多脂鱗傘的化學(xué)誘變育種

解生權(quán)+全艷玲

摘要：以紫外線誘變后得到的多脂鱗傘（Pholiotasdiposa）的菌種作為出發(fā)菌種，對其進(jìn)行化學(xué)誘變劑處理。結(jié)果表明，采用亞硝酸鈉終濃度3450mg/L誘變10min、亞硝酸鈉終濃度6900mg/L誘變5min所得到的變異菌株菌絲生長速度、菌絲產(chǎn)量和栽培的生物轉(zhuǎn)化率都有所提高。

關(guān)鍵詞：多脂鱗傘；化學(xué)誘變；育種；亞硝酸鈉；生長速度；產(chǎn)量；生物轉(zhuǎn)化率

中圖分類號：S646.036 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0244-02

各種研究表明，多脂鱗傘（Pholiotasdiposa）作為食用真菌具有極其豐富的營養(yǎng)價值，含有大量的人體必需氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等，是理想的營養(yǎng)食品之一；此外，其體內(nèi)還有多糖、麥角固醇、核酸等生物活性物質(zhì)，對提高機(jī)體免疫力、抑菌、抗癌、延緩肌肉疲勞、恢復(fù)精力和腦力十分有效。各地栽培經(jīng)驗(yàn)證明，多脂鱗傘具有適應(yīng)性強(qiáng)、原料易得、質(zhì)優(yōu)高產(chǎn)、商品性狀好、抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種具有開發(fā)價值、市場前景好的食用菌，其推廣栽培已經(jīng)引起人們的重視；但是，各地栽培所使用的菌種大都是野生馴化而來的，產(chǎn)量都不盡如人意。本研究將栽培使用的菌種經(jīng)過紫外線誘變得到1株高產(chǎn)的菌株（UV-65），并在此基礎(chǔ)上對其菌絲體進(jìn)行化學(xué)誘變，以期得到產(chǎn)量更高的菌株。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種來源經(jīng)過紫外線誘變得到的菌株UV-65。

1.1.2培養(yǎng)基及制備（1）液體培養(yǎng)基。馬鈴薯（去皮）100g、胡蘿卜100g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、蛋白胨10g，水1000mL。馬鈴薯與胡蘿卜分別煮汁、過濾后合并，再加入其他成分，補(bǔ)足水分后充分溶解再分裝到500mL錐形瓶中，每瓶200mL，121℃滅菌30min，備用。（2）固體培養(yǎng)基。馬鈴薯（去皮）100g、胡蘿卜100g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、蛋白胨10g、瓊脂20g，水1000mL。按上述方法溶解滅菌，做成斜面、平板備用。（3）栽培培養(yǎng)基。闊葉木屑78%、玉米粉20%、蔗糖1%、石膏1%，水60%，pH值自然。常規(guī)拌料、裝袋、126℃滅菌2h。

1.2方法

1.2.1活化菌種將液體石蠟保藏的UV-65出發(fā)菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，（26±2）℃下避光培養(yǎng)。待菌絲長滿試管后，再傳代1次，長滿后作為母種使用。

1.2.2液體菌種的制備用無菌接種鏟取一小塊活化的母種（0.5cm×0.5cm），盡量去除培養(yǎng)基，接種到液體培養(yǎng)基中，并使其漂浮在液面上。然后置于（26±2）℃、160r/min左右的全溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待瓶中菌絲球生長到2～3mm、發(fā)酵液澄清透明且無污染時停止培養(yǎng)，置于4℃下保藏備用。

1.2.3誘變處理利用不同濃度的亞硝酸鈉對液體培養(yǎng)出的菌絲球進(jìn)行不同時間的誘變處理，即取5mL上述菌懸液加入100mL無菌的錐形瓶中，并用無菌水稀釋至10mL，再加入無菌亞硝酸鈉溶液，使之最終濃度為0、3.45、6.9、10.35、13.8、17.25g/L，每個濃度3個平行樣本，以終濃度O為空白對照。對以上各個等級的樣本在（26±2）℃、160r/min的條件下分別振蕩5、10、15、20、25、30min，再加入pH值為8.6的Na2HP04溶液，調(diào)整pH值為7，終止誘變作用。

1.2.4菌種篩選將上述進(jìn)行不同誘變處理時間的各個濃度等級中的懸液混勻，無菌取等量的懸液接種到平板培養(yǎng)基上，（26±2）qC下避光培養(yǎng)，計(jì)數(shù)不同誘變處理時間、不同濃度的菌落數(shù)量，并計(jì)算致死率。對致死率達(dá)到75%-90%的組別中的培養(yǎng)菌落進(jìn)行生長速度的測定。

2.結(jié)果與分析

2.1不同方式誘變處理后的菌落培養(yǎng)情況

用不同濃度的亞硝酸鈉對上述液體培養(yǎng)物進(jìn)行不同時間的誘變，培養(yǎng)出的菌落情況見圖1。

2.2目的菌株的篩選

從圖1可以看出，當(dāng)在亞硝酸鈉終濃度為3.45g/L下誘變10nlln、在亞硝酸鈉終濃度為6.90g/L下誘變5min時，致死率在75%～90%之間。對其進(jìn)行編號（UVN6500510-1、UVN6500510-2、UVN6500510-3、UVN6500510-4、UVN6500510-5、UVN6500510-6；UVN65015-1、UVN65015-2、UVN65015-3、UVN65015-4）并測定其生長速度和生長量。

2.2.1

固體培養(yǎng)時菌絲生長速度的測定將上述所有篩選出的菌株分別轉(zhuǎn)接到平板培養(yǎng)基上，按前述的方式進(jìn)行培養(yǎng)后，用無菌打孔器（直徑0.5cm）切取種塊（盡量去除培養(yǎng)基）接種到12cm平板培養(yǎng)基上，每隔48h測量菌落直徑（表1）。

2.2.2液體培養(yǎng)時菌絲生長量的測定取所有篩選出的菌株接入液體培養(yǎng)基，在（26±2）℃、160r/min下振蕩培養(yǎng)，每隔24h混勻并定量取樣，相同離心力下離心相同時間并烘干至恒質(zhì)量，再稱其質(zhì)量，結(jié)果見表2。

從表1、表2可以看出，菌株UVN6500510-4、UVN6500510-5、UVN65015-3的生長速度和菌絲產(chǎn)量都比出發(fā)菌株提高了10%以上；而其他菌株雖然也有所提高，但是幅度較小，有些不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.3栽培生物轉(zhuǎn)化率的比較取上述3種變異菌株的斜面種接種到栽培培養(yǎng)基中，并以出發(fā)種作為對照，霉菌培養(yǎng)箱[溫度（26±2）℃、濕度65%]中避光培養(yǎng)，觀察菌絲生長速度時發(fā)現(xiàn)，長滿栽培培養(yǎng)基的時間分別為24.67、25.15、24.86、29.13d。由此可見，變異菌株栽培時菌絲生長速度也有所加快。菌絲長滿后，進(jìn)行必要的溫差、濕差的刺激出菇，連續(xù)采摘3次，計(jì)算生物轉(zhuǎn)化率（表3）。

2.2.4變異菌株的遺傳穩(wěn)定性將菌株UVN6500510-4、UVN6500510-5、UVN65015-3做成斜面種保存在液體石蠟中，在此期間連續(xù)5次傳代，并測定每代菌絲生長速度、發(fā)酵產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過長期保存并多次傳代菌絲生長速度、發(fā)酵產(chǎn)量、生物轉(zhuǎn)化率3項(xiàng)指標(biāo)未發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的變化，說明這3株菌株遺傳性狀是比較穩(wěn)定的，可以應(yīng)用于規(guī)模栽培。

3.結(jié)論

微生物育種運(yùn)用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對某種具有特定生產(chǎn)目的的菌株進(jìn)行改造，以提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。微生物菌種選育技術(shù)在現(xiàn)代生物技術(shù)中，特別是發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中具有十分重要的地位。通過對微生物菌種的選育可以有效提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。微生物育種技術(shù)主要有自然選育、誘變育種、雜交育種、代謝控制育種和基因工程育種等5種方式，各種方式并不孤立存在，而是相互交叉、相互聯(lián)系的。新的育種技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用促進(jìn)了生產(chǎn)的發(fā)展，而現(xiàn)在最常用的育種方式是誘變育種，即利用物理、化學(xué)誘變劑對微生物進(jìn)行處理，從而篩選出主要生物性狀優(yōu)良的變異菌株。本研究對紫外線誘變得到的變異菌株利用典型的化學(xué)致變劑進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)誘變，實(shí)際上進(jìn)行復(fù)合誘變，篩選出3株菌抹，其生長速度、發(fā)酵產(chǎn)量、生物轉(zhuǎn)化率等主要生物學(xué)指標(biāo)較原始菌株都有較大的提高，這對大規(guī)模種植增產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。變異菌株進(jìn)行發(fā)酵、栽培所得產(chǎn)物的成分變化有待進(jìn)一步研究。endprint