸索Kan濃度成功建立了高效穩(wěn)固的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系。與前人的報道（針對麻風(fēng)樹子葉的轉(zhuǎn)化體系）相比，本體系不僅轉(zhuǎn)化效率高、穩(wěn)定性強，而且在植物材料的選擇上更經(jīng)濟、節(jié)約，本轉(zhuǎn)化體系的成功建立為研究者大規(guī)模的開展麻風(fēng)樹各類基因的研究創(chuàng)造便利。在此基礎(chǔ)上，本研究將LIF基因順利轉(zhuǎn)入麻風(fēng)樹基因組中，由于LIF基因能在雙子葉植物中保守表達，因此具有很強的應(yīng)用范圍。將LIF轉(zhuǎn)入麻風(fēng)樹中不僅有助于進一步了解LIF基因的作用原理和表達方式，還能為今后開展麻風(fēng)樹分枝的基因調(diào)控工作奠定堅實的基礎(chǔ)。在今后的研究中，將在田間持續(xù)觀察轉(zhuǎn)基因苗的分枝能力并計算種子產(chǎn)量。

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