• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    新疆天山馬鹿布氏桿菌病流行病學(xué)調(diào)查

    2015-10-20 00:31:36武軍元等
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年9期

    武軍元等

    摘要:采用平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)對采自新疆3個(gè)集約化養(yǎng)殖鹿場、1個(gè)散養(yǎng)鹿群的410份血清樣本進(jìn)行布氏桿菌特異性抗體檢測;采用分子生物學(xué)方法,根據(jù)GenBank公布的布氏桿菌外膜蛋白Omp25c的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,對疑似布氏桿菌陽性的10份羊水病料進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy Vector進(jìn)行測序。結(jié)果表明,血清稀釋比例為1 ∶25時(shí),平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)的抗體陽性率分別為15.1%、14.6%,4份羊水樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上均觀察到預(yù)期149 bp大小的擴(kuò)增條帶,BLAST比對分析顯示該擴(kuò)增序列與布氏桿菌基因組的核苷酸序列同源性為100%,從而判定新疆集約化養(yǎng)殖的天山馬鹿存在布氏桿菌病的感染。

    關(guān)鍵詞:布氏桿菌;天山馬鹿;平板凝集;試管凝集;Omp25c

    中圖分類號(hào):S852.61+2;S858.255.1+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2015)09-0235-02

    布氏桿菌?。╞rucellosis)又稱馬爾他熱、波狀熱,是由布氏桿菌屬(Brucella)細(xì)菌引起的人畜共患病。布氏桿菌可感染人類、多種家畜和野生動(dòng)物,引起相似的臨床癥狀與病理損傷。該病最典型的癥狀為懷孕母畜流產(chǎn)、空懷不育、子宮炎、乳房炎,以及公畜睪丸炎、關(guān)節(jié)炎等。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類動(dòng)物疫病,中國將其列為二類動(dòng)物疫病。全世界有170多個(gè)國家和地區(qū)存在和流行人畜共患布氏桿菌病,每年因該病造成的經(jīng)濟(jì)損失約30億美元[1]。根據(jù)其宿主的嗜好性可將布氏桿菌分為豬、牛、羊、犬、綿羊附睪、沙林鼠種布魯氏菌6個(gè)種及20個(gè)型[2]。我國鹿群中流行的布魯氏菌主要為豬型、牛型、羊型、非典型布魯氏菌[3-4]。天山馬鹿是產(chǎn)于新疆維吾爾自治區(qū)天山山脈的鹿品種,是國家二類保護(hù)動(dòng)物。目前,關(guān)于新疆天山馬鹿感染布氏桿菌的情況尚未見報(bào)道,更無應(yīng)用分子生物學(xué)手段對天山馬鹿進(jìn)行布氏桿菌流行病學(xué)的檢測及研究。通過對新疆地區(qū)集約化養(yǎng)殖、散養(yǎng)的天山馬鹿進(jìn)行布氏桿菌病流行病學(xué)調(diào)查,以了解當(dāng)?shù)靥焐今R鹿的布氏桿菌感染狀況。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1血清及病料來源410份血清樣本分別采自新疆地區(qū)3個(gè)集約化養(yǎng)殖鹿場、1個(gè)散養(yǎng)鹿群;10份疑似布氏桿菌陽性的羊水病料采自新疆地區(qū)集約化養(yǎng)殖鹿場。

    1.1.2試驗(yàn)菌株布氏桿菌疫苗株M5購自新疆天康畜牧生物技術(shù)公司。

    1.1.3主要試劑及儀器設(shè)備HiPure Gel Pure DNA Kits,購自Magen公司;pGEM-T Easy Vector,購自Promega公司;Trans 2K DNA Markers、Trans Taq-T DNA Polymerase,均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒,購自天根生化科技有限公司;布氏桿菌虎紅平板凝集抗原、布氏桿菌試管凝集抗原、布氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;布氏桿菌陰性參考血清為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。梯度PCR儀、全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)、高速離心機(jī)均為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

    1.2方法

    1.2.1虎紅平板凝集試驗(yàn)虎紅平板凝集試驗(yàn)是一種快速、敏感的檢測方法,用于布氏桿菌病的田間篩選,具體操作及判定方法參照GB/T 18646—2002《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》。

    1.2.2試管凝集試驗(yàn)試管凝集試驗(yàn)是一種特異、敏感的布氏桿菌病檢測方法,用于布氏桿菌病的診斷,具體操作及判定方法參照GB/T 18646—2002《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》。

    1.2.3布氏桿菌基因組DNA的制備將疑似布氏桿菌陽性的羊水病料劃線接種于TSA瓊脂平板,置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取單菌落接種至TSB培養(yǎng)基。取1 mL TSB培養(yǎng)物以12 000 r/min離心5 min,棄上清。

    以200 μL TE(1 mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris-HCl,pH值7.6)重懸沉淀,于95 ℃煮沸5 min,以12 000 r/min離心 10 min,上清即為細(xì)菌DNA模板。

    1.2.4樣品的PCR檢測根據(jù)布氏桿菌特異性基因Omp25c的保守片段,采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,引物序列為:Omp25c FP 5′-TTTGGATGAAAATAACGCC-3′;Omp25c RP 5′-ATTCGCCCCTGTTTCTCA-3′。

    所采用的25 μL反應(yīng)體系為:10×PCR緩沖液2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 1.0 μL、Taq DNA聚合酶(5 U)0.5 μL、上下游引物各1.0 μL(10 μmol/L)、DNA模板2.0 μL、無RNA酶的水17.0 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳,在紫外燈下觀察結(jié)果。

    1.2.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、克隆、測序采用HiPure Gel Pure DNA Kits試劑盒,按照說明書對電泳后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并純化,將純化回收的PCR產(chǎn)物連接至pGEM-T Easy Vector。連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α(天根公司產(chǎn)品)并進(jìn)行氨芐青霉素抗性篩選。選擇抗性菌落增菌培養(yǎng),并采用質(zhì)粒小提試劑盒從擴(kuò)增的細(xì)菌培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒,將PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

    2結(jié)果與分析

    2.1血清學(xué)檢測結(jié)果

    用PBS溶液對采集的410份天山馬鹿血清依次進(jìn)行倍比稀釋(1 ∶25、1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200),并分別采用平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果見表1、表2。

    2.2PCR檢測結(jié)果

    應(yīng)用針對特異性基因Omp25c保守片段設(shè)計(jì)的引物,分別對疑似陽性病料、對照疫苗菌株M5的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示,10份疑似布氏桿菌陽性的羊水病料中有4份呈陽性,陽性率為40%,在1.2%瓊脂糖凝膠上觀察到預(yù)期大小為149 bp的擴(kuò)增條帶。采用M13通用引物對PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序,并將獲得的核苷酸序列進(jìn)行BLAST對比,證明所擴(kuò)增及克隆的核酸片段為布氏桿菌Omp25c保守的核苷酸序列。陽性樣品的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1,擴(kuò)增子測序序列的BLAST比對分析結(jié)果見圖2。

    3結(jié)論與討論

    布魯氏菌病是由布氏桿菌引起的一種人獸共患傳染病,布氏桿菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌,具有逃避機(jī)體免疫保護(hù)的能力。對于布氏桿菌病的診斷,GB/T18646—2002《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》規(guī)定的虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)一直是我國動(dòng)物布病檢測的經(jīng)典試驗(yàn)方法[5]。然而,對于受到免疫抑制且攜帶病原的宿主動(dòng)物,抗體水平很難達(dá)到有效的檢測滴度,需借助分子生物學(xué)方法來檢測動(dòng)物體內(nèi)的病原體,因此必須篩選布氏桿菌種間高度保守的目的基因,而Omp25c是目前最具代表性的布氏桿菌外膜蛋白之一,具有較強(qiáng)的免疫原性,且在布氏桿菌各種間高度保守[6-7]。以O(shè)mp25c外膜蛋白為研究對象,選取特異性較好的基因片段設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)布氏桿菌病原菌的檢測。

    近年來,新疆地區(qū)多個(gè)畜種均有布氏桿菌病感染的報(bào)道[8-10],嚴(yán)重威脅當(dāng)?shù)厝诵蠼】导靶竽翗I(yè)的安全生產(chǎn)。天山馬鹿是產(chǎn)于新疆維吾爾自治區(qū)天山山脈的鹿品種,是國家二類保護(hù)動(dòng)物。早期,野生天山馬鹿在新疆較為多見,隨著近年來市場對天山馬鹿所產(chǎn)鹿茸、鹿胎、鹿血、鹿筋、鹿角膠等鹿產(chǎn)品需求的不斷擴(kuò)大,天山馬鹿在新疆呈現(xiàn)集約化養(yǎng)殖的趨勢。有文獻(xiàn)初步報(bào)道,新疆天山馬鹿由野生放養(yǎng)到與其他家畜混養(yǎng),曾出現(xiàn)過布氏桿菌感染的病例[11-12],然而上述流行病學(xué)調(diào)查研究均僅限于血清學(xué)水平,不能排除假陽性、假陰性存在的情況。為系統(tǒng)了解新疆天山馬鹿集約化養(yǎng)殖后,布氏桿菌病在該畜群中的流行狀況,本研究采用血清學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的技術(shù)手段,對當(dāng)?shù)靥焐今R鹿布氏桿菌病的感染情況進(jìn)行系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果表明,新疆天山馬鹿集約化養(yǎng)殖后確實(shí)出現(xiàn)了布氏桿菌病感染的病例。對血清樣品進(jìn)行布氏桿菌特異性抗體檢測時(shí),平行采用虎紅平板凝集試驗(yàn)與試管凝集試驗(yàn),然而以不同方法對同一批血清測得的陽性率不同,可見僅靠血清學(xué)檢測抗體的方法難以對畜群感染布氏桿菌的程度進(jìn)行定論。以布氏桿菌高度保守的Omp25c外膜蛋白基因?yàn)檠芯繉ο?,?0份疑似布氏桿菌陽性的羊水病料中篩選出4份陽性病例,進(jìn)一步提供了布氏桿菌感染新疆天山馬鹿的證據(jù)。確定感染新疆天山馬鹿的布氏桿菌種型尚需進(jìn)一步研究,從而有針對性地對天山馬鹿進(jìn)行布氏桿菌病的防控。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Seleem M N,Boyle S M,Sriranganathan N. Brucellosis:a remerging zoonosis[J]. Veterinary Microbiology,2010,140(3/4):392-398.

    [2]Díaz-Apancio E,Marin C,Alonso-Urmeneta B,et al. Evaluation of serological tests for diagnosis of Brucella melitensis in fection of goats[J]. Clin Microbiol,2004,32(5):1159-1165.

    [3]鄧小紅,曾政,王希良. 布魯氏菌pcDNA3.1-omp17.3基因疫苗的研制[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué),2007,37(6):505-509.

    [4]陳偉業(yè),胡森,黃克和,等. IS711和omp2作為布氏桿菌種屬及種株間分子鑒別診斷標(biāo)記的研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,28(6):676-680.

    [5]鄭錦玲,蔣成硯,董仲生,等. 布氏桿菌病檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2006,22(6):25-28.

    [6]曲勍,王玉飛,喬鳳,等. Omp25c基因?qū)︸R耳他布魯菌疫苗株M5的毒力及免疫保護(hù)性的影響[J]. 生物技術(shù)通訊,2009,20(5):639-642.

    [7]Caro H P,F(xiàn)ernandez L L,de Miguel M J,et al. Role of the omp25/omp31 family in outer membrane properties and virulence of Brucella ovis[J]. Infection and Immunity,2007,75(8):4050-4061.

    [8]李玲,閆晶華,閆昊,等. 新疆畜間布魯氏菌病流行情況及防制技術(shù)研究[J]. 草食家畜,2012,156(3):19-22.

    [9]石琴,袁立崗,蒲敬偉,等. 山區(qū)牧場牛羊布魯氏菌病感染情況調(diào)查與分析[J]. 中國動(dòng)物檢疫,2013,30(2):40-41.

    [10]張魯安,蘇貴成,李 杰,等. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜間布病監(jiān)測分析及防控對策[J]. 新疆農(nóng)墾科技,2012(4):26-28.

    [11]曾鵬武,李靈,陳勝文. 天山馬鹿布魯氏菌病的檢疫和防制[J]. 中國獸醫(yī)科技,2004,34(1):73-75.

    [12]孟慶玲,楊?yuàn)^東,賈桂珍,等. 昌吉地區(qū)天山馬鹿布氏桿菌病血清學(xué)調(diào)查[J]. 塔里木大學(xué)學(xué)報(bào),2006,18(3):32-33.

    王海, 王康環(huán), 蔣小松,等. 優(yōu)質(zhì)肉雞硫胺素含量以及TPK1基因的多態(tài)性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(9):237-239.

    亚洲国产中文字幕在线视频| av国产精品久久久久影院| 成人国语在线视频| 精品亚洲成国产av| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 天堂中文最新版在线下载| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 69精品国产乱码久久久| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲国产欧美网| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 一区二区三区精品91| 中出人妻视频一区二区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 妹子高潮喷水视频| 手机成人av网站| 亚洲精品中文字幕一二三四区| av视频免费观看在线观看| 黄色 视频免费看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 高清欧美精品videossex| 伦理电影免费视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 最近最新中文字幕大全免费视频| 日本五十路高清| 三上悠亚av全集在线观看| 91老司机精品| 精品久久蜜臀av无| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲欧美激情在线| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲男人天堂网一区| 乱人伦中国视频| av线在线观看网站| 久久久水蜜桃国产精品网| 黄片大片在线免费观看| 午夜成年电影在线免费观看| 高清欧美精品videossex| 午夜影院日韩av| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 午夜免费成人在线视频| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲人成电影免费在线| 怎么达到女性高潮| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日本黄色日本黄色录像| tocl精华| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 老鸭窝网址在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 91成人精品电影| 黑丝袜美女国产一区| 热99re8久久精品国产| 一区二区三区国产精品乱码| 18禁观看日本| x7x7x7水蜜桃| av国产精品久久久久影院| 精品国产亚洲在线| 午夜免费观看网址| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲成国产人片在线观看| 精品国产国语对白av| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久久国产精品麻豆| 热99re8久久精品国产| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 十八禁网站免费在线| 桃红色精品国产亚洲av| 两个人看的免费小视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美日韩乱码在线| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 亚洲情色 制服丝袜| 日本黄色视频三级网站网址 | 又黄又粗又硬又大视频| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产成人精品久久二区二区免费| 国产有黄有色有爽视频| 99国产综合亚洲精品| 国产精华一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 成年女人毛片免费观看观看9 | av不卡在线播放| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产成人精品无人区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 老司机亚洲免费影院| 99re在线观看精品视频| av网站免费在线观看视频| 免费av中文字幕在线| 免费日韩欧美在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久 成人 亚洲| 亚洲成人手机| 一区二区三区激情视频| 成人国产一区最新在线观看| 久久久久久久国产电影| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲精品粉嫩美女一区| 超色免费av| 狂野欧美激情性xxxx| 久久青草综合色| 亚洲专区字幕在线| 一本大道久久a久久精品| 亚洲熟女毛片儿| 精品久久久久久,| 女人久久www免费人成看片| а√天堂www在线а√下载 | 在线国产一区二区在线| 麻豆成人av在线观看| 精品一区二区三卡| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产av精品麻豆| 久久99一区二区三区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 香蕉国产在线看| svipshipincom国产片| 日日夜夜操网爽| 中文字幕av电影在线播放| 超碰成人久久| 麻豆成人av在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 午夜福利,免费看| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品偷伦视频观看了| 人人妻人人澡人人看| 欧美成狂野欧美在线观看| 在线av久久热| 国产高清国产精品国产三级| 丰满迷人的少妇在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 精品国产国语对白av| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美不卡视频在线免费观看 | 丰满的人妻完整版| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久久久久久久久久久大奶| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久久国产成人免费| 精品久久久久久电影网| 老司机午夜福利在线观看视频| 精品欧美一区二区三区在线| 精品久久久精品久久久| 美女视频免费永久观看网站| 啦啦啦免费观看视频1| 成在线人永久免费视频| 制服诱惑二区| xxx96com| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美在线黄色| 国产伦人伦偷精品视频| 国产男女超爽视频在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 大片电影免费在线观看免费| 日日爽夜夜爽网站| 村上凉子中文字幕在线| 午夜福利在线观看吧| 国产99久久九九免费精品| 国产日韩欧美亚洲二区| 母亲3免费完整高清在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频 | 亚洲全国av大片| 国产亚洲精品久久久久5区| 在线播放国产精品三级| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国产淫语在线视频| 午夜精品在线福利| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久精品国产清高在天天线| 国产国语露脸激情在线看| 成年人午夜在线观看视频| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲免费av在线视频| 老司机亚洲免费影院| 亚洲久久久国产精品| 国产精品亚洲av一区麻豆| 在线观看66精品国产| 国产一区在线观看成人免费| 在线看a的网站| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美乱色亚洲激情| 国产一卡二卡三卡精品| 性少妇av在线| 成人特级黄色片久久久久久久| 午夜福利在线免费观看网站| av一本久久久久| 亚洲 国产 在线| 人成视频在线观看免费观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 在线观看一区二区三区激情| 中文欧美无线码| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲久久久国产精品| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品av久久久久免费| 最近最新中文字幕大全电影3 | 免费在线观看黄色视频的| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 老司机福利观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲av日韩在线播放| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 在线视频色国产色| 一区在线观看完整版| 女性被躁到高潮视频| 亚洲av成人av| www.精华液| 好男人电影高清在线观看| 国产精品 国内视频| 亚洲av片天天在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 身体一侧抽搐| 久久精品国产亚洲av高清一级| 欧美最黄视频在线播放免费 | 19禁男女啪啪无遮挡网站| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 91字幕亚洲| 最近最新免费中文字幕在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 久久精品国产清高在天天线| 女人被狂操c到高潮| 精品国产亚洲在线| 国产成人精品无人区| 男男h啪啪无遮挡| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 美女视频免费永久观看网站| a级毛片在线看网站| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 精品人妻在线不人妻| 99riav亚洲国产免费| 亚洲一区高清亚洲精品| 老司机影院毛片| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲国产精品合色在线| 两个人免费观看高清视频| 国产精华一区二区三区| 脱女人内裤的视频| 美女国产高潮福利片在线看| 久久亚洲精品不卡| 久久人妻熟女aⅴ| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产又色又爽无遮挡免费看| 这个男人来自地球电影免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 一a级毛片在线观看| 国产精品.久久久| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 色综合婷婷激情| 国产深夜福利视频在线观看| 满18在线观看网站| 午夜久久久在线观看| 不卡av一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲 欧美一区二区三区| 涩涩av久久男人的天堂| 美女高潮到喷水免费观看| 日本wwww免费看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 成人av一区二区三区在线看| 国产午夜精品久久久久久| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产精品久久久久成人av| 精品国产美女av久久久久小说| 国产精华一区二区三区| 精品久久久精品久久久| 国产一区在线观看成人免费| 欧美日韩成人在线一区二区| 精品一区二区三区av网在线观看| 精品国产亚洲在线| 成年动漫av网址| 最近最新免费中文字幕在线| 黄片播放在线免费| av线在线观看网站| 男女床上黄色一级片免费看| 老汉色∧v一级毛片| 午夜福利一区二区在线看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产高清视频在线播放一区| 久久久久久久午夜电影 | 亚洲精品美女久久av网站| ponron亚洲| 久久久久久久午夜电影 | 久久亚洲真实| 精品国产乱子伦一区二区三区| 精品亚洲成国产av| 亚洲五月天丁香| 黄色a级毛片大全视频| 男女午夜视频在线观看| 久久亚洲真实| 91老司机精品| 午夜免费成人在线视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲精品久久午夜乱码| tube8黄色片| 国产黄色免费在线视频| 亚洲avbb在线观看| 国产一区二区三区视频了| 叶爱在线成人免费视频播放| 色尼玛亚洲综合影院| 国产99白浆流出| 国产免费现黄频在线看| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲精品国产区一区二| 免费在线观看完整版高清| 极品人妻少妇av视频| 下体分泌物呈黄色| 国产精品二区激情视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产免费男女视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 成熟少妇高潮喷水视频| 12—13女人毛片做爰片一| 天堂中文最新版在线下载| 国产成人免费无遮挡视频| 在线观看免费视频网站a站| 人人妻人人澡人人看| 久久国产精品影院| 啦啦啦 在线观看视频| 国产国语露脸激情在线看| 手机成人av网站| 99国产精品免费福利视频| 99热网站在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 黄片小视频在线播放| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久国产精品大桥未久av| 老司机福利观看| 午夜激情av网站| 亚洲,欧美精品.| 精品久久久久久电影网| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲免费av在线视频| 水蜜桃什么品种好| 免费在线观看完整版高清| 精品国产一区二区久久| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 亚洲一区高清亚洲精品| 麻豆乱淫一区二区| 欧美黑人精品巨大| 国产精品久久久久久精品古装| 18禁国产床啪视频网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 69av精品久久久久久| 美女福利国产在线| 宅男免费午夜| 精品欧美一区二区三区在线| 黄色 视频免费看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 午夜免费鲁丝| 少妇被粗大的猛进出69影院| 女人精品久久久久毛片| 亚洲专区中文字幕在线| 黄片大片在线免费观看| 日韩免费高清中文字幕av| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品永久免费网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美人与性动交α欧美软件| 日韩三级视频一区二区三区| 多毛熟女@视频| 国产野战对白在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品综合久久久久久久免费 | 午夜免费鲁丝| 国产精品久久久人人做人人爽| 99久久国产精品久久久| 一二三四在线观看免费中文在| 午夜福利免费观看在线| 国产精品免费大片| 99久久人妻综合| 中文字幕人妻熟女乱码| 久热爱精品视频在线9| 精品免费久久久久久久清纯 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 在线av久久热| 欧美日韩亚洲高清精品| 交换朋友夫妻互换小说| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久香蕉国产精品| 国产精品一区二区在线不卡| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美性长视频在线观看| 天堂√8在线中文| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| www.自偷自拍.com| 一级,二级,三级黄色视频| 成人精品一区二区免费| 亚洲精品美女久久av网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 丁香欧美五月| 在线av久久热| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 69精品国产乱码久久久| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 电影成人av| 欧美国产精品va在线观看不卡| 成在线人永久免费视频| 日日爽夜夜爽网站| 国产不卡av网站在线观看| 大香蕉久久成人网| 91老司机精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 我的亚洲天堂| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产av精品麻豆| 真人做人爱边吃奶动态| videosex国产| 99国产精品一区二区三区| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 丝袜在线中文字幕| av片东京热男人的天堂| av在线播放免费不卡| 91大片在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 精品国产国语对白av| 满18在线观看网站| 亚洲精品在线美女| 国产成人av教育| 国产精品久久久av美女十八| 高清在线国产一区| 国产一区二区三区综合在线观看| av电影中文网址| 欧美在线一区亚洲| 老汉色∧v一级毛片| x7x7x7水蜜桃| 国产高清激情床上av| 国产人伦9x9x在线观看| 成人免费观看视频高清| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产av精品麻豆| 亚洲一区中文字幕在线| 久久性视频一级片| 亚洲中文字幕日韩| 精品福利永久在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产主播在线观看一区二区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲人成电影免费在线| 动漫黄色视频在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 久久香蕉精品热| 国产精品久久视频播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲七黄色美女视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲成人手机| 久久久国产精品麻豆| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品九九99| 真人做人爱边吃奶动态| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 黄色毛片三级朝国网站| 日韩三级视频一区二区三区| 一级毛片精品| 日韩视频一区二区在线观看| 香蕉久久夜色| 欧美日韩乱码在线| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 欧美激情 高清一区二区三区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产精品影院久久| 女警被强在线播放| 国产野战对白在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 国产精品.久久久| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美日韩视频精品一区| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美久久黑人一区二区| 丝袜美腿诱惑在线| 日本黄色视频三级网站网址 | 亚洲专区中文字幕在线| 国产激情久久老熟女| 在线天堂中文资源库| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久久国产成人免费| 天天影视国产精品| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产精品免费视频内射| x7x7x7水蜜桃| 一级a爱片免费观看的视频| 婷婷丁香在线五月| 国产精品亚洲一级av第二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 999久久久精品免费观看国产| 国产黄色免费在线视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 18禁美女被吸乳视频| 99国产精品一区二区三区| 国产av又大| 99re在线观看精品视频| 久久 成人 亚洲| 老鸭窝网址在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 午夜久久久在线观看| 国产精品.久久久| 九色亚洲精品在线播放| 视频区图区小说| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 女人久久www免费人成看片| 国产精品99久久99久久久不卡| 三级毛片av免费| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲午夜理论影院| a在线观看视频网站| 久久久国产欧美日韩av| 怎么达到女性高潮| 精品福利永久在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 搡老乐熟女国产| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 婷婷成人精品国产| 大码成人一级视频| 国产一区二区激情短视频| av免费在线观看网站| 三级毛片av免费| 1024香蕉在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品一区二区三卡| 一区二区三区国产精品乱码| 18在线观看网站| 国产野战对白在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲国产欧美一区二区综合| av中文乱码字幕在线| 制服人妻中文乱码| 日韩欧美免费精品| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品永久免费网站| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一级片'在线观看视频| 日本黄色日本黄色录像| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 色老头精品视频在线观看| 精品国产一区二区久久| 午夜福利,免费看| 国产精品国产高清国产av | 日韩欧美一区视频在线观看| 看黄色毛片网站| 久久性视频一级片| 一a级毛片在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 成年人黄色毛片网站| 午夜福利乱码中文字幕| 国产亚洲精品一区二区www | 国产又爽黄色视频| 热re99久久国产66热| 99riav亚洲国产免费| 啦啦啦免费观看视频1| 午夜日韩欧美国产| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 精品国产国语对白av| 成人黄色视频免费在线看| 国产av一区二区精品久久| 高清欧美精品videossex| 女警被强在线播放| 亚洲av美国av| 色老头精品视频在线观看| 很黄的视频免费| 国产欧美日韩精品亚洲av| 又紧又爽又黄一区二区| 婷婷丁香在线五月|