大孔樹脂分離富集葛根中葛根素及大豆苷元

高俊等

摘要：研究8種不同極性大孔吸附樹脂對葛根素、大豆苷元的吸附、解吸性能，篩選出分離富集葛根素、大豆苷元的最佳樹脂HP20。利用HP20大孔吸附樹脂吸附富集葛根中2種異黃酮的過程為：上樣液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為6，然后采用HP20大孔吸附樹脂在5 ℃的條件下進(jìn)行吸附。結(jié)果表明，HP20大孔吸附樹脂對葛根素、大豆苷元的飽和吸附量分別為（71.78±0.75）、（21.77±0.01）mg/g；吸附飽和后用去離子水洗滌樹脂以除去雜質(zhì)，在25 ℃條件下用70%乙醇解吸，得葛根素、大豆苷元，解吸率分別為63.39%、80.68%，葛根素純度由8.62%提高到35.26%，大豆苷元純度由0.27%提高到10.17%。

關(guān)鍵詞：葛根素；大豆苷元；大孔樹脂；吸附；解吸；分離；富集；工藝條件

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0292-05

葛根是豆科類植物野葛[Pueraria lobata （Willd.） Ohwi]的根，是一種常用中藥材。我國有著豐富的葛根資源，主要分為粉葛、野葛兩大類，尤以野葛的分布最為廣泛，且野葛中異黃酮類化合物含量高，常作藥用。葛根享有“山人參”的美稱，據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，葛根具有清熱解毒、改善微循環(huán)、降血壓、調(diào)節(jié)血脂等作用[1-2]。葛根素、大豆苷元是葛根中主要的藥物活性成分，臨床研究表明，葛根素對心腦血管疾病的治愈率達(dá)97.6%，且副作用低，深受患者歡迎；大豆苷元具有防止骨質(zhì)疏松作用，還能減輕婦女更年期綜合癥、降低冠心病的發(fā)病率、促進(jìn)神經(jīng)元的保護(hù)和再生[3-5]。隨著物質(zhì)生活日益豐富，心血管疾病患者不斷增多，以葛根異黃酮類化合物為原料的藥品是治療該類疾病的特效藥之一，因此，如何分離富集葛根提取液中的葛根素、大豆苷元成為當(dāng)下研究的熱點。

大孔樹脂是一類具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子有機(jī)聚合吸附劑，由于其具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、吸附選擇性獨(dú)特、吸附和解吸條件溫和、重復(fù)利用率高、安全無毒等優(yōu)點，近年來廣泛應(yīng)用于皂苷、黃酮、生物堿等天然產(chǎn)物的分離純化[6-9]。目前葛根中異黃酮類化合物的分離富集方法多以葛根素為主，忽略了大豆苷元的市場應(yīng)用價值，造成一定程度上的資源浪費(fèi)[10-11]。本研究選用不同極性的大孔樹脂同時分離富集葛根提取液中的葛根素、大豆苷元，考察大孔樹脂對葛根素、大豆苷元的吸附洗脫作用和過程動力學(xué)，并對優(yōu)選出的樹脂分離富集葛根素、大豆苷元的工藝條件進(jìn)行研究。

1材料與方法

1.1試驗材料

葛根[Pueraria lobata （Willd.） Ohwi]購自江蘇鎮(zhèn)江藥材市場，陰干、粉碎后保存?zhèn)溆?。對照品為葛根素、大豆苷元，Sigma公司產(chǎn)品；含量測定用色譜純甲醇、乙酸為J&K Chemical Ltd產(chǎn)品；去離子水為自制；大孔吸附樹脂HPD750、HPD600購自南開大學(xué)化工廠，HP20、D100、SP70、HPD722、HPD450A、HPD500購自鄭州勤實科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗儀器

Agilent 1260LC高效液相色譜儀配G1311-B四元泵、G1311-B自動進(jìn)樣器、G1316-A柱溫箱、G1314-F紫外檢測器，美國Agilent公司；Milli-Q純水儀，美國Millipore公司；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3大孔樹脂的預(yù)處理

在室溫條件下將樹脂用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇浸泡 24 h，每隔一段時間攪拌1次，每8 h更換1次乙醇溶液，之后用去離子水將樹脂洗至無乙醇味；用5%的HCl溶液將樹脂浸泡4 h后，用去離子水清洗樹脂直至清洗液pH值為7；用5%NaOH溶液將樹脂浸泡4 h后，用去離子水清洗樹脂直至清洗液pH值為7；最后用蒸餾水浸泡24 h。試驗中所用大孔樹脂的性質(zhì)見表1。

1.4葛根提取液的制備

取自然陰干的葛根，粉碎過篩備用。以葛根粉末（60～80目）為原料，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇為提取劑，按料液比1 g ∶8 mL在90 ℃條件下水浴回流提取2 h，重復(fù)提取3次，過濾并合并濾液。將濾液減壓蒸餾至無乙醇味，用去離子水分別配置成葛根素、大豆苷元含量為1.527、0.140 mg/mL的溶液備用。

1.5分析方法

采用高效液相色譜法檢測樣品液中葛根素、大豆苷元含量[12-15]。色譜條件：Agilent ODS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長250 nm；柱溫25 ℃；流速 1 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；流動相：A相為含0.1%乙酸的乙腈溶液，B相為含0.1%乙酸的水溶液，流動相配比見表2。

1.6葛根素、大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取5.00 mg葛根素標(biāo)準(zhǔn)品、 3.00 mg大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并于10 mL容量瓶中定容，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液（500 μg/mL葛根素，300 μg/mL大豆苷元）。精確量取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，用甲醇稀釋配制成以下濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液：250.000、125.000、62.500、31.250、15.625 μg/mL葛根素；150.000、75.000、37.500、18.750、9.375 μg/mL大豆苷元，分別用0.22 μm濾膜過濾后按“1.4”節(jié)中的色譜條件進(jìn)行檢測，每個濃度重復(fù)進(jìn)樣3次。

分別以葛根素、大豆苷元濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得葛根素、大豆苷元回歸方程：y=28 118.05x+20.67（r2=0.999 8）、y=20 638.31x+84.16（r2=0.999 7）。濃度分別在10～300、5～250 μg/mL范圍內(nèi)時葛根素、大豆苷元的濃度與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

1.7大孔樹脂分離富集葛根素、大豆苷元

1.7.1樹脂的篩選準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過的絕干質(zhì)量為 0.25 g 的不同型號的濕樹脂于100 mL錐形瓶中，加入30 mL葛根提取液，放入恒溫水浴振蕩器中。吸附條件：溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min，吸附24 h達(dá)到吸附平衡后過濾，取 1 mL 濾液，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。按式（1）計算各樹脂的吸附量：

Qe=（C0-Ce）×Vi（1-M）m。（1）

式中：Qe為吸附質(zhì)在吸附劑中的平衡吸附量，mg/g；Ce為平衡時吸附質(zhì)的濃度，mg/mL；C0為葛根提取液初始濃度，mg/mL；Vi為葛根提取液體積，mL；m為樹脂質(zhì)量，g；M為樹脂的含水率，%。

將吸附飽和的大孔樹脂置于100 mL錐形瓶中，加入 10 mL 去離子水沖洗樹脂后，過濾棄去去離子水，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，放入水浴振蕩器中。解吸條件：溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min，解吸24 h后分別取 1 mL 上清液，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。按式（2）計算各樹脂解吸率：

D=Cd×Vd（C0-Ce）Vi×100%。（2）

式中：D為樹脂的解吸率，%；Cd為解吸液中吸附質(zhì)的濃度，mg/mL；Vd為解吸液的體積，mL；Ce為平衡時吸附質(zhì)的濃度，mg/mL；C0為葛根提取液初始濃度，mg/mL；Vi為葛根提取液體積，mL。

1.7.2pH值對樹脂吸附性能的影響準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過的絕干質(zhì)量為0.25 g的不同型號的濕樹脂于100 mL錐形瓶中，加入30 mL不同pH值的葛根提取液（pH值分別為5、6、7、8、9，溶液的pH值用HCl、NaOH調(diào)節(jié)），放入恒溫水浴振蕩器中。吸附條件：溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min，吸附24 h后分別取樣1 mL，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。

1.7.3解吸液乙醇濃度對樹脂解吸性能的影響準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過的絕干質(zhì)量為0.25 g的不同型號的濕樹脂于 100 mL 錐形瓶中，加入30 mL葛根提取液，放入恒溫水浴振蕩器中。設(shè)定溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min，當(dāng)達(dá)到吸附平衡以后，過濾，用10 mL去離子水沖洗樹脂，之后加入10 mL不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（60%、70%、80%、90%、100%），放入水浴振蕩器中，設(shè)定溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min，解吸24 h分別取樣1mL，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。

1.7.4樹脂的吸附動力學(xué)曲線分別稱取3份預(yù)處理過的、絕干質(zhì)量為2.5 g的大孔吸附樹脂，置于1 000 mL具塞錐形瓶中，分別將300 mL葛根提取液加入到裝有樹脂的錐形瓶中，并將錐形瓶放入水浴振蕩器中，設(shè)置溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min，分別于0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00 h時取樣1 mL，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。

1.7.5樹脂的解吸動力學(xué)曲線分別稱取3份預(yù)處理過的絕干質(zhì)量為2.5 g的大孔吸附樹脂，置于1 000 mL具塞錐形瓶中，分別將300 mL葛根提取液加入到裝有樹脂的錐形瓶中，并將錐形瓶放入水浴振蕩器中，設(shè)定溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min；當(dāng)達(dá)到吸附平衡以后，過濾，用去離子水沖洗樹脂，之后加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，放入水浴振蕩器中，設(shè)定溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min，分別于5、10、20、30、40、50、60 min取樣1mL，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。

1.7.6樹脂的吸附等溫曲線稱取若干份預(yù)處理好的HP20樹脂，每份絕干質(zhì)量0.25 g，分別加入30 mL不同濃度的葛根提取液，在5、25、45 ℃的條件下分別吸附2 h后取樣1 mL，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。繪制出在不同溫度條件下的吸附等溫線，并利用Langrnuir方程進(jìn)行參數(shù)擬合。

1.7.7葛根素、大豆苷元純度的計算將HP20樹脂解吸液減壓濃縮至干，得葛根異黃酮粗品。稱取25 mg葛根異黃酮粗品，定容至25 mL的容量瓶中，取樣1 mL用0.22 μm濾膜過濾后，用HPLC檢測葛根素、大豆苷元的含量，并按式（3）計算其純度：

F=CfVfm×100%。（3）

式中：F為純度，%；Cf為溶液中吸附質(zhì)的濃度，mg/mL；Vf為溶液的體積，mL；m為葛根異黃酮粗品的質(zhì)量，mg。

2結(jié)果與分析

2.1大孔吸附樹脂的吸附量、解吸率

不同大孔樹脂對葛根素、大豆苷元的吸附和解吸性能有很大差異。如圖1-a所示，多數(shù)非極性、弱極性、中級性樹脂的吸附能力明顯優(yōu)于極性樹脂，這是因為樹脂對葛根素、大豆苷元的吸附特性主要表現(xiàn)為通過范德華力進(jìn)行吸附，從而有利于非極性、弱極性、中級性樹脂的吸附[16]；HP20、HPD722、HPD450A型樹脂表現(xiàn)出了較好的吸附性能，對葛根素、大豆苷元的吸附量都很高，其中HP20樹脂對葛根素、大豆苷元的吸附量分別達(dá)（61.78±0.36）、（12.77±0.02） mg/g。

如圖1-b所示，在解吸試驗中，不同極性的樹脂對葛根素、大豆苷元的解吸能力有所不同。大孔樹脂對于葛根素的解吸能力大致隨著極性的升高而增強(qiáng)；而對于大豆苷元，大孔樹脂的解吸能力大致隨著極性的升高而降低，這可能是由于吸附作用力強(qiáng)，解吸起來就會困難。綜合考慮樹脂的吸附量和解吸率，HP20型樹脂對于葛根素、大豆苷元的吸附和解吸能力與其他樹脂相比較高，因此選用HP20型樹脂進(jìn)行上樣液pH值對樹脂吸附性能影響的試驗。

2.2上樣液pH值對樹脂吸附性能的影響

吸附溶液的pH值是影響樹脂吸附性能的關(guān)鍵參數(shù)，這主要在于pH值影響溶質(zhì)的電離程度，從而影響溶質(zhì)與溶液之間的親和力。如圖2所示，當(dāng)pH值在5～6時，葛根素、大豆苷元的吸附量隨著pH值的升高而增加；當(dāng)pH值大于6