黃瓜綠斑駁花葉病毒熒光納米顆粒試紙條的研制

曹冬梅等

摘要：以黃瓜綠斑駁花葉病毒為檢測對象，應(yīng)用黃瓜綠斑駁花葉病毒的特異性抗體，以稀土熒光納米顆粒為標(biāo)記物，制備黃瓜綠斑駁花葉病毒熒光納米顆粒試紙條，建立高效、靈敏、準(zhǔn)確檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的熒光免疫技術(shù)體系，旨在研發(fā)一種可用于快速、便捷檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）的檢測方法。

關(guān)鍵詞：黃瓜綠斑駁花葉病毒；熒光納米顆粒；試紙條；免疫層析

中圖分類號： S436.421.1+9文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0152-02

黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是葫蘆科作物上重要的植物檢疫性病毒，主要分布在歐洲、印度和日本等，嚴(yán)重威脅著西瓜、甜瓜、黃瓜等葫蘆科作物的生產(chǎn)，一般減產(chǎn)約15%[1]。2005年遼寧省蓋州市西瓜感染了黃瓜綠斑駁花葉病毒，損失慘重，此后在廣西、遼寧、河北、山東、廣東和北京等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)疫情，已嚴(yán)重威脅西瓜、甜瓜、黃瓜等作物的生產(chǎn)，因此加強該病毒的檢測極為重要?？焖贆z測技術(shù)是有效防止黃瓜綠斑駁花葉病毒疫情擴散的重要保障，而現(xiàn)有檢測該病毒的方法多為酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法，該方法可在短時間內(nèi)檢測大量樣品，但對檢測環(huán)境、人員素質(zhì)及設(shè)備等條件要求較高，且血清價格昂貴，不能滿足現(xiàn)場快速檢測的需要。此外，人們先后研究出多種快速診斷方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR[2]、免疫捕獲RT-PCR（IC-PT-PCR）[3]、實時熒光RT-PCR[4]等，但這些分子生物學(xué)檢測方法均具有費用昂貴、操作繁瑣的缺點，不能滿足一線檢測人員或田間檢測的需求。因此，本研究以黃瓜綠斑駁花葉病毒為檢測對象，應(yīng)用黃瓜綠斑駁花葉病毒的特異性抗體，以稀土熒光納米顆粒為標(biāo)記物，制備黃瓜綠斑駁花葉病毒免疫層析試紙條，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的熒光免疫技術(shù)體系。

1材料與方法

1.1材料

牛血清白蛋白（BSA）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；羊抗鼠IgG購自中晶生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜購自美國Millipore公司，所用試劑均為分析純。熒光納米顆粒購自深圳易瑞生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1黃瓜綠斑駁花葉病毒單克隆抗體的制備參照曹潔等的方法[5]。

1.2.2單克隆抗體的純化將腹水20 000 g離心 30 min，取上清，往所得上清中逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，室溫攪拌30 min，將液體置于4 ℃冰箱中靜置過夜；4 ℃，10 000 g離心30 min，棄上清，用pH值為7.4的PBS重懸沉淀，將所得溶液用Protein A柱進行純化，用PBS（pH值為7.4）濾洗所得產(chǎn)物3次，往透析后的產(chǎn)物中加入海藻糖，使海藻糖的終濃度為5%，100 μL/支分裝待用。

1.2.3抗體與顆粒共價偶聯(lián)取熒光顆粒50 μL，用 50 mmol/L MES（pH值為6.0）洗滌顆粒2次，每次1 mL；用600 μL 50 mmol/L MES（pH值為6.0）重懸顆粒；加入100 mg/mL sulfo-NHS和EDC各200 μL，室溫?fù)u動30 min；離心，棄上清；用1 mL 50 mmol/L MES（pH值6.0）洗滌顆粒1次；用1 mL 50 mmol/L MES（pH值6.0）重懸顆粒；加入適量純化后的黃瓜綠斑駁花葉病毒單克隆抗體，室溫振搖1 h；加入等體積的PBS-BSA（BSA含量2%，pH值7.4），繼續(xù)反應(yīng)1 h；離心，棄上清；用50 mmol/L MES（pH值6.0）洗滌顆粒3次，1 mL/次；用300 μL重懸液[10 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）、10%蔗糖]重懸顆粒，4 ℃保存，備用。

將單抗梯度稀釋后，分別取50、100、150、200、250、300 μg單抗溶液，按上述方法與熒光納米顆粒偶聯(lián)，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測偶聯(lián)后的上清中抗體的濃度并篩選出最佳抗體濃度。

1.2.4試紙條的裝配用點膜儀在結(jié)合墊上噴涂單抗-熒光納米顆粒偶聯(lián)物，在硝酸纖維素膜上按照1 μL/cm的量噴涂1.5 mg/mL 黃瓜綠斑駁花葉病毒單抗和1 mg/mL 羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和質(zhì)控線。依次將硝酸纖維素膜、結(jié)合墊、樣品墊，吸收墊粘貼于PVC襯板上，其中結(jié)合墊、吸收墊均與硝酸纖維素膜部分重疊，分別與硝酸纖維素膜重疊約 2 mm，樣品墊部分重疊于結(jié)合墊上，二者重疊約4 mm；粘貼好后切成4 mm寬的試紙條，將制備好的試紙條置于密封袋中，加干燥劑，密封，4 ℃保存。

1.2.5檢測方法取1 g葉片于潔凈塑料袋中，加入3 mL PBST（1×PBS，0.5%Tween20，pH值7.4），揉搓塑料袋中的葉片，取汁液進行檢測。

往反應(yīng)杯中加入200 μL提取物，插入試紙條，繼續(xù)反應(yīng)5 min，紫外光下肉眼觀察結(jié)果。

1.2.6試紙條特異性檢測采用小西葫蘆花葉病毒（ZYMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、煙草花葉病毒（TMV）、番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV）、南瓜花葉病毒（SqMV）、煙草環(huán)斑病毒（TRSV）、甜瓜壞死斑點病毒（MNSV）和黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）作為特異性檢測的參照，測試方法同上。

1.2.7穩(wěn)定性檢測將試紙條放在37 ℃下7 d，每天檢測陽性樣品，觀察其穩(wěn)定性。

1.2.8與膠體金試紙條靈敏性對比試驗采用40 nm膠體金參考Frens的方法[6]制備膠體金試紙條。用PBST按8、16、32、64、128倍稀釋同一份陽性樣本，分別用膠體金和熒光顆粒試紙條進行檢測。

2結(jié)果與分析

2.1單克隆抗體的效價

間接酶聯(lián)法測定小鼠腹水抗體效價為1 ∶1 000 000。

2.2抗體的最佳濃度

將單抗梯度稀釋后，分別取50、100、150、200、250、300 μg單抗溶液與50 μL的1 mg/mL納米顆粒偶聯(lián)，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測偶聯(lián)后上清中抗體的濃度，取上清中抗體濃度剛好升高的前1個濃度為最佳抗體用量。本試驗確定150 μg與50 μL顆粒共價偶聯(lián)為佳。

2.3熒光納米顆粒試紙條制備的最佳條件

通過對檢測線和質(zhì)控線包被條件等條件進行優(yōu)化，最終確定最佳免疫層析體系：隨著二抗包被濃度的增加，檢測線的亮度也逐漸增加，在達到1.5 mg/mL后亮度不再明顯增加，因此確定檢測線的最佳包被條件為1.5 mg/mL的二抗。圖1為優(yōu)化后的檢測線；隨著二抗包被濃度的增加，質(zhì)控線的亮度也逐漸增加，在達到2.5mg/mL后亮度不再明顯增加，因此確定質(zhì)控線的最佳包被條件為2.5 mg/mL的二抗。圖2為優(yōu)化后的質(zhì)控線。

2.4特異性

用制備的熒光納米顆粒試紙條檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆花葉病毒等9種植物病毒的陽性樣本，除黃瓜綠斑駁花葉病毒外，其余均無交叉反應(yīng)。典型試驗結(jié)果如圖3所示。

2.5穩(wěn)定性試驗

將試紙條放在37 ℃下7 d，檢測不同濃度的陽性樣品，觀察其穩(wěn)定性。試驗結(jié)果證實，試紙條在37 ℃下放置7 d，靈敏性沒有明顯降低，表明其穩(wěn)定性較好。

2.6靈敏度對比試驗結(jié)果

2.6.1膠體金試紙條的制備隨著單抗-膠體金偶聯(lián)物添加量的增加，檢測線和質(zhì)控線的信號越來越強，添加量在0～6 μL之間時，信號強度明顯增強，6 μL以上信號強度依然會增強，但是不再明顯?？紤]到非特異反應(yīng)等因素，將膠體金的用量定在6 μL。膠體金試紙條典型反應(yīng)結(jié)果如圖4所示。

2.6.2靈敏度的對比用PBST倍比稀釋同一份陽性樣本，分別用膠體金和免疫層析方法進行檢測。其中，熒光試紙條用肉眼方式判讀，判讀結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，熒光納米顆粒試紙條的靈敏性高于膠體金試紙條。

表1不同方法靈敏性比較

試紙條類型放大不同倍數(shù)后的靈敏性結(jié)果4倍8倍16倍32倍64倍膠體金試紙條++---熒光納米顆粒試++++-紙條（肉眼）注：+表示陽性，-表示陰性。

3結(jié)論與討論

本研究研制的熒光納米顆粒免疫層析試紙條可以在 10 min 之內(nèi)得出檢測結(jié)果，大大快于傳統(tǒng)的PCR（1～2 h）、ELISA（1～2 h）等檢測方法，提高了檢測效率；該方法既適合單份樣品的檢測，也適合大批量樣品的快速檢測；該方法對操作者的能力要求不高，操作者只須要經(jīng)過簡單培訓(xùn)就可以獨立完成檢測工作；該方法不需要大型精密的試驗儀器，只需要1臺紫外燈就可以了，非常容易開展。與近幾年發(fā)展較為迅速的膠體金試紙條相比，熒光納米顆粒中含有多個熒光顆粒，具有良好的發(fā)光性能，熒光信號也遠遠強于傳統(tǒng)的標(biāo)記物質(zhì)。

黃瓜綠斑駁花葉病毒熒光納米顆粒檢測試紙條的研制成功，為黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測提供了一個極好的檢測方法，便于野外檢測的開展，為植物保護工作提供了一把利器，也為其他微生物、病毒等快速檢測方法的建立打下了堅實的基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Hollings M，Komuro Y，Tochihara H.Cucumber green mottle mosaic virus[J]. Descriptions of Plant Virus，1975，154：4.

[2]李紅霞，白靜，陳紅運，等. 南瓜果實中黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-PCR檢測及cp基因序列分析[J]. 植物檢疫，2007，21（5）：268-270.

[3]尚海麗，周雪平，吳建祥. 免疫斑點法和免疫捕獲RT-PCR檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2010，36（5）：485-490.

[4]鄧叢良，黃峰，呂玉峰，等. 實時熒光RT-PCR方法檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒[J]. 植物檢疫，2009，23（4）：29-31.

[5]曹潔，楊翠云，潘衛(wèi)，等. 番茄環(huán)斑病毒單克隆抗體的制備[J]. 微生物學(xué)雜志，2007（3）：35-37.

[6]Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J]. Nature Physical Science，1973，241：20-22.