低溫處理下白玉菇絲氨酸蛋白酶的活性及分子特征

孫新菊等

摘要：白玉菇（Hypsizygus marmoreus）是真姬菇的白色品種，其營養(yǎng)價(jià)值豐富，具有獨(dú)特的蟹香味。為延長白玉菇的貨架期，對其進(jìn)行低溫處理，并研究在貯藏過程中絲氨酸蛋白酶活性及分子特征的變化。研究結(jié)果顯示，白玉菇在低溫（4 ℃）處理下可保鮮5 d，而在常溫（25～28 ℃）下保鮮時(shí)間則很短（1～2 d）；對白玉菇貯藏過程中絲氨酸蛋白酶的活性及Spr基因表達(dá)的研究表明：低溫處理下絲氨酸蛋白酶的活性及基因的表達(dá)都明顯低于對照。研究結(jié)果說明，白玉菇的貨架期與絲氨酸蛋白酶活性密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：白玉菇；低溫處理；絲氨酸蛋白酶；Spr基因表達(dá)；分子特征

中圖分類號(hào)： S646.909+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0270-03

白玉菇味比平菇鮮，肉比滑菇厚，質(zhì)比香菇韌，口感極佳，還具有獨(dú)特的蟹香味。白玉菇的蛋白質(zhì)中氨基酸種類齊全，包括8種人體必需氨基酸，其菇體潔白如玉，質(zhì)地細(xì)膩，是一種低熱量、低脂肪的保健食品[1]。

在食用菌貯藏過程中，會(huì)受到溫度、水分、采收時(shí)期、氣體環(huán)境、病原菌感染及有氧呼吸等的影響而出現(xiàn)失重、菌柄生長、菌傘開張、菌褶發(fā)育、菌蓋伸展、孢子形成與彈射、纖維素化、組織呈水浸狀、褐變以及品質(zhì)下降等現(xiàn)象[2]，這些癥狀的產(chǎn)生與食用菌的生理代謝及其分子機(jī)理密切相關(guān)。食用菌儲(chǔ)藏過程中，蛋白質(zhì)的降解會(huì)引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生理功能的變化，還會(huì)引起氨基酸含量的升高，正是氨基酸含量及組成的變化造成了食用菌風(fēng)味的變化[3]。絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要蛋白水解酶，廣泛分布于植物中，在生物有機(jī)體中起著重要而廣泛的生理作用[4-5]。目前已經(jīng)從芫荽、歐芹、雙孢菇等植物中分離到了不同類型的絲氨酸蛋白酶，其活性隨著植物生長發(fā)育階段的不同而變化。Azeez等研究發(fā)現(xiàn)，在唐菖蒲的衰老過程中絲氨酸蛋白酶的活性不斷提高[6]；Roberts等采用蛋白酶單一抑制劑的檢測方法在衰老的大麥葉片中和暗誘導(dǎo)衰老的大麥葉片中發(fā)現(xiàn)2種絲氨酸蛋白酶[7]。多種植物的衰老過程都與絲氨酸蛋白酶活性的不斷提高相關(guān)，如大麥、鳶尾、歐芹、月季、木樨和雙孢菇等[4-11]。

為延長白玉菇的貨架期，本研究對其進(jìn)行低溫處理，并研究在貯藏過程中絲氨酸蛋白酶活性及分子特征的變化。通過對白玉菇絲氨酸蛋白酶活性的測定及Spr基因表達(dá)的研究，不僅有助于揭示白玉菇采后品質(zhì)變化的分子機(jī)制，并可為調(diào)控白玉菇采后保鮮提供新途徑。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來自當(dāng)?shù)爻袆倓偵霞艿陌子窆?，并? h內(nèi)拿到實(shí)驗(yàn)室，選擇沒有機(jī)械損傷、疾病以及形狀、顏色均勻的作為試驗(yàn)材料（圖1-a）。試驗(yàn)材料分為2組，每組10個(gè)，一組放在4 ℃冰箱，另一組常溫放置（25～28 ℃）；分別放置 5 d，每組3次重復(fù)。每組的3個(gè)重復(fù)每天分別取樣（菌柄、菌蓋、菌褶）后立即用液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1絲氨酸蛋白酶活性的測定白玉菇絲氨酸蛋白酶活性的測定具體步驟參照絲氨酸蛋白酶（PRSS）ELISA試劑盒說明。

1.2.2基因組DNA提取采用改良的CTAB-氯仿-異戊醇法進(jìn)行白玉菇基因組DNA提取[12]。

1.2.3總RNA的提取及cDNA的合成本試驗(yàn)提取RNA所用的離心管、槍頭等塑料用品先用0.1%的DEPC水浸泡12 h，再高壓蒸汽滅菌20 min（120～126 ℃），烘干。研缽、研棒用三氯甲烷浸泡2 h，用干凈手套裝好并放入80 ℃烘箱中2 h，烘干。具體步驟參照BioFlux RNA提取試劑盒說明。

取1 μL RNA，加入2 μL溴酚藍(lán)，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果出現(xiàn)28S、18S 2條帶，說明RNA完整，5S帶有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)。28S帶的濃度是18S帶的2倍，說明RNA質(zhì)量很好（圖2）。第1鏈cDNA合成的具體步驟參照TaKaRa提取試劑盒說明。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）用DNASTAR軟件設(shè)計(jì)特異引物ActinF、ActinR、SprF、SprR（表1）。PCR反應(yīng)體系（25 μL）參照TaKaRa RT-PCR反應(yīng)體系說明書。在Bio-Rad熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，PCR反應(yīng)程

序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次重復(fù)，Actin基因?yàn)楸磉_(dá)分析內(nèi)標(biāo)參照，使用2-ΔΔCT法計(jì)算待測基因相對表達(dá)量，用Excel 2003整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖。

表1特異引物名稱及信息

引物堿基序列（5′→3′）ActinFTACTCCGTCTGGATTGGTGActinRGACTCGTCGTATTCTTGCTTSprFGCAAGCGCAGATGGAAATGGACASprRCTGGCGCCGACCGTGATGACT

2結(jié)果與分析

2.1白玉菇貨架期

白玉菇在低溫（4 ℃）處理下可保鮮5 d；在常溫（25～28 ℃）下保鮮時(shí)間則很短，為1～2 d（圖1-c），之后出現(xiàn)菌傘開張、組織失水、褐變及營養(yǎng)物質(zhì)流失等現(xiàn)象。

2.2絲氨酸蛋白酶的活性

由圖3可知，白玉菇在常溫貯藏過程中，絲氨酸蛋白酶的活性與貯藏0 d相比，一直處于上升趨勢并在貯藏4 d升到最高，之后又下降；在低溫貯藏過程中，絲氨酸蛋白酶的活性一直處于下降趨勢，直到在貯藏5 d時(shí)降到最低點(diǎn)。另外，在整個(gè)貯藏過程中，常溫處理下白玉菇絲氨酸蛋白酶的活性明顯高于低溫處理，可見低溫處理可以抑制絲氨酸蛋白酶的活性。

2.3絲氨酸蛋白酶基因的表達(dá)

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析表明，絲氨酸蛋白酶基因在貯藏0 d的白玉菇菌柄中的表達(dá)量最大，其次是菌蓋，菌褶中的表達(dá)量最低（圖4）。絲氨酸蛋白酶基因在常溫貯藏5 d的白玉菇菌柄中的表達(dá)量最大，在菌蓋、菌褶中的表達(dá)量很低；在低溫貯藏5 d的白玉菇菌柄中有少量表達(dá)，在菌蓋、菌褶中不表達(dá)（圖5）。絲氨酸蛋白酶基因在常溫貯藏的白玉菇菌柄中的表達(dá)一直處于上升趨勢并在貯藏4 d時(shí)升到最高，之后又下降；而在低溫貯藏的白玉菇菌柄中一直處于下降趨勢；絲氨酸蛋白酶基因在常溫貯藏的白玉菇菌柄中的表達(dá)量明顯高于低溫貯藏的（圖6）?？傮w看出，低溫處理下，絲氨酸蛋白酶基因的表達(dá)受到抑制，這個(gè)結(jié)果與絲氨酸蛋白酶的活性變化相一致。

3討論

由于食用菌貯藏過程中極易變質(zhì)，薄膜氣調(diào)包裝[13]、化學(xué)處理方法[14]、輻照處理[15]、溫度處理及CO2氣調(diào)處理[16]等采后處理技術(shù)已被廣泛用于各種食用菌，以解決其采后腐爛、貨架期短及品質(zhì)劣變的問題。蛋白酶在植物細(xì)胞程序性死亡（PCD）及衰老過程中均起重要作用[17-19]，白玉菇采收后，蛋白質(zhì)會(huì)因?yàn)榈鞍酌富螂拿傅淖饔梅纸獬砂被岫到猓谝欢ǔ潭壬蠈?dǎo)致菇體衰老、品質(zhì)及商品性急劇下降，因此研究白玉菇采后安全、有效的保鮮技術(shù)顯得尤為重要。

絲氨酸蛋白酶廣泛分布于植物中，多種植物的衰老過程都與其活性的不斷提高相關(guān)聯(lián)[4-10]。絲氨酸蛋白酶不僅作用于蛋白質(zhì)的降解，還常常作為一種信號(hào)涉及細(xì)胞程序性死亡（PCD）或調(diào)控細(xì)胞自噬[6，20-23]。在貯藏0、1 d的雙孢菇菌柄中，絲氨酸蛋白酶的活性比較低；而從貯藏2 d開始，其活性快速升高直到貯藏4 d，到貯藏5 d又下降[10]。在本研究中，白玉菇在常溫貯藏過程中，絲氨酸蛋白酶活性的變化與Burton等研究雙孢菇的結(jié)論[10]基本一致；本研究討論在低溫貯藏過程中，絲氨酸蛋白酶的活性一直處于下降趨勢，并且在整個(gè)貯藏過程中，低溫處理下白玉菇絲氨酸蛋白酶的活性明顯低于常溫處理，低溫能夠抑制絲氨酸蛋白酶的活性，從而延長貨架期。

Kingsnorth等研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蛋白酶基因在剛采收的雙孢菇中不表達(dá)，而在采后貯藏1 d的雙孢菇中開始表達(dá)，并在第3天達(dá)到最大值，之后又下降；Kingsnorth等還對雙孢菇不同組織中絲氨酸蛋白酶基因的表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在貯藏2 d的雙孢菇菌柄中的表達(dá)量最大[24]。Heneghan等應(yīng)用綠色熒光蛋白和雙孢菇Spr1基因啟動(dòng)子技術(shù)對該基因在雙孢菇中的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在雙孢菇子實(shí)體中，Spr1基因活動(dòng)定位于采后衰老的子實(shí)體菌柄中[11]。本研究中，在白玉菇3個(gè)不同部位（菌柄、菌蓋、菌褶），絲氨酸蛋白酶基因在菌柄中的表達(dá)量最大；與低溫處理相比較，絲氨酸蛋白酶在常溫貯藏4 d的白玉菇菌柄中的表達(dá)量最大，這些結(jié)果與Heneghan等的研究結(jié)果[11，24]基本一致。從本研究結(jié)果可以看出，低溫處理下，絲氨酸蛋白酶的活性和基因的表達(dá)均受到抑制，表明絲氨酸蛋白酶的高活性及高表達(dá)量在一定程度上導(dǎo)致白玉菇的衰老、品質(zhì)及商品性急劇下降。本研究有助于闡明白玉菇衰老的分子機(jī)制，并可為調(diào)控白玉菇采后保鮮以及延長貨架期提供重要的理論與實(shí)踐意義。

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