菝葜提取物的抗氧化作用

帥麗喬娃等

摘要：研究菝葜不同溶劑提取物的抗氧化活性，以2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）為陽性對(duì)照，測(cè)定菝葜50%乙醇提取物中的石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相，以及濃度為0.2～1.2 mg/mL時(shí)，菝葜50%乙醇提取物清除·OH、 O-2· 、DPPH·、ABTS+·能力、總抗氧化能力。結(jié)果表明，各萃取物均有不同程度的抗氧化活性，且與質(zhì)量濃度呈量效關(guān)系，不同極性提取物中抗氧化能力大小為：乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>醇提物>石油醚相>三氯甲烷相；當(dāng)BHT濃度為 1.2 mg/mL 時(shí)，對(duì)·OH、DPPH·、 O-2· 、ABTS+·清除率分別為63.52%、6041%、70.35%、92.17%，亞鐵還原能力（FRAP）值為（151.57±0.16）mmol/g；而1.2 mg/mL乙酸乙酯相對(duì)·OH、DPPH·、 O-2· 、ABTS+·的清除率分別為58.73%、66.46%、73.17%、95.84%，F(xiàn)RAP值為（186.25±0.21）mmol/g；除清除·OH外，在其他抗氧化效果方面，乙酸乙酯比BHT更好。以上結(jié)果表明，菝葜乙酸乙酯層中抗氧化物質(zhì)的活性最強(qiáng)，且抗氧化活性與乙酸乙酯萃取物呈量效關(guān)系。

關(guān)鍵詞：菝葜；萃取物；抗氧化作用

中圖分類號(hào)： Q946.91+9；R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0346-04

通信作者：鄭國棟，博士，副教授，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物的分離提取、功能食品等。Tel：（0791）83813420；E-mail：zrs150716@aliyun.com。菝葜為百合科植物菝葜（Smilax china L.）的干燥根莖，別稱金剛藤、金剛樹等，主要分布在長江以南地區(qū)。菝葜的根、莖、葉均可入藥，其中根莖作為中藥使用更為常見。菝葜根莖中含有皂苷、黃酮、鞣質(zhì)、生物堿、氨基酸、糖、多元酚等多種成分[1]，具有活血化瘀、抗菌消炎、清熱利濕、強(qiáng)筋壯骨、補(bǔ)氣活血等功效[2]。

自由基過多或清除過慢，會(huì)加速機(jī)體的衰老進(jìn)程并誘發(fā)各種疾病，一些抗氧化劑能夠有效地清除自由基，從而能夠預(yù)防或治療這些疾病。但是研究發(fā)現(xiàn)，過量食用這類物質(zhì)對(duì)人體健康不利，因此尋找安全、可靠的抗氧化物質(zhì)成為近年來世界各國研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。目前，許多來自天然植物中的提取物被證明具有良好的抗氧化活性[3]，它們不僅可以通過清除自由基起到抗衰老的作用，而且還有吸收放射性物質(zhì)毒害的能力，對(duì)輻射損傷器官具有良好的防護(hù)作用，是具有廣泛開發(fā)前景的天然抗氧化劑[4]。

目前，關(guān)于菝葜提取物抗氧化活性的研究還不是很多，菝葜甲醇提取物在高濃度時(shí)具有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力（IC50=7.4 g/mL ）和細(xì)胞生存保護(hù)能力；進(jìn)一步研究表明，菝葜乙酸乙酯、正丁醇、水提取物均有很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力[5]。趙鐘祥等從菝葜中分離得到了3個(gè)芪類化合物、9個(gè)天然多酚類化合物，對(duì)其進(jìn)行抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果表明：這些化合物均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能有效清除DPPH自由基[6]。前人研究的抗氧化指標(biāo)都比較單一，本試驗(yàn)的抗氧化指標(biāo)為清除·OH、 O-2· 、DPPH·、ABTS[2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽]自由基能力，以及總抗氧化能力，種類更多，數(shù)據(jù)更全面，可為菝葜作為新型天然抗氧化劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

菝葜購自江西省南昌市藥材店（產(chǎn)地：南昌市灣里），粉碎后過40目篩，得到菝葜粉末。2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、無水乙醇、福林酚、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、雙氧水、水楊酸、硫酸亞鐵、三氯化鐵、過硫酸鉀、鹽酸、乙酸鈉、冰乙酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚均為分析純，購自天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心。沒食子酸、蕓香苷購自成都曼思特公司。DPPH、2，4，6-三吡啶基-S-三嗪（TPTZ）、ABTS購自美國Sigma公司。

1.2試驗(yàn)儀器

KQ-500B型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；BS224S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SP-754PC型分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1萃取物的制備[7]和總酚、總黃酮的測(cè)定取菝葜粉末1 kg，用50%乙醇超聲提取后，分別用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮、冷凍干燥后得6種萃取物，即醇提物（未經(jīng)萃取的50%乙醇提取物）、水相物（4種溶劑萃取后的水溶液濃縮干燥所得）、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、三氯甲烷萃取物、石油醚萃取物。測(cè)定各極性提取物的總酚[8]、總黃酮含量[9]，結(jié)果見表1。

表1不同萃取相的總酚、總黃酮含量（x±s，n=3）

樣品萃取相總酚含量

（mg/g）總黃酮含量

（mg/g）石油醚相26.7±0.1aA22.3±0.2aA 三氯甲烷相24.1±0.2aA19.6±0.3aA乙酸乙酯相451.3±3.7bB404.1±1.5bB正丁醇相326.9±2.2cC289.4±0.6cC水相物184.5±1.3dD172.2±2.8dD醇提物149.8±3.2eE137.9±3.6eE注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫、大寫字母分別表示差異顯著（P<0.05）、極顯著（P<0.01）。表2同。

1.3.2抗氧化能力測(cè)定方法

1.3.2.1清除羥自由基能力的測(cè)定[10]在試管中依次加入2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 9 mmol/L水楊酸溶液、2 mL不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）的提取物溶液，最后加入2 mL 8.8 mmol/L H2O2啟動(dòng)整個(gè)反應(yīng)；37 ℃水浴30 min后，以蒸餾水為參比，在510 nm下測(cè)定吸光度D1，用蒸餾水代替水楊酸測(cè)定其吸光度D2，以蒸餾水代替樣液測(cè)定其吸光度D0，用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL BHT溶液對(duì)·OH的清除率作為對(duì)比。計(jì)算公式如下：羥自由基清除率=[1-（D1-D2）/D0]×100%。

1.3.2.2清除DPPH自由基能力的測(cè)定[11]制備DPPH溶液：稱取DPPH樣品0.01 g，用無水乙醇溶解并定容至 250 mL，即得到濃度為0.04 mg/mL的DPPH溶液，置于4 ℃冰箱備用。將2 mL上述濃度的提取物溶液與等體積DPPH混合、搖勻，放置于黑暗中30 min后，于517 nm下測(cè)定吸光度值Di。將2 mL不同濃度的樣液與無水乙醇等體積混合于試管中，搖勻，測(cè)定吸光度為Dj（用以扣除樣品本身對(duì)吸光度測(cè)定的干擾）。以蒸餾水與無水乙醇混合液測(cè)得的吸光度作為空白對(duì)照Dd，用BHT溶液對(duì)DPPH的清除率作為對(duì)比，相關(guān)計(jì)算公式為：DPPH自由基清除率=[1-（Di-Dj）/Dd]×100%。

1.3.2.3清除超氧陰離子能力的測(cè)定[12]取4.5 mL濃度為0.05 mmol/L、pH值為8的Tris-HCl緩沖溶液，于20 ℃水浴中進(jìn)行預(yù)熱，20 min后分別加入1 mL不同濃度提取液、0.4 mL 濃度為0.5 mmo1/L的鄰苯三酚溶液，充分混勻后于 25 ℃ 水浴中反應(yīng)5 min，然后加入1 mL濃度為8 mol/L的HCl溶液終止反應(yīng)。最后在299 nm處測(cè)定吸光度Dk1；空白對(duì)照則以蒸餾水代替樣品液，測(cè)定吸光度Dk2。以BHT溶液對(duì) O-2· 的清除率作為對(duì)比，相關(guān)計(jì)算公式為：超氧陰離子自由基清除率=（1-Dk1/Dk2）×100%。

1.3.2.4清除ABTS自由基能力的測(cè)定[13]將5 mL濃度為7 mmol/L的ABTS溶液與88 μL濃度為2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合反應(yīng)，制備ABTS自由基溶液，使用前將 ABTS+· 溶液在室溫下黑暗中放置12～16 h，并將ABTS+·溶液用無水乙醇稀釋到吸光度測(cè)定值為0.70±0.02（734 nm條件下）。在試管中加入0.15 mL不同濃度的提取液，再加入285 mL的ABTS自由基工作液溶液，振蕩搖勻，于室溫避光靜置1 min，在734 nm處測(cè)定其吸光度值Ds；同法，在 0.15 mL 無水乙醇中加入2.85 mL ABTS自由基工作液混勻，在734 nm處測(cè)定吸光度Do。用BHT溶液對(duì)ABTS+·的清除率作為對(duì)比，相關(guān)計(jì)算公式為：

ABTS自由基清除率=（1-Ds/Do）×100%。

1.3.2.5抗氧化能力測(cè)定[14]亞鐵還原能力（FRAP）反應(yīng)液配制方法：300 mmol/L 乙酸鈉緩沖液（pH值3.6）、10 mmol/L TPTZ溶液（40 mmol/L HCl為溶劑）、20 mmol/L FeCl3溶液，三者體積比為10 ∶1 ∶1。反應(yīng)液現(xiàn)配現(xiàn)用，在使用前放置在37 ℃的水浴中保溫。分別吸取 0.5、1.0、1.5、20、2.5、3.0 mmol/L的 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液，加入3 mL FRAP工作液，再加入0.3 mL超純水，混勻，于37 ℃下準(zhǔn)確反應(yīng)30 min，于593 nm處測(cè)定其吸光度D593 nm，用超純水調(diào)零，以FeSO4的濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)、D593 nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別移取0.2 mL不同濃度提取液于試管中，加入3.8 mL FRAP 工作液，混勻后在37 ℃下反應(yīng)30 min，測(cè)吸光度，各試驗(yàn)組均做3次平行，取均值。根據(jù)反應(yīng)后的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)FeSO4的濃度（mmol/L），定義為FRAP值。以BHT溶液測(cè)定的FRAP值作對(duì)比。

1.3.3數(shù)據(jù)分析采用DPS 7.5版分析軟件中的Duncans新復(fù)極差法對(duì)總酚、總黃酮含量、清除各自由基的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1對(duì)·OH自由基的清除作用

羥基自由基是目前所知活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大、并有非常高反應(yīng)速率的一種自由基，幾乎來不及擴(kuò)散就與碰到的分子發(fā)生反應(yīng)，使細(xì)胞壞死或突變；因此，研究羥基自由基的清除作用是研究抗氧化性中十分重要的一部分。本試驗(yàn)原理是H2O2與Fe2+發(fā)生Fenton反應(yīng)，生成具有很高活性的羥自由基，能與水楊酸反應(yīng)產(chǎn)生可用分光光度法測(cè)量的羥基化合物2，3-二羥基苯甲酸，但若加入清除羥自由基功能的物質(zhì)，便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)，從而使有色產(chǎn)物生成量減少。

從圖1可以看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，菝葜各極性提取物對(duì)·OH均有一定的清除作用，并在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系；其中乙酸乙酯萃取相清除率最大，提取物濃度為1.2 mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)到了58.73%，仍然小于同濃度下的BHT（清除率63.52%）；當(dāng)提取物濃度低于0.8 mg/mL時(shí)，清除率均不超過50%。這與乙酸乙酯層多酚、黃酮含量最高有關(guān)，因?yàn)槎喾?、黃酮有很好的抗氧化活性[15-16]。整體看出，清除·OH的強(qiáng)弱順序?yàn)椋築HT>乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>醇提物>石油醚相>三氯甲烷相。

2.2對(duì)DPPH自由基的清除作用

DPPH·是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，含有3個(gè)苯環(huán)，乙醇溶液呈紫色，在517 nm處有最大吸收波長，當(dāng)有清除劑時(shí)，清除劑提供1個(gè)電子與DPPH·的孤對(duì)電子配對(duì)，使溶液顏色變淡、吸光度變小，如果被測(cè)物能夠較好地清除DPPH·，表明該物質(zhì)能夠降低氧自由基、烷基自由基等的濃度，阻斷脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)。因此，對(duì)DPPH·清除率的高低是天然抗氧化劑篩選的指標(biāo)之一。

從圖2可以看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，菝葜各極性提取物對(duì)DPPH·均有一定的清除作用，并且隨其濃度的增加，能力也逐漸增強(qiáng)。其中乙酸乙酯相比其他萃取相清除DPPH自由基能力更強(qiáng)，乙酸乙酯萃取相甚至比同濃度的BHT清除率更高，當(dāng)提取物濃度為1.2 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯相的清除率達(dá)到了66.46%，而BHT清除率為60.41%，這與乙酸乙酯層黃酮、多酚含量最高有關(guān)。整體看出，清除DPPH·的強(qiáng)弱順序：乙酸乙酯相>BHT>正丁醇相>水相>醇提物>石油醚相>三氯甲烷相。

2.3對(duì)超氧陰離子的清除作用

在生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)中，有2%～5%的氧變成超氧陰離子，這種陰離子會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，這種自由基隨著生命活動(dòng)代謝而產(chǎn)生，其氧化能力很強(qiáng)，機(jī)體發(fā)生氧中毒往往是由這種自由基的毒性導(dǎo)致。因此清除超氧陰離子自由基的能力也是檢驗(yàn)抗氧化物質(zhì)活性的主要指標(biāo)。

從圖3可以看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，菝葜各萃取相對(duì) O-2· 均有一定的清除作用，且隨其濃度的增加清除率逐漸增大。當(dāng)提取物濃度為1.2 mg/mL，石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相、醇提物、BHT對(duì) O-2· 清除率分別為47.61%、43.95%、73.17%、67.54%、62.39%、59.48%、70.35%，乙酸乙酯相清除能力超過了同濃度的BHT。整體上看出，清除 O-2· 的強(qiáng)弱順序：乙酸乙酯>BHT>正丁醇>水相>50%乙醇>石油醚>三氯甲烷。

2.4對(duì)ABTS自由基的清除作用

ABTS與一定濃度的過硫酸鉀在室溫暗處反應(yīng)12～16 h，ABTS經(jīng)氧化后生成相對(duì)穩(wěn)定的藍(lán)綠色的ABTS+·，抗氧化劑與ABTS+·反應(yīng)后使其溶液褪色，溶液吸光度降低，吸光度越低，表明所檢測(cè)物質(zhì)的總抗氧化能力越強(qiáng)。

從圖4可以看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，菝葜各極性提取物對(duì)ABTS+·均有一定的清除作用，且隨其濃度的增加清除率逐漸增大。當(dāng)提取物濃度為1.2 mg/mL時(shí)，石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相、醇提物、BHT對(duì) ABTS+· 的清除率分別為42.46%、35.94%、95.84%、8991%、82.48%、78.62%、92.17%，乙酸乙酯相比其他極性提取物表現(xiàn)出更好的清除能力；當(dāng)提取物濃度為0.4 mg/mL時(shí)，BHT清除能力強(qiáng)于乙酸乙酯相；提取物濃度大于等于 0.6 mg/mL 后，乙酸乙酯相清除能力明顯增強(qiáng)，并逐漸超過了BHT。可能由于乙酸乙酯層的黃酮、 多酚含量比其他萃取相

高，因此清除ABTS+·的能力也更強(qiáng)。整體看出，清除ABTS+·的強(qiáng)弱順序：乙酸乙酯相>BHT>正丁醇相>水相>醇提物>石油醚相>三氯甲烷相。

2.5總抗氧化能力測(cè)定

Fe3+-TPTZ可被還原物質(zhì)還原為二價(jià)鐵離子形式，溶液呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，并在593 nm處具有強(qiáng)烈吸收，根據(jù)吸光度的大小計(jì)算樣品抗氧化活性的強(qiáng)弱，F(xiàn)RAP值越大，抗氧化能力越強(qiáng)。

根據(jù)FeSO4的濃度，得線性方程為：y=0.206 3x+0.047（r=0.999 2）。測(cè)得不同極性成分反應(yīng)吸光度（D）后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng) FeSO4的濃度（μmol/L），定義為FRAP值。從表2可以看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，菝葜不同極性成分的FRAP值與濃度呈量效關(guān)系，F(xiàn)RAP 值越大，其抗氧化活性越強(qiáng)；Fe3+還原抗氧化能力強(qiáng)弱順序

菝葜各萃取相均有一定抗氧化能力，且隨著濃度的增加，抗氧化活性增強(qiáng)，這是因?yàn)楦鬏腿∠嗑卸喾?、黃酮類，多酚、黃酮是植物中主要的抗氧化物質(zhì)，并且隨著萃取相濃度的增加，抗氧化活性也增強(qiáng)，其總酚、總黃酮含量最高的乙酸乙酯層抗氧化能力最強(qiáng)。抗氧化活性強(qiáng)弱順序：乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>醇提物>石油醚相>三氯甲烷相，這說明菝葜中的抗氧化活性物質(zhì)最多存在于乙酸乙酯相中。當(dāng)濃度為1.2 mg/mL時(shí)，BHT對(duì)·OH、DPPH·、 O-2· 、ABTS+·清除率分別為63.52%、60.41%、70.35%、92.17%，F(xiàn)RAP值為（151.57±0.16）mmol/g；乙酸乙酯相對(duì)·OH、DPPH·、 O-2· 、ABTS+·清除率分別為58.73%、66.46%、73.17%、95.84%，F(xiàn)RAP值為（186.25±0.21）mmol/g。除了清除·OH，其他的乙酸乙酯相的抗氧化效果相比BHT好。

試驗(yàn)結(jié)果充分證實(shí)了菝葜的乙酸乙酯萃取相有較強(qiáng)的抗氧化活性，這對(duì)于利用菝葜開發(fā)天然抗氧化功效因子提供了依據(jù)。但由于本試驗(yàn)僅是在體外進(jìn)行研究，而生物體內(nèi)的氧化代謝是很復(fù)雜的，因此還有待于從生物體內(nèi)源抗氧化酶系活性、生物大分子氧化代謝產(chǎn)物水平的角度來進(jìn)一步研究菝葜的抗氧化作用機(jī)制。

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