亞?wèn)|鮭人工繁殖與野生群體的形態(tài)和微衛(wèi)星多態(tài)性分析

李福貴+但唐興+林紹南+鄒曙明

摘要：開展亞?wèn)|鮭野生群體與人工繁殖后代的形態(tài)特征和微衛(wèi)星遺傳多態(tài)性分析。首先采用方差、判別、主成分分析方法研究了2個(gè)群體，包括7個(gè)可數(shù)、11個(gè)可量與20個(gè)框架數(shù)據(jù)，結(jié)果表明亞?wèn)|鮭人工繁殖后代與野生群體在鰭式、鱗式、可量和框架結(jié)構(gòu)性狀等方面均無(wú)顯著差異。進(jìn)一步采用9對(duì)微衛(wèi)星引物評(píng)估了亞?wèn)|鮭人工繁殖與野生群體問(wèn)的遺傳變異，在10個(gè)座位中，共檢測(cè)到55個(gè)等位基因，平均有效等位基因分別為4.8、4.0個(gè)，平均每個(gè)座位的等位基因數(shù)為5.5個(gè)；平均座位觀測(cè)雜合度分別為0.6267、0.6417，平均基因多樣性均為0.5719，群體遺傳分化較小，2個(gè)群體的微衛(wèi)星DNA多態(tài)性均呈現(xiàn)低水平。結(jié)果表明，亞?wèn)|鮭人工繁殖與野生群體在遺傳上差異不大，人工繁殖群體可用于開展進(jìn)一步的保種繁育和保護(hù)性放流工作。

關(guān)鍵詞：亞?wèn)|鮭；野生群體；人工繁殖群體；形態(tài)特征；微衛(wèi)星多態(tài)性

中圖分類號(hào)：S932.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）05-0226-04

亞?wèn)|鮭（Salmo trutta fraio Linne）屬鮭形目鮭科鮭屬，別稱河鮭（俗稱花點(diǎn)鮭），是冷水性珍稀魚類，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。關(guān)于亞?wèn)|鮭的研究較少，張春霖等先后對(duì)亞?wèn)|鮭的來(lái)源和資源情況進(jìn)行過(guò)分析；蒲德永等對(duì)亞?wèn)|鮭消化系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)進(jìn)行過(guò)觀察研究；豪富華等對(duì)亞?wèn)|鮭的性腺發(fā)育生長(zhǎng)年齡與繁殖進(jìn)行過(guò)研究。在群體遺傳學(xué)方面，豪富華利用線粒體和微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)亞?wèn)|鮭種群和丹麥引進(jìn)棕鱒種群進(jìn)行過(guò)群體遺傳多樣性研究，孟瑋等基于線粒體C01基因序列對(duì)亞?wèn)|鮭進(jìn)行了DNA條形碼研究。然而目前關(guān)于亞?wèn)|鮭人工繁殖后代和野生群體的群體遺傳學(xué)比較研究尚未開展。

亞?wèn)|鮭自19世紀(jì)由英國(guó)人從歐洲引種后，僅棲息于我國(guó)西藏自治區(qū)日喀則地區(qū)亞?wèn)|縣海拔約3000m的亞?wèn)|河，1992年已被列入西藏自治區(qū)二級(jí)保護(hù)水生動(dòng)物，尤其是近些年來(lái)，野生亞?wèn)|鮭資源量有加快衰退的趨勢(shì)。開展亞?wèn)|鮭的人工繁殖和放流有利于資源的恢復(fù)，須要選擇具有與原種相似遺傳多樣性的親本，鑒于當(dāng)前野生亞?wèn)|鮭資源量萎縮，從人工繁殖后代中培育親魚是解決親本來(lái)源的有效途徑。有關(guān)于野生和人工繁殖亞?wèn)|鮭群體間形態(tài)差異及微衛(wèi)星多態(tài)性的研究未見報(bào)道，本研究通過(guò)分析人工繁殖與野生西藏亞?wèn)|鮭2個(gè)群體間的形態(tài)差異和微衛(wèi)星DNA多態(tài)性，旨在了解2個(gè)群體的遺傳分化特征，為亞?wèn)|鮭保種繁育和保護(hù)性放流工作提供理論資料。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

于2012年從西藏自治區(qū)日喀則地區(qū)亞?wèn)|縣亞?wèn)|河采集野生亞?wèn)|鮭，先后捕獲30尾，體長(zhǎng)、體質(zhì)量分別為（20.42±2.70）cm、（155.01±72.72）g，未進(jìn)行年齡鑒別；亞?wèn)|鮭人工繁殖岳代1～2齡魚取自西藏亞?wèn)|鮭漁場(chǎng)，樣本數(shù)量也為30尾，體長(zhǎng)、體質(zhì)量均值分別為（16.34±4.26）cm、（92.79±87.98）g，其親本系由亞?wèn)|河采集的野生個(gè)體培育而成。剪魚鰭保存于無(wú)水乙醇中，用于抽提基因組DNA，于-20℃冰箱保存。

1.2形態(tài)特征分析

1.2.1數(shù)據(jù)采集測(cè)量的數(shù)據(jù)分為2類：一類是傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，包括可數(shù)、可量性狀共18項(xiàng)，其中可數(shù)性狀包括背鰭、胸鰭、腹鰭、臀鰭鰭條、側(cè)線鱗、側(cè)線上鱗、側(cè)線下鱗；可量性狀有頭長(zhǎng)、吻長(zhǎng)、眼徑、眼間距、尾柄長(zhǎng)、尾柄高、體長(zhǎng)、全長(zhǎng)、體高、背棘長(zhǎng)、體質(zhì)量。另一類為框架數(shù)據(jù)，共20項(xiàng)，20個(gè)框架數(shù)據(jù)是10個(gè)定位點(diǎn)之間的距離，例如D1-2表示定位點(diǎn)1與2之間的距離?？蚣軠y(cè)量定位點(diǎn)的選擇參照?qǐng)D1。

1.2.2數(shù)據(jù)處理和多元統(tǒng)計(jì)分析為消除魚體規(guī)格大小對(duì)形態(tài)分析的影響，每尾魚的所有實(shí)測(cè)可量性狀（除體質(zhì)量外）均用體長(zhǎng)進(jìn)行校正。再分別求出各組樣本每個(gè)參數(shù)的平均比值，用于多元統(tǒng)計(jì)分析。分析數(shù)據(jù)包括7個(gè)可數(shù)性狀、111個(gè)可量性狀及20個(gè)框架性狀，分別用方差分析進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，如果方差分析檢驗(yàn)為差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01），則用Duncan's多重比較進(jìn)行分析。

采用逐步判別法對(duì)所有的形態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，去除判別效果不顯著的參數(shù)，計(jì)算判別準(zhǔn)確率和互相證實(shí)準(zhǔn)確率，建立判別方程。判別準(zhǔn)確率P1=判別正確的尾數(shù)/實(shí)際尾數(shù)×100%?；ハ嘧C實(shí)準(zhǔn)確率P2：在共有Ⅳ個(gè)樣品中，每次留下一個(gè)樣品作為新樣品，由N-1個(gè)樣品建立判別函數(shù)，然后將留下的這個(gè)樣品代入判別函數(shù)，判別其歸屬，其計(jì)算方法同P1。式中：Ai為第i個(gè)群體判別正確的尾數(shù)，尾；Bi為第i群體的實(shí)際尾數(shù)，尾；K為群體數(shù)。

主成分分析采用降維計(jì)算，是將多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)方法。

上述所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3亞?wèn)|鮭微衛(wèi)星DNA多態(tài)性分析

1.3.1簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）引物序列

參考已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)，共設(shè)計(jì)9對(duì)SSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列與PCR反應(yīng)條件見表1。

1.3.2全基因組DNA提取試驗(yàn)前將魚鰭從乙醇中取出，用蒸餾水洗凈、吸水紙吸干、剪碎，按照海洋動(dòng)物組織DNA抽提法[由天根生化科技（北京）有限公司提供的試劑盒]抽提全基因組DNA，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的DNA的質(zhì)量、濃度。

1.3.3SSRPCR反應(yīng)體系與程序、PCR產(chǎn)物檢測(cè)PCR反應(yīng)體系為25μL：2.5μL10×buffer，1μLdNTP，0.5μLTaq-E，1μL模板DNA。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min；4℃保存。以上反應(yīng)均設(shè)置陰性對(duì)照以排除DNA污染。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)與量，酌量取PCR產(chǎn)物4～5μL以8%的非變性聚丙烯酰胺凝電泳，0.5×TBE電泳緩沖液，恒壓120V（約2h）進(jìn)行電泳、銀染、顯色、拍照。endprint

1.3.4SSR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析結(jié)合軟件AdobePhotoshopCS5和AlphaView凝膠圖像分析軟件分析微衛(wèi)星條帶大小，根據(jù)每個(gè)個(gè)體產(chǎn)生的條件位置確定基因型。用Popgene1.32軟件進(jìn)行分析，計(jì)算微衛(wèi)星座位分別在2個(gè)群體中的等位基因數(shù)、期望雜合度、觀測(cè)雜合度、平均基因多樣性指數(shù)，并檢驗(yàn)各個(gè)座位、各個(gè)群體的哈代一溫伯格平衡。

2.結(jié)果與分析

2.1亞?wèn)|鮭形態(tài)特征數(shù)據(jù)多元分析

如表2所示，對(duì)亞?wèn)|鮭人工繁殖后代與野生群體的7項(xiàng)可數(shù)性狀求平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，亞?wèn)|鮭2個(gè)群體間的卡方值是x²=0.004；其側(cè)線鱗數(shù)、側(cè)線上鱗、側(cè)線下鱗、背鰭條數(shù)、胸鰭條數(shù)、腹鰭條數(shù)、臀鰭條數(shù)相互差異均不顯著；全長(zhǎng)/體長(zhǎng)、體長(zhǎng)/體高、體長(zhǎng)/頭長(zhǎng)、頭長(zhǎng)/吻長(zhǎng)、頭長(zhǎng)/眼徑、頭長(zhǎng)/眼間距、體長(zhǎng)/尾柄長(zhǎng)、尾柄長(zhǎng)/尾柄高、背棘長(zhǎng)/體長(zhǎng)等9個(gè)比例性狀的測(cè)量結(jié)果也不存在顯著差異。

采用方差、判別和主成分等方法分析了2個(gè)群體包括7個(gè)可數(shù)、111個(gè)可量、20個(gè)框架數(shù)據(jù)的形態(tài)特征。結(jié)果表明，9個(gè)比例性狀在野生和人工繁殖2個(gè)群體間差異均不顯著，相似性狀比例為100%；29個(gè)可量和框架數(shù)據(jù)在野生和人工繁殖兩群體間差異均不顯著，相似性狀比例為100%。主成分分析得到因子1-11的方差累積貢獻(xiàn)率在85%以上，但各自特征根極小，且對(duì)群體間總方差的貢獻(xiàn)率小，無(wú)法用相互獨(dú)立的因子來(lái)概括這2個(gè)群體魚的形態(tài)差異。用逐步判別程序?qū)?jīng)過(guò)校正的29個(gè)形態(tài)參數(shù)進(jìn)行篩選，淘汰掉26個(gè)形態(tài)參數(shù)，得到D4-1/體長(zhǎng)、眼徑/體長(zhǎng)、背棘長(zhǎng)/體長(zhǎng)等3個(gè)判別效果稍微顯著的形態(tài)參數(shù)。計(jì)算得到2個(gè)群體判別準(zhǔn)確率及互相證實(shí)準(zhǔn)確率較低，分別為84.99%、85.04%（表3），即亞?wèn)|鮭野生和人工繁殖后代2個(gè)群體易發(fā)生錯(cuò)判，也進(jìn)一步證實(shí)了它們間不存在顯著的形態(tài)差異。

2.2亞?wèn)|鮭野生和人工繁殖群體的微衛(wèi)星DNA多態(tài)性分析

采用9對(duì)微衛(wèi)星引物擴(kuò)增出10個(gè)多態(tài)性座位，獲得55個(gè)等位基因，平均每個(gè)座位擴(kuò)增出5.5個(gè)等位基因。不同的微衛(wèi)星擴(kuò)增出的等位基因數(shù)量不同，其中最多的是引物Strutta58，共擴(kuò)增出10個(gè)等位基因，最少的是引物Str43INRA，共擴(kuò)增出2個(gè)座位及5個(gè)等位基因（表4）。另外，不同微衛(wèi)星引物在2個(gè)群體中可擴(kuò)增出不同的基因數(shù)，如引物Strutta58在亞?wèn)|鮭人工繁殖群體中擴(kuò)增出8個(gè)等位基因，而在野生群體中擴(kuò)增出5個(gè)等位基因，且有的個(gè)體中出現(xiàn)了無(wú)效等位基因。

從表5中可以看出，座位Str43INRA-1和Str43INRA-2在亞?wèn)|鮭2個(gè)群體中均嚴(yán)重偏離哈代一溫伯格平衡，其余8個(gè)座位在2個(gè)群體中均符合哈代一溫伯格平衡。計(jì)算得亞?wèn)|鮭人工繁殖群體和野生群體的平均等位基因數(shù)分別是4.8、4.0，平均觀測(cè)雜合度分別是0.6267、0.6417，平均基因多樣性指數(shù)均為0.5719。人工繁殖群體平均等位基因數(shù)多于野生群體，而人工繁殖群體平均觀測(cè)雜合度略小于野生群體，但差異都不顯著。

3.討論與結(jié)論

3.1亞?wèn)|鮭人工繁殖后代與野生群體的形態(tài)特征

亞?wèn)|鮭人工繁殖后代與野生群體在形態(tài)學(xué)上差異不顯著。在7個(gè)可數(shù)性狀中，鰭式和鱗式都相似，沒(méi)有差異；9個(gè)比例性狀在兩群體間差異均不顯著；29個(gè)可量和框架數(shù)據(jù)在2個(gè)群體間的差異也不顯著，相似性狀比例為100%；主成分分析和判別分析也進(jìn)一步證實(shí)了它們之間不存在顯著性形態(tài)差異。亞?wèn)|鮭漁場(chǎng)建于亞?wèn)|河邊并直接把河水引入池中進(jìn)行流水養(yǎng)殖和繁育，養(yǎng)殖環(huán)境如水質(zhì)、水溫、光照、溶氧、餌料等與亞?wèn)|河自然條件基本一致，2個(gè)群體在形態(tài)學(xué)上差異不顯著，表明人工繁殖后代沒(méi)有因人工繁殖和養(yǎng)殖操作產(chǎn)生形態(tài)遺傳特征的改變。

3.2亞?wèn)|鮭2個(gè)群體的微衛(wèi)星DNA的多態(tài)性

微衛(wèi)星無(wú)效等位基因普遍存在于微生物、動(dòng)物、植物等眾多物種中。微衛(wèi)星側(cè)翼序列變異、大片段等位基因丟失、不同微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)DNA質(zhì)量要求差異等都是造成無(wú)效等位基因的原因。本研究所用微衛(wèi)星引物都通過(guò)篩選所得，且不存在大片段等位基因丟失現(xiàn)象，因此主要原因可能是由于樣品采集路途遙遠(yuǎn)、保存條件有限而導(dǎo)致DNA樣品質(zhì)量不太符合微衛(wèi)星位點(diǎn)的要求。另外，微衛(wèi)星無(wú)效等位基因具有隱匿性，且在雜合子個(gè)體中表現(xiàn)更為常見，這與本研究中人工繁殖群體雜合度比野生群體低相符，野生群體無(wú)效等位基因出現(xiàn)更多。因此，10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中8個(gè)位點(diǎn)都出現(xiàn)無(wú)效等位基因，導(dǎo)致各位點(diǎn)基因頻率在兩群體中具有一定的差異，但結(jié)合各位點(diǎn)雜合度等分析兩群體遺傳差異不明顯。

引物Str43INRA擴(kuò)增出2個(gè)位點(diǎn)為Str43IRNA-1、Str43IRNA-2。根據(jù)鯉魚和草魚相關(guān)報(bào)道可以推測(cè)，出現(xiàn)這種情況是因?yàn)閬問(wèn)|鮭曾經(jīng)經(jīng)歷過(guò)特有的全基因組重復(fù)。雜合度、等位基因多樣性和多態(tài)性位點(diǎn)的比例等是評(píng)估遺傳多樣性最常用的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，亞?wèn)|鮭野生群體和人工繁殖后代中的微衛(wèi)星雜合子均嚴(yán)重缺乏，位點(diǎn)$sa85在2個(gè)群體均嚴(yán)重偏離哈代一溫伯格平衡，人工選擇、遷移、突變、近交等都有可能產(chǎn)生該現(xiàn)象。亞?wèn)|鮭最早引入亞?wèn)|河并棲息下來(lái)時(shí)的個(gè)體數(shù)量少，導(dǎo)致遺傳瓶頸和漂變的發(fā)生可能是雜合子急劇減少和檢測(cè)到偏離哈代一溫伯格平衡的主要原因。本研究表明，亞?wèn)|鮭人工繁殖群體的平均等位基因數(shù)大于野生群體，也從不同角度證明亞?wèn)|鮭野生資源正在經(jīng)歷一個(gè)急劇衰退的過(guò)程，需要加強(qiáng)亞?wèn)|鮭的保護(hù)性繁育和增殖。

豪富華等報(bào)道亞?wèn)|鮭野生群體的平均觀測(cè)雜合度分別是0.7083，而本研究的亞?wèn)|鮭野生群體、人工繁殖后代的觀測(cè)雜合度為0.6417、0.6267，均顯著低于2006年所取的亞?wèn)|鮭野生群體的雜合度，這說(shuō)明亞?wèn)|鮭種群的遺傳多樣性處于下降趨勢(shì)。同時(shí)，亞?wèn)|鮭人工繁殖群體的遺傳雜合度略小于野生群體，但2個(gè)群體遺傳雜合度差異不顯著，說(shuō)明亞?wèn)|鮭漁場(chǎng)多年來(lái)陸續(xù)收集和培育的野生親本群體基本保留了目前野生群體的遺傳多樣性，應(yīng)可用于野生資源的恢復(fù)和增殖工作。endprint