Toll樣受體及其對水生動物疾病調控作用的研究進展

梁利國　陳凱　謝駿

摘要：Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是近年來倍受關注的一類模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs），在病原識別、介導機體免疫反應中發(fā)揮著重要作用。本研究對Toll樣受體的發(fā)現(xiàn)、種類、結構、分布、配體及其信號轉導途徑與功能、在水生動物疾病調控中的作用進行了概述，以期進一步了解TLRs在水生動物疾病中所起的關鍵作用。

關鍵詞：Toll樣受體；水生動物；信號轉導；疾病調控

中圖分類號：S941.4 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0012-04

宿主對病原體的防御反應主要依靠免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)分為先天性免疫和獲得性免疫2種，其中獲得性免疫以T細胞和B細胞為媒介且僅存在于哺乳動物體內，而先天性免疫在無脊椎動物到脊椎動物體內普遍存在。Toll樣受體是一種廣泛存在于哺乳動物、昆蟲及植物體內的天然免疫分子，屬于高度保守的蛋白家族成員，最早于1988年在果蠅體內發(fā)現(xiàn)。后期研究顯示，該受體在病原微生物識別、機體免疫等方面具有重要意義。

1.TLRs的種類、結構及分布

迄今為止，果蠅體內的TLRs在先天免疫中的作用被廣泛探討，9種TLRs先后被發(fā)現(xiàn)于果蠅體內并進行了后續(xù)研究。之后又在人體、小鼠及真菌中克隆出10種TLRs的同源序列。所有的TLRs蛋白都屬于I型橫跨膜蛋白，具有相同的結構特征，由胞外區(qū)、跨膜段和胞內區(qū)3部分組成。胞外區(qū)富含亮氨酸重復序列（1eucn-rich repeats，LRR）并有1個富含半胱氨酸的區(qū)域。胞內有1個被稱為Toll/IL-1（Toll/in-terleukin-1，TIR）的高度保守區(qū)域。

2000年，魚類首個TLR超家族成員分離出來。其后，TLRs陸續(xù)從河豚、斑馬魚和牙鲆中分離出來，并證實魚類不僅具有哺乳類所有TLR種類的同源基因，還具有幾個在哺乳類尚未發(fā)現(xiàn)的TLR種類。學者們在河豚基因組的研究中，通過與人類相關基因的對比，并未發(fā)現(xiàn)人類TLR4的同源序列，這意味著河豚可能缺少TLR4基因；而在隨后關于斑馬魚的研究中發(fā)現(xiàn)，其TLR4分子有2個亞型，這說明TLR4分子的缺失并非存在于魚類的普遍現(xiàn)象。

TLRs在淋巴組織和非淋巴組織均有表達，但TLRs在不同的組織和細胞表達量有所不同。泛生型主要是TLRl，廣泛分布于多核細胞、單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、內皮細胞、NK細胞、成纖維細胞及樹突狀細胞等多種細胞表面。局限型包括TLR2、TLR4和TLR5，主要分布于髓系單核細胞，其中外周血白細胞的表達最為豐富。特異型即TLR3，僅存在于樹突狀細胞表面。

2.LRs的配體及信號轉導途徑

2.1TLRs的配體

天然免疫識別系統(tǒng)是由能夠識別病原相關的分子模式（pathogen-associated molecule pattern，PAMPs）的模式識別受體（pattern recognition receptors，PPRs）介導的。TLRs作為重要的模式識別受體可識別多種病原體廣泛表達的脂類、碳水化合物、肽和核酸結構。研究證實大多數(shù)TLRs形成同二聚體，而TLR2則能以異二聚體TLRl/TLR2和TLR2/TLR6的形式存在，以鑒別配體結構的精細改變。TLRl0是最新發(fā)現(xiàn)的人TLR，與TLRl和TLR6氨基酸組成高度同源。常曉彤等在其研究中指出TLRl0與TLRl結構相似，具有與TLR2形成二聚體的接口和脂肽結合的通道，在天然免疫識別中以激動劑依賴的方式與TLR2相互作用。TLR2能夠識別多種PAMPs，包括G+的肽聚糖、細菌脂蛋白、支原體脂蛋白等。TLR2能識別如此廣泛的PAMPs，是由于其可與至少2個其他TLR家族成員TLR6、TLRl形成異二聚體，從而增強其識別功能。TLR3可識別病毒雙鏈RNA（dsRNA）以及人工合成的類似物多聚肌胞苷酸poly（I：C）。TLR4是首個被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物Toll樣受體，其主要功能是作為革蘭氏陰性菌LPS的信號轉導受體。除此之外，還可識別內源性分子熱休克蛋白60（HSP60），但TLR4識別HSP60的具體功能有待進一步研究。TLR5是識別具有鞭毛蛋白的細菌的重要受體。TLR9可識別甲基化的CpG-DNA 。

2.2TLRs的信號轉導途徑

由于TLRs胞內區(qū)域與IL一1R的胞內區(qū)域同源性較高，并有特征性的TIR區(qū)域，所以它們的信號傳遞鏈基本相同，但對不同信號的刺激仍有所區(qū)別?，F(xiàn)已明確參與此信號途徑的分子有MyD88、IRAK、TRAF6等。

髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是TLRs信號通路中重要的銜接蛋白。MyD88分子由296個氨基酸殘基組成，其羧基末端為TIR結構域，氨基末端為死亡結構域（death domain，DD）。羧基末端TIR結構域和胞漿內TLRs的TIR結構域結合，MyD88即依賴其死亡結構域與下游接頭分子相互作用形成受體復合物，進一步募集下游信號分子。利用MyD88基因敲除小鼠模型進行試驗，結果發(fā)現(xiàn)MyD88缺陷鼠除了正常應答TLR3配體外，其他TLR配體均不能引起應答反應，TLR3是至今已知的唯一不通過MyDS8的Toll樣受體。目前的相關研究中，一般根據(jù)TLRs的信號轉導過程是否有MyDS8的參與將TLRs信號通路分為MyD88依賴性和MyD88非依賴性。MyD88依賴性信號通路主要介導炎性細胞因子的產生，而MyD88非依賴性信號通路主要介導調節(jié)樹突狀細胞（DC）的成熟以及其他免疫調節(jié)分子如MHC、CD80等的表達。

2.2.1MyDS8依賴性信號途徑研究表明除TLR3外，其他所有的TLRs信號轉導過程都有MyDS8的參與。TLRs結合MyD88后，白介素1受體相關激酶4（IL-1R-associatedkinase 4，IRAK-4）和白介素1受體相關激酶1（IRAK-1）被募集并磷酸化?；罨蟮腎RAK一4和IRAK一1與腫瘤壞死因子受體相關因子6（TNFR-associated factor6，TRAF6）結合，使TNFR6磷酸纖維素化后促使轉化生長因子β活化激酶1（transforming growth factor-βactivated kinase 1，TAKl）活化。TRAF6活化引起2條不同途徑的信號轉導，一條包括P38MAPK家族和c-junNH2-tetminal激酶（111k）；另一條是活化MPKKK（mitogen-activated protein kinase，MAP3K）家族成員NIK（NF-IB-inducing kinase），后者的磷酸化激活IJB激酶（I.IB kinases，IKKs），導致IJB的泛素化而從IJB/NF-KB復合物釋放，NF-KB由此活化轉位進核，導致一系列特定基因的表達，從而產生原發(fā)性致炎因子如TNF-A、IL-1等完成炎癥的信號轉導過程。

2.2.2MyD88非依賴性信號途徑TLR3的信號轉導不觸發(fā)MyD88途徑，而是利用另一種適配蛋白TRIF。NF-KB和AP-1的活化是所有TLRs介導的信號途徑的共同特征，但只有TLR3可誘導1種具有強大的抗病毒、抗菌能力的細胞因子一I型干擾素的產生。TLR4既可利用MyD88依賴性信號途徑，也可利用同TLR3相似的以TRIF為適配蛋白產生I型干擾素的MyDS8非依賴性信號途徑。然而TLR4還需要TIRAP和TRAM額外2種適配蛋白，這2種蛋白調控TLR4對MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑的選擇。TRIF基因敲除鼠試驗進一步證實了該基因在TLR3信號傳導途徑中的重要作用。此外，Gao等的研究中，利用轉染的siRNA阻斷MyD88在HT一29細胞中的表達，結果發(fā)現(xiàn)，由酪酸梭菌刺激的TLR2調控通路也可利用MyD88非依賴性途徑實現(xiàn)信號的轉導。

3.TLRs的功能及在水生動物疾病中的調控作用

3.1炎癥反應

中性粒細胞是典型的先天性免疫細胞，而TLRs是典型的先天免疫受體。人體中性粒細胞可表達大多數(shù)的TLRs。Hayashi等對TLRs刺激下中性粒細胞的功能研究中發(fā)現(xiàn)，在病原入侵機體時，TLRs可增強吞噬細胞的吞噬能力。Hirono等在牙鲆的相關研究中觀察到，在遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）刺激下，牙鲆腎臟中有膿腫，表明誘發(fā)了炎癥反應，膿腫周圍大量表達MyDS8基因，說明MyDS8在牙鲆炎癥反應中起重要作用。付媛媛等給中國明對蝦投喂含不同濃度黃芩的飼料，之后利用鰻弧菌感染對蝦，結果顯示，3個試驗組的TLR基因mRNA的表達量均受到抑制，從而抑制先天免疫系統(tǒng)產生炎癥因子，相對提高了吞噬細胞的吞噬能力，增強天然免疫細胞的殺傷能力。

3.2抗病毒感染

TLR3是目前研究比較詳細的雙鏈RNA病毒模式識別受體之一。而魚類的TLR22是另一種可識別雙鏈RNA病毒的因子，它廣泛存在于各種魚類的基因組。可能是由于魚類生活在水體環(huán)境，經常受到病毒的侵襲，在自然選擇的作用下保留了雙鏈RNA病毒雙重識別系統(tǒng)。

楊春榮等在研究草魚TLR3表達特征時發(fā)現(xiàn)，草魚感染呼腸孤病毒后TLR3基因的相對表達量顯著升高，并指出TLR3基因在呼腸孤病毒感染中發(fā)揮著重要作用。之后在斑節(jié)對蝦的相關研究中，TLR22的表達量也表現(xiàn)出類似結果。TLR家族中除TLR3及TLR22外，TLR7也具有病毒識別能力。TLR7亞家族由TLR7、TLR8和TLR9構成，主要參與抗病毒機制的激活，病毒單鏈RNA可以成為TLR7和TLR8的配體，TLR9主要識別病毒或細菌含有非甲基化的CpG-DNA。張榮芳等探究TLR7在草魚體內和體外的表達模式時發(fā)現(xiàn)，病毒感染后的草魚肝臟、脾臟中的TLR7表達與對照組相比均顯著提高，這種顯著性差異反映了TLR7在病毒感染中的應答效應。吳立舒在試驗中也觀察到，受到蛙虹彩病毒威脅時，東北林蛙皮膚中TLRl和TLR8的mRNA表達量在攻毒后的6h內迅速上調表達。

3.3病原菌識別

細菌以細胞壁不同的染色特征可分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌2大類。細胞壁上某些特殊成分可以作為PAMPs被TLRs所識別。LPS是廣泛存在于細胞壁的最有效的免疫刺激劑。

TLR2和TLR4均可識別LPS，但在許多情況下需要協(xié)同受體的存在，其中TLR2常與TLRl及TLR6形成異二聚體共同發(fā)揮作用。Basu等用無乳鏈球菌和嗜水氣單胞菌（AeFomonas hydrophila）對印度鯪（Cirrhinus mrigala）進行侵染，之后在其鰓、肝臟、腎、腸及血液等組織中檢測到TLR2的表達。結果表明TLR2在機體的許多組織中充當著免疫監(jiān)視者的角色，可誘導產生IL-8和TNF-α2種細胞因子對入侵機體的病原菌發(fā)生免疫應答。梁建平從凡納濱對蝦體內克隆出TLR6并以滅活的金黃色葡萄球菌、創(chuàng)傷弧菌及釀酒酵母分別作為革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌3類微生物的代表對蝦進行免疫刺激，隨后測量肝胰臟TLR6基因表達水平。結果顯示TLR6在金黃色葡萄球菌、酵母刺激下均出現(xiàn)顯著上調，創(chuàng)傷弧菌則只在72 h時間段內出現(xiàn)較大上調。在病原刺激下TLR6出現(xiàn)較大幅度的上調可以理解為機體對外來刺激產生的防御反應。

TLR5對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的鞭毛蛋白均能識別，且鞭毛蛋白是哺乳動物體內TLR5唯一識別的受體。魚類具有和哺乳動物同源的TLR5基因，且TLR5S基因是魚類所特有的，它與TLR5共同參與魚類免疫反應。李敏等用遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌、鏈球菌（streptococcus）和斑點又尾鲴呼腸孤病毒（Channel cathemorrhage FCGCUFI，CCRV）進行感染試驗，結果顯示TLR5和TLR5S在細菌刺激下，均有不同程度的上調表達，而在CCRV刺激下除了感染后12h的頭腎和肝臟中表達量有輕微上調外，其他情況下均表現(xiàn)為明顯的下調表達，這可能與TLR5能識別細菌的鞭毛蛋白而不能識別病毒有關。當TLR5與配體蛋白結合后，通過MyDS8依賴性途徑激活NF-KB，進而誘導細胞因子及前炎癥因子的產生。林克冰等利用哈維氏弧菌（Wbrio harveyi）感染斜帶石斑魚，在感染后3、6、12、24、48h后利用Real tlne PCR檢測TLR5S在肝臟中的表達情況，結果顯示TLR5S基因在3、6、12、24h時表達量顯著上調，而在48h下降至初始水平。推測此現(xiàn)象是由于哈維氏弧菌感染刺激早期，機體為了清除入侵病原，誘導TLR5S基因的表達，參與機體免疫應答。隨時間推移，機體中的病原逐漸被清除，TLR5S基因表達隨之下降。TLR5可在單核細胞、未成熟樹突狀細胞及上皮細胞中表達，是一種參與免疫應答的受體，TLR5和TLR4一起，可以識別鞭毛蛋白并激活干擾素調節(jié)因子3（IRF-3）。歐陽蒲月等對硬骨魚類中斑馬魚的TLR5在受到殺鮭氣單胞菌（革蘭氏陰性菌，G）、金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌，G+）刺激之后的表達變化進行了研究，結果顯示，G+和G-細菌的感染都誘發(fā)了TLR5表達的上調，不具有鞭毛的金黃色葡萄球菌也可以誘發(fā)TLR5表達的上調。作者認為此情況是由于具有鞭毛的革蘭氏陰性菌可以直接激活TLR5通路，而不具有鞭毛的革蘭氏陽性菌可能先激活Toll樣受體家族的其它通路，再誘導TLR5表達活躍，從而實現(xiàn)對外源微生物入侵的抵御。

3.4其他調控作用

體內和體外研究均表明，硬骨魚的TLRs可對許多細菌和寄生蟲的PAMPs作出應答。喬瑋等從斜帶石斑魚體內克隆出TLR3基因，并通過刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans）感染斜帶石斑魚，感染后發(fā)現(xiàn)在皮膚和肝臟中均有不同程度的應答反應。

TLRs不僅可以調控天然免疫，也同樣介導獲得性免疫反應。在天然免疫和獲得性免疫間起中間橋梁作用的是抗原提呈細胞（APC）。APC表達所有的TLRs，病原體特有的PAMPs被APC上的TLRs識別后誘導活性氧中間物（ROI）和活性氮中間物（RNI）的產生，釋放前炎癥因子并上調共刺激分子的表達，隨后啟動獲得性免疫。

4.展望

TLRs是一組與天然免疫密切相關的受體家族，在天然免疫防御中起著重要作用，并能激活獲得性免疫系統(tǒng)。近年來，隨著分子生物學、免疫學等學科的發(fā)展，Toll樣受體的研究和應用進入了迅速發(fā)展的新階段。魚類的Toll樣受體也被陸續(xù)克隆出來，并在疾病控制、免疫應答方面獲得一些研究成果。隨著科學技術的發(fā)展，魚類的TLRs家族將得以更深一步的研究，為病毒、病原菌、寄生蟲等引起的疾病防治提供新的科學思路與方法。針對TLRs為靶點的藥物研究也正成為一個熱點。通過對TLRs不斷深入研究，免疫激動劑、疫苗將得到進一步開發(fā)與研制，水產動物的疾病防治將不再過多依賴于抗生素?？傊S著對TLRs研究的不斷進展，將會為水產動物疾病防治提供更加有效、更為安全的新方法。