韓馳 仲文君 高志紅 霍希美 李百健 莊維兵 倪照君
摘要:建立了不同果梅(Prunus mumeSieb.etZuee)品種4個(gè)休眠時(shí)期花芽的茉莉酸(jasnlonieacid)含量的液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜(1iquidchrom atography-tandemtriplequadrupolemassspeetronletrie,LC-MS/MS)測定方法。樣品經(jīng)過甲醇提取,Agela CleanertSPE-NH2固相萃取小柱凈化。色譜分離采用c、。反相柱,以乙腈一水(水相含0.05%乙酸)為流動相梯度洗脫,質(zhì)譜分析采用ESI離子源、二級串聯(lián)質(zhì)譜、負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測。測定結(jié)果,方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好,茉莉酸r=0.9992,平均回收率范圍為78.18%~97.49%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=3)為1.25%~8.27%。該方法操作簡便,靈敏度高,選擇性好,回收率高,適合果梅花芽中茉莉酸的測定。結(jié)果表明,被測2個(gè)品種的果梅花芽中,休眠解除和生態(tài)休眠時(shí)期的茉莉酸含量高于內(nèi)休眠和抑制性休眠時(shí)期,推測內(nèi)源激素茉莉酸可能有抑制果梅休眠和促進(jìn)花芽正常生長的作用。本試驗(yàn)對進(jìn)一步探討果梅休眠與內(nèi)源激素茉莉酸的關(guān)系打下了一定的基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞:液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜;果梅;休眠;茉莉酸
中圖分類號:O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1002-1302(2015)05-0167-04
季節(jié)性休眠包括抑制性休眠、內(nèi)休眠和生態(tài)休眠3種類型,其中內(nèi)休眠又稱為自然休眠。果樹在休眠過程中受到環(huán)境因素尤其是光周期和溫度的影響啟動了一系列的生理生化反應(yīng),涉及到植物激素、信號物質(zhì)和多基因的表達(dá)和調(diào)控。芽的休眠由內(nèi)源激素控制,休眠的起始、終止均受激素調(diào)節(jié),環(huán)境因素(外部信號)也通過影響激素(內(nèi)部信號)的合成和運(yùn)輸來影響休眠進(jìn)程而改變低溫需求量。通常認(rèn)為,休眠是由內(nèi)源激素赤霉素、脫落酸、生長素和乙烯中的促進(jìn)生長物質(zhì)和抑制生長物質(zhì)之間平衡狀態(tài)決定。近期研究報(bào)道植物休眠與生長過程中也相繼發(fā)現(xiàn)了與茉莉酸代謝相關(guān)的基因。
茉莉酸類化合物在植物中具有多方面調(diào)節(jié)功能:(1)信號傳導(dǎo)作用。如在植物創(chuàng)傷、脅迫、病蟲害過程中,茉莉酸作為一種信號物質(zhì)在植物體內(nèi)傳遞生物或非生物脅迫的信號。(2)生理作用。如調(diào)節(jié)呼吸作用、花粉的發(fā)育、乙烯生物合成、果實(shí)的成熟、植物的光合作用和色素的形成、植物根系和植抹的生長,以及植物次生代謝的調(diào)節(jié)等。(3)基因的調(diào)控作用。如茉莉酸生物合成和茉莉酸信號通路相關(guān)的AOS、AOC、OPR3、JMT、LOX2,以及JAZs、COH、MYC2等基因都可能受茉莉酸的調(diào)控。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)作為一種新型的現(xiàn)代儀器分析手段,因其高靈敏性、高準(zhǔn)確性、高選擇性、分析檢測范圍寬、時(shí)間短以及定性定量方面的強(qiáng)大功能等特點(diǎn),在分析檢測領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本研究通過液質(zhì)聯(lián)用方法來測定果梅不同休眠時(shí)期花芽內(nèi)的茉莉酸含量,以期明確果梅休眠與內(nèi)源激素茉莉酸的關(guān)系。
1.材料與方法
1.1儀器與試劑
安捷倫1260液相色譜一(6530系列三級四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀、Eppendorf/Centrifuge5810R冷凍離心機(jī)、真空冷凍干燥機(jī)(中國北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn))、氮吹儀(美國OrganomationAssociates公司生產(chǎn))、高能量磨樣儀等。
二氫茉莉酸(dihydrojasmonicacid)購于TCI公司,茉莉酸購于Sigma公司,均為色譜級,產(chǎn)品純度>98%。甲醇、乙睛:色譜純,德國Merck公司產(chǎn)品,二氯甲烷(色譜級),乙酸(色譜級),市售純凈水(娃哈哈)。
1.2試驗(yàn)材料
供試材料為果梅品種桃形梅、豐后,均采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家果梅種質(zhì)資源圃。桃形梅為低需冷量的果梅品種,而豐后為高需冷量品種。分別采取不同果梅品種4個(gè)休眠時(shí)期的花芽,即抑制性休眠(A)、內(nèi)休眠(B)、生態(tài)休眠(c)、休眠解除(D)4個(gè)時(shí)期。每個(gè)品種的花芽分別采于3棵對應(yīng)品種的樹上。采樣日期的確定根據(jù)不同品種的需冷量和各自物候特征決定。在葉片脫落之前,花芽處于抑制性休眠階段;等待葉片脫落之后,剪取長勢正常的枝條若干用5%蔗糖水放于光照培養(yǎng)箱中,測定萌發(fā)率。光照培養(yǎng)箱保持70%的相對濕度,溫度為(25±1)℃,光一暗周期16h一8h。蔗糖溶液和新鮮的枝條每3d更換1次,當(dāng)芽尖端冒出綠色萼片時(shí),即認(rèn)為萌發(fā)了。研究結(jié)果,果梅花芽的萌發(fā)率與其需冷量呈正相關(guān)(r=0.9797)。光照培養(yǎng)箱中枝條的萌芽率小于50%時(shí),此期間采取的花芽被認(rèn)為處于內(nèi)休眠階段;當(dāng)萌芽率大于50%時(shí),則處于生態(tài)休眠階段。在大田中正常生長的花芽萌發(fā)率達(dá)到50%時(shí),此階段采取的花芽則處于休眠解除階段。
1.3樣品處理
1.3.1茉莉酸提取稱取0.1g果梅花芽并加入400ng二氫茉莉酸作為內(nèi)標(biāo)物裝在2mL離心管中,樣品經(jīng)液氮冷凍磨成細(xì)粉末。用800bL80%冷甲醇提取3次,每次渦旋10min,4℃12000r/min離心10min,收集上層液。氮吹濃縮蒸發(fā)至水相,用2mol/L的HCI調(diào)pH值至2.5~3.0。用等體積乙酸乙酯萃取3次,每次渦旋10min,4℃12000r/min離心10min,吸取上層有機(jī)相到同一管中,氮?dú)獯蹈?,待進(jìn)一步純化。
1.3.2純化提取步驟中的蒸干樣品用1mL二氯甲烷/甲醇(V:V=99:1)溶解淋洗離3次,并將同一重復(fù)的2份樣品溶解收集到同一管中。純化用Agela Cleanert SPE—NH2(500mg/6mL)固相萃取小柱。小柱用前用6mL二氯甲烷一甲醇(V:v=99:1)活化。全部6mL樣品上柱,棄去過柱廢液,用3ml二氯甲烷一甲醇(v:V=99:1)淋洗柱子,棄去淋洗液。用2%的乙酸甲醇溶液分3次洗脫,第1次用4mL,第2、第3次用3mL,用干凈的離心管收集洗脫液。洗脫液真空冷凍至干,用0.3mL的0.05%乙酸水溶液一乙睛(V:V=80:20)溶解,再用0.22μm微孔膜過濾,收集濾液-20℃條件下保存?zhèn)溆?。待測樣品分別標(biāo)號桃形梅A、桃形梅B、桃形梅c、桃形梅D、豐后A、豐后B、豐后c、豐后D,每個(gè)樣品設(shè)置3份重復(fù)。
1.4LC-MS條件
1.4.1色譜條件色譜柱C18(2.1×50innl,1.8μm,B型全多孔,安捷倫);柱溫40qC;流動相A1:O.1%甲酸水,流動相B1:甲醇;流動相A2:0.05%乙酸水,流動相B2:乙睛。在已建立的質(zhì)譜條件下改變流動相的配比和流速優(yōu)化目標(biāo)物分離的線性梯度洗脫程序。
1.4.2質(zhì)譜條件對茉莉酸和二氫茉莉酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜掃描,確定其母離子與子離子。優(yōu)化毛細(xì)管出口電壓、碰撞氣能量、干燥氣溫度、干燥氣流速、噴霧壓力等條件,確定其特征離子,選擇相對強(qiáng)度大、信號穩(wěn)定的碎片離子作為檢測離子。
1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
準(zhǔn)確配制0.75、1.25、2.50、5.00、10.00ng/μL的茉莉酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,進(jìn)行儀器分析,以峰面積(_v)對濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以保留時(shí)間、茉莉酸和二氫茉莉酸的母離子與子離子定性,以內(nèi)標(biāo)法定量。
2.結(jié)果與分析
2.1色譜條件的建立
色譜檢測時(shí),最初5inn的洗脫液排入廢液池(防止對MS離子源帶來背景干擾和非揮發(fā)性的鹽污染質(zhì)譜儀);流速0.4mL/min;檢測器DND,進(jìn)樣量為10μL。因?yàn)榱鲃酉嗟慕M成對LC-MS/MS測定的信號強(qiáng)度會產(chǎn)生很大的影響,我們對比了2種流動相對于色譜行為的影響。結(jié)果表明,流動相A2:0.05%乙酸水,流動相B2:乙睛,出的峰更好,所以選擇了第2種流動相為測定花芽中的茉莉酸含量。并且優(yōu)化了梯度洗脫程序(表1)。
2.2質(zhì)譜條件的確定
為了消除復(fù)雜基質(zhì)對檢測器靈敏度的影響,采用串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)技術(shù),目標(biāo)物經(jīng)過液相色譜柱分離后,經(jīng)過一級質(zhì)譜對相對分子質(zhì)量進(jìn)行篩選,電離后經(jīng)過二級質(zhì)譜對離子進(jìn)行篩選,從而提高了被分析物的信噪比,去除了共流出物的干擾,最大限度地排除雜質(zhì)背景,顯著提高實(shí)際樣品的靈敏度和定量分析的準(zhǔn)確性。質(zhì)譜條件見表2。
2.3
回歸方程及樣品的液相質(zhì)譜特征
該方法所得茉莉酸的回歸方程為y=44815.50x+14125.83,r=0.9992,二氫茉莉酸的回歸方程為y=54299.44x+165045.08,r=0.9994,呈較好的線性關(guān)系。從圖1-a可見,茉莉酸的出峰時(shí)間為4.8min,其質(zhì)譜圖見圖1-b。從圖2-a可見,內(nèi)標(biāo)二氫茉莉酸的出峰時(shí)間為5.7min,其質(zhì)譜圖見圖2-b。
2.4精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)
在桃形梅A、B、C、D和豐后A、B、C、D樣品中,分別加入茉莉酸標(biāo)樣10.0ng。按前述方法測定茉莉酸含量,重復(fù)3次,計(jì)算回收率結(jié)果見表3。
從表3可以看出,該方法的平均回收率范圍為78.18%~97.49%,RSD為1.25%~8.27%。
2.5樣品的測定
運(yùn)用LC-MS/MS法對2個(gè)品種不同休眠時(shí)期的花芽分別進(jìn)行檢測,茉莉酸含量結(jié)果分析見圖3、圖4。
3.討論
茉莉酸在植物界中普遍存在,廣泛分布于植物的幼嫩組織、花和發(fā)育的生殖器官中,通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控植物生長發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)。隨著研究的深入,茉莉酸的生物學(xué)作用越來越受關(guān)注。本研究通過測定不同品種果梅的花芽中茉莉酸的含量,初步探索果梅4個(gè)休眠時(shí)期與茉莉酸含量的內(nèi)在聯(lián)系。
2個(gè)品種間,茉莉酸在抑制性休眠和內(nèi)休眠時(shí)期含量偏低,而在生態(tài)休眠期茉莉酸含量明顯高于內(nèi)休眠時(shí)期的。這一現(xiàn)象得出茉莉酸的合成在抑制性休眠和內(nèi)休眠時(shí)期被抑制,推測茉莉酸對果梅的休眠可能有抑制作用。茉莉酸與植物的發(fā)育密切相關(guān),如種子的萌發(fā)和生長、貯藏蛋白的積累等。而生長停止是植物進(jìn)入休眠的前提條件,也是多年生植物抵御冬季低溫的機(jī)制之一。所以在抑制性休眠和內(nèi)休眠時(shí)期,茉莉酸的含量偏低,則不利于植物的生長與相關(guān)蛋白等的積累,但有利于植物休眠的順利進(jìn)行。
生態(tài)休眠是植物休眠經(jīng)歷的第三個(gè)階段,它是由于外界不利的生長條件而造成,如干旱或低溫等。一旦外界條件合適,植物可以很快恢復(fù)生長,而內(nèi)休眠即使條件合適也不會恢復(fù)生長,必須滿足其需冷量后才能在適宜條件下生長。本試驗(yàn)中,供試的2個(gè)果梅品種花芽在生態(tài)休眠時(shí)期的茉莉酸含量比抑制性休眠和內(nèi)休眠時(shí)期有所增加。zhong等在數(shù)字基因表達(dá)譜研究中也發(fā)現(xiàn)茉莉酸相關(guān)基因在生態(tài)休眠期間的表達(dá)量高于內(nèi)休眠時(shí)期的。茉莉酸含量的增大有利于花芽在生態(tài)休眠期間貯存蛋白積累,為促進(jìn)花芽萌發(fā)做準(zhǔn)備。在花的發(fā)育過程中,茉莉酸含量多少也與花粉育性有關(guān)。生態(tài)休眠期間,茉莉酸含量明顯增加另有一種解釋,也有可能與果梅自身的防御系統(tǒng)相關(guān)。生態(tài)休眠本就是由于外界不利的生長條件所造成,植物在遭遇不利環(huán)境因子脅迫時(shí),自身增大了茉莉酸的合成量,加強(qiáng)了茉莉酸在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的信使作用,并誘導(dǎo)一系列植物防御基因的表達(dá)、防御反應(yīng)化學(xué)物質(zhì)的合成等,從而調(diào)節(jié)植物的免疫和應(yīng)激反應(yīng)。相關(guān)研究表明,茉莉酸合成途徑的激活對于應(yīng)激信號的傳遞和放大是必不可少的。
從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出,桃形梅和豐后花芽內(nèi)的茉莉酸含量,在休眠解除時(shí)期明顯高于生態(tài)休眠時(shí)期。休眠解除,果樹正常生長,生理反應(yīng)開始活躍,茉莉酸合成也大大增加。同時(shí)也說明茉莉酸合成相關(guān)基因在前3個(gè)休眠時(shí)期可能被某種程度抑制了。相關(guān)報(bào)道指出,茉莉酸可以激活乙烯相關(guān)基因來調(diào)控休眠,乙烯合成在休眠期間也是被抑制的,表明茉莉酸在調(diào)控果梅休眠進(jìn)程上作用于乙烯存在著密切的關(guān)聯(lián)。這需要進(jìn)一步研究闡述。
植物體內(nèi)的激素代謝途徑是相互交聯(lián)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)?;?個(gè)果梅品種花芽的茉莉酸含量在生態(tài)休眠和休眠解除時(shí)期高于抑制性休眠和內(nèi)休眠時(shí)期,我們可以推測,茉莉酸含量增加是有利于芽的萌發(fā)與生長,并促進(jìn)果梅花芽打破休眠。Rinne等在楊樹上研究表明,除了FT、CENLl等基因外,脂質(zhì)體相關(guān)的1,3-β-葡聚糖水解酶基因家族(GHl7)也參與了休眠調(diào)控,光周期、低溫、赤霉素3和赤霉素4均可上調(diào)該基因的表達(dá),從而促進(jìn)FT和CENLl的表達(dá),休眠芽停止休眠,重新恢復(fù)生長。盡管GA3和GA4都可以促進(jìn)基因的表達(dá),但只有GA4在實(shí)際中促進(jìn)休眠芽的萌發(fā)。本研究中,推測茉莉酸也可能具有GA4打破休眠的功能。Sasaki等通過基因芯片技術(shù)在擬南芥中發(fā)現(xiàn),41個(gè)茉莉酸響應(yīng)的基因中有5個(gè)是茉莉酸合成途徑的基因,而JAs的合成途徑是屬于正反饋調(diào)控的。茉莉酸合成途徑基因的過量表達(dá)會促進(jìn)茉莉酸的合成,如番茄中AOC基因的過量表達(dá)提升了花組織中JAs的含量,茉莉酸合成途徑的產(chǎn)物又為其提供了一條正反饋回路。在果梅休眠期間,施加一定濃度的茉莉酸是否會促進(jìn)其正反饋路徑,使信號效應(yīng)可以不斷逐級放大,誘導(dǎo)一系列的后續(xù)反應(yīng),達(dá)到休眠解除的效果,還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。