蝴蝶蘭高效組培快繁及溫室移栽技術(shù)

張偉等

摘要：為優(yōu)化蝴蝶蘭組培快繁及小苗溫室移栽技術(shù)，研究以蝴蝶蘭花梗段側(cè)芽為外植體的高效快繁技術(shù)。在MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 g/L 花寶1號(hào)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出營(yíng)養(yǎng)芽，2個(gè)月誘導(dǎo)率達(dá)90%；而用VW+3.0 mg/L 6-BA+1.0 g/L花寶1號(hào)+10%香蕉泥培養(yǎng)基誘導(dǎo)出花葶，2～3個(gè)月誘導(dǎo)率達(dá)80%。利用誘導(dǎo)的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)芽、花葶節(jié)段切片在MS+5.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+10%椰子汁+30 mg/L 檸檬酸培養(yǎng)基中，2個(gè)月誘導(dǎo)出叢生芽，再利用小塊叢生芽分化增殖叢生芽，1.5個(gè)月增殖率可達(dá)6倍。當(dāng)芽長(zhǎng)超過(guò)1.5 cm時(shí)，在1/2MS+0.1 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+0.2%活性炭培養(yǎng)基中壯苗生根，2個(gè)月后小苗長(zhǎng)出3條以上的根，根長(zhǎng)超過(guò)1.5 cm，于智能溫室煉苗3～4周后移栽。應(yīng)用該小苗移栽試驗(yàn)方法，經(jīng)統(tǒng)計(jì)3個(gè)月后成活率可達(dá)95%。

關(guān)鍵詞：蝴蝶蘭；花梗側(cè)芽；營(yíng)養(yǎng)芽；花葶；叢生芽

中圖分類(lèi)號(hào)： S682.31文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0083-04

收稿日期：2014-10-12

基金項(xiàng)目：河南省平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院自選項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：張偉（1977—），男，陜西漢中人，助理研究員，主要從事現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)組培的研究。E-mail：zhw9380@163.com。蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）別稱(chēng)蝶蘭，被譽(yù)為“洋蘭皇后”，是熱帶蘭中的珍品[1]。蝴蝶蘭花朵碩大、朵數(shù)多、開(kāi)花期長(zhǎng)、花色艷麗、色澤豐富，可盆栽放置于書(shū)房、客廳、臥室等處，典雅大方并給人以美的享受，花朵可作新娘的捧花、襟花、胸花，同時(shí)是切花的好材料[2]。蝴蝶蘭是蘭科植物中栽培最廣泛、普及程度最高的品種之一，深受各國(guó)人民喜愛(ài)。蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，植株極少發(fā)育側(cè)枝，且種子極難萌發(fā)，實(shí)生苗變異嚴(yán)重，不適于大規(guī)模商業(yè)種植。應(yīng)用植物組培快繁技術(shù)可在短期內(nèi)生產(chǎn)大量整齊一致的種苗，因此大規(guī)模商業(yè)種植一般采用組織培養(yǎng)快繁的方法[3]。關(guān)于蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的報(bào)道較多[4-7]，多以蝴蝶蘭的葉片[8]、莖尖[8-9]、花梗腋芽[8-11]、種子[12]、根尖[8]、花梗節(jié)間[13]為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，而對(duì)以花梗為外植體的研究常采用未開(kāi)花、即將開(kāi)花的花梗，這對(duì)母株傷害較大，將影響其觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值[14]。本試驗(yàn)于蝴蝶蘭開(kāi)花3個(gè)月后（農(nóng)歷正月之后）采摘花梗，盡量減少對(duì)其觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值的影響。以蝴蝶蘭叢生芽途徑開(kāi)展組培快繁，具有誘導(dǎo)率高、誘導(dǎo)時(shí)間短、叢生芽增殖率高（可達(dá)6倍）、技術(shù)難度低、遺傳性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可避免生產(chǎn)中發(fā)生大量變異，對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義[15]。在前人研究的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)出一套成熟、先進(jìn)的蝴蝶蘭組培快繁及溫室移栽技術(shù)，以期為相關(guān)生產(chǎn)及研究提供參考。

1材料與方法

1.1供試蝴蝶蘭

供試蝴蝶蘭采自河南省平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室智能溫室，于2013年3月至5月初采取，品種為寶龍皇后。

1.2外植體

供試外植體為蝴蝶蘭花梗節(jié)間側(cè)芽，以及花梗段側(cè)芽誘導(dǎo)出的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)芽和花葶，以營(yíng)養(yǎng)芽和花葶作為組培快繁試驗(yàn)材料。

1.3消毒過(guò)程

剪取蝴蝶蘭母株近基部花梗，將花梗切割為2～3 cm長(zhǎng)的切段，每個(gè)花梗切段帶1個(gè)節(jié)間側(cè)芽，每節(jié)距側(cè)芽上部1 cm、下部2 cm。消毒時(shí)先用洗潔精與自來(lái)水清洗30 min，于超凈工作臺(tái)中用75%乙醇浸泡30 s，再用0.1%HgCl2溶液浸泡13 min，倒掉HgCl2并用無(wú)菌水沖洗4～6遍。消毒后切去花梗段兩端少許部分，按照正常生長(zhǎng)方向?qū)⒒ü９?jié)段插入供試培養(yǎng)基。

1.4供試培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS、VW、1/2 MS。采用不同質(zhì)量濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)與增殖，并進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為：溫度（25±2） ℃、光照度2 000～3 000 lx、光照時(shí)間12 h/d。篩選出5種主要培養(yǎng)基（20.0 g蔗糖、6.0 g瓊脂粉、pH值5.6～5.8）。誘導(dǎo)培養(yǎng)基（A）：MS+30 mg/L 6-BA +1.0 g/L花寶1號(hào)+30 mg/L檸檬酸；誘導(dǎo)培養(yǎng)基（B）：VW+3.0 mg/L 6-BA+1.0 g/L花寶1號(hào)+100 g/L香蕉泥 +30 mg/L檸檬酸+1.0 g/L活性炭；分化培養(yǎng)基（C）：MS+5.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+10%椰子汁+30 mg/L 檸檬酸；壯苗生根培養(yǎng)基（D）：1/2MS+0.1 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭。

1.5小苗煉苗和移栽

將準(zhǔn)備移栽的試管苗不揭蓋連瓶置于溫室3～4周煉苗。移栽時(shí)用水苔作栽培基質(zhì)，所有操作工具和水苔均消毒滅菌。移栽前先將水苔用清水浸泡12 h，甩干后方可使用。移栽時(shí)打開(kāi)封口膜，小心夾出小苗，洗凈根部培養(yǎng)基，于0.2%高錳酸鉀溶液中浸泡幾分鐘后撈出，用甩干的水苔包住小苗根部，放入穴盤(pán)中；將移栽好的小苗穴盤(pán)放置于白天溫度22～30 ℃、夜晚溫度18～25 ℃、相對(duì)濕度65%～85%、光照度低于10 000 lx、潔凈通風(fēng)的環(huán)境中。移栽結(jié)束后用2 000倍多菌靈殺菌劑對(duì)小苗統(tǒng)一噴灑，2周1次，連續(xù)噴灑3次；第1周保持每天上午、下午2次噴霧增濕，第2周后澆水并且每1～2周施用1次均衡肥料，于3個(gè)月時(shí)統(tǒng)計(jì)。

2結(jié)果與分析

2.1技術(shù)路線

試驗(yàn)流程見(jiàn)圖1、圖2。

2.2花梗芽的誘導(dǎo)

利用花梗段側(cè)芽在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)芽和花葶，培養(yǎng)2～3個(gè)月即可獲得；培養(yǎng)過(guò)程中若培養(yǎng)基消耗過(guò)多或褐化嚴(yán)重則轉(zhuǎn)接1次，培養(yǎng)基不變，連續(xù)3個(gè)月進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表1）。由表1可見(jiàn)，MS、VW 2種基礎(chǔ)培養(yǎng)基均可作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，但添加不同質(zhì)量濃度的激素、添加物使2種基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出不同的植物組織；因此，不能表明某一培養(yǎng)基更適合作為誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。使用相同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同時(shí)使用 6-BA、NAA時(shí)誘導(dǎo)率比單獨(dú)使用6-BA時(shí)低，且萌動(dòng)出芽時(shí)間長(zhǎng)。當(dāng)6-BA的濃度達(dá)到5.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率略下降且生長(zhǎng)偏弱，表明此濃度或更高濃度并不適于蝴蝶蘭花梗側(cè)芽的誘導(dǎo)；單獨(dú)使用3.0 mg/L濃度的6-BA時(shí)，蝴蝶蘭花梗側(cè)芽誘導(dǎo)率較好。本試驗(yàn)中A培養(yǎng)基（表1中2號(hào)培養(yǎng)基）外植體誘導(dǎo)表現(xiàn)突出，出芽最早且出芽率達(dá)到90 %，萌動(dòng)僅需 12 d，形成營(yíng)養(yǎng)芽需要2個(gè)月左右；VW培養(yǎng)基加入100 g/L香蕉泥、1.0 g/L花寶1號(hào)后，大多數(shù)誘導(dǎo)出花芽，其中B培養(yǎng)基（表1中5號(hào)培養(yǎng)基）的出芽率達(dá)到80 %，形成可誘導(dǎo)分化叢生芽的花葶需2～3個(gè)月。表1不同培養(yǎng)基對(duì)花梗側(cè)芽誘導(dǎo)的結(jié)果

序號(hào)基礎(chǔ)培養(yǎng)基激素濃度（mg/L）6-BANAA外植體數(shù)

（個(gè)）萌動(dòng)出芽

時(shí)間（d）誘導(dǎo)率

（%）備注1MS1.00.1201835大部分為營(yíng)養(yǎng)芽，出芽緩慢2MS3.00.0201290絕大部分為營(yíng)養(yǎng)芽，生長(zhǎng)健壯3MS5.0 0.5 201475大部分為營(yíng)養(yǎng)芽，生長(zhǎng)偏弱4VW1.00.3202030部分為花芽，生長(zhǎng)較弱5VW3.00.0201580部分為花芽，出芽較快，生長(zhǎng)健壯6VW5.00.0201770部分為花芽，生長(zhǎng)偏弱注：所有培養(yǎng)基均添加1.0 g/L花寶1號(hào)、30 mg/L檸檬酸；VW誘導(dǎo)培養(yǎng)基均添加100 g/L香蕉泥。

2.3叢生芽的分化和增殖

將誘導(dǎo)出的營(yíng)養(yǎng)芽從花梗節(jié)段基部切下，在各培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽分化增殖，于3個(gè)月時(shí)統(tǒng)計(jì)（表2）。由表2可見(jiàn)，營(yíng)養(yǎng)芽分化增殖時(shí)MS培養(yǎng)基優(yōu)于VW培養(yǎng)基。NAA濃度為0.5 mg/L、6-BA濃度為1.0～7.0 mg/L時(shí)營(yíng)養(yǎng)芽分化的叢生芽增殖率逐漸提高；6-BA濃度為5.0 mg/L時(shí)誘導(dǎo)分化的平均出芽數(shù)較多，且生長(zhǎng)健壯；6-BA濃度為7.0 mg/L時(shí)誘導(dǎo)分化的平均出芽數(shù)最多，但有部分畸形?？梢?jiàn)，6-BA濃度過(guò)高并不能達(dá)到良好效果，只有6-BA、NAA在適宜濃度下配合使用，才能取得最好的營(yíng)養(yǎng)芽分化增殖效果。C培養(yǎng)基（表2中Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基）最適于營(yíng)養(yǎng)芽分化再增殖，其分化出的芽數(shù)多、生長(zhǎng)快、健壯、無(wú)畸形，且芽的生長(zhǎng)均能成為小苗，最早1.5個(gè)月可見(jiàn)芽，但分化出增殖叢生芽需2個(gè)月左右；分化出叢生芽后采用多芽增殖并仍使用C培養(yǎng)基，可極大縮短增殖周期，僅需1.5個(gè)月。表2不同質(zhì)量濃度6-BA培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)出芽數(shù)（個(gè)）生長(zhǎng)情況ⅠMS 1.00.530812.7增殖少，芽生長(zhǎng)緩慢，長(zhǎng)勢(shì)不好ⅡMS5.00.5302167.2增殖多，芽生長(zhǎng)快，健壯ⅢMS7.00.5302357.8增殖多，芽生長(zhǎng)快，有畸形ⅣVW1.00.530571.9增殖少，芽生長(zhǎng)緩慢，長(zhǎng)勢(shì)一般ⅤVW5.00.5301755.8增殖多，芽生長(zhǎng)快，健壯ⅥVW7.00.5302016.7增殖多，芽生長(zhǎng)快，有畸形注：培養(yǎng)基中均添加10%椰子汁、30 mg/L檸檬酸。

將花梗段側(cè)芽誘導(dǎo)出的花葶節(jié)部橫向切割為0.5～0.8 cm 的切片，按生長(zhǎng)方向接入C培養(yǎng)基，約2個(gè)月可見(jiàn)小芽叢，分化增殖情況與營(yíng)養(yǎng)芽增殖情況相似。

2.4小苗壯苗生根

當(dāng)芽生長(zhǎng)至1.5 cm時(shí)將其切下，轉(zhuǎn)入D培養(yǎng)基中壯苗生根，約30 d可見(jiàn)生根，50 d長(zhǎng)出3條以上根，2個(gè)月根長(zhǎng)超過(guò)1.5 cm，則可進(jìn)行煉苗。

2.5小苗移栽及栽培管理方法

小苗煉苗時(shí)，試管瓶不揭蓋煉苗3～4周，移栽時(shí)挑選煉過(guò)苗的蝴蝶蘭組培苗，要求其無(wú)污染、葉數(shù)3～5張、葉寬1.5～2.5 cm、葉子健壯、葉色翠綠、根數(shù)3條以上、根長(zhǎng)0.8～3.0 cm、根系粗壯有活力、單軸莖較明顯。小苗移栽后1周內(nèi)不澆水，盡量以噴霧方式供給水分，以便小苗及早生根，同時(shí)可避免幼嫩小苗出現(xiàn)軟腐病害，使小苗根部充分生長(zhǎng)，但要保持較高的濕度；第2周即可澆水，當(dāng)小苗水草表面干燥，且觀察透明穴盤(pán)內(nèi)下部無(wú)水滴水霧，即可澆透水；第3周后可施用液肥，施肥間隔期為1周1次，開(kāi)始時(shí)采用較低肥料濃度，隨后逐漸提高，但不可過(guò)高，小苗前期常施用N ∶P2O5 ∶K2O為 20% ∶20% ∶20% 的肥料，濃度為3 000～4 000倍液，施肥時(shí)應(yīng)薄肥勤施。當(dāng)小苗長(zhǎng)出新葉、新根即為成活，3個(gè)月時(shí)的成活率可達(dá)95%以上。

3結(jié)論與討論

蝴蝶蘭一般通過(guò)有性繁殖、無(wú)性繁殖2種方式進(jìn)行繁殖，有性繁殖多為雜交或自交苗，遺傳性狀不穩(wěn)定，不能表現(xiàn)出優(yōu)良的母本性狀，且花色、花期不易控制，因此蝴蝶蘭快繁通常采用無(wú)性繁殖[16]。蝴蝶蘭植株極少發(fā)育側(cè)枝，比其他種類(lèi)蘭花更難以進(jìn)行常規(guī)無(wú)性繁殖，無(wú)法大量生產(chǎn)[17]，組織培養(yǎng)是蝴蝶蘭快速繁殖的主要手段[18-20]。在組織培養(yǎng)中，可通過(guò)誘導(dǎo)原球莖途徑進(jìn)行植株再生[21]，也可利用叢生芽途徑快速繁殖，后者是從芽到芽的增殖，無(wú)需通過(guò)誘導(dǎo)原球莖分化不定芽來(lái)穩(wěn)定遺傳母本的特征特性，從而可降低后代發(fā)生變異的概率[22]。本試驗(yàn)采用從芽到芽的增殖途徑，利用花梗芽誘導(dǎo)出的營(yíng)養(yǎng)芽、花葶組織來(lái)誘導(dǎo)分化叢生芽，減少變異且分化時(shí)間短，大幅縮短了繁殖周期。

試驗(yàn)過(guò)程中第1次分化誘導(dǎo)使花梗段側(cè)芽充分利用，不破壞母株并盡可能保存母體，達(dá)到商業(yè)種植的高效利用；叢生芽分化出來(lái)后的每次分化增殖過(guò)程均比第1次分化誘導(dǎo)過(guò)程縮短一半時(shí)間，1.5個(gè)月即可增殖6倍左右，其他資料中尚未見(jiàn)如此高的增殖倍數(shù)[16]。

由培養(yǎng)基的成分及外植體的培養(yǎng)過(guò)程可知，6-BA是誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)的主要因子，這與譚文澄等的觀點(diǎn)[19]一致。向VW培養(yǎng)基中添加香蕉泥、花寶1號(hào)可能是花梗側(cè)芽誘導(dǎo)成花葶的主要因素，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。檸檬酸可有效抑制酶促褐變，通過(guò)降低褐變死亡率以提高誘導(dǎo)效率[23]，整個(gè)試驗(yàn)中向培養(yǎng)基添加30 mg/L檸檬酸效果顯著，能夠減少褐化。試驗(yàn)首次將營(yíng)養(yǎng)芽、花葶節(jié)切片于相同培養(yǎng)基、相同環(huán)境下誘導(dǎo)分化出叢生芽；營(yíng)養(yǎng)芽誘導(dǎo)分化叢生芽的關(guān)鍵點(diǎn)為莖基部，將營(yíng)養(yǎng)芽底部和花梗節(jié)段接觸的部分切割后培養(yǎng)才易誘導(dǎo)出叢生芽，叢生芽一般從營(yíng)養(yǎng)芽基部的短縮莖分化出來(lái)，應(yīng)注意保存該部位；將試管花葶節(jié)部上下切割為0.5～0.8 cm 的切片，注意保留節(jié)部，按自然生長(zhǎng)方向放入培養(yǎng)基中才能誘導(dǎo)分化出大量節(jié)間叢生芽，沒(méi)有節(jié)部的花葶組織一般無(wú)法分化出叢生芽。分化增殖培養(yǎng)基中的椰子汁同樣是增殖的關(guān)鍵因素之一，從生產(chǎn)角度考慮，椰子汁含量為10%時(shí)增殖倍數(shù)、增殖時(shí)間、經(jīng)濟(jì)效益均為最佳。進(jìn)行壯苗生根時(shí)，一般培養(yǎng)基只使用NAA或IBA進(jìn)行生根，而本試驗(yàn)添加少量6-BA可使小苗健壯生長(zhǎng)并生根，提前進(jìn)入煉苗階段。小苗移栽時(shí)，用02%高錳酸鉀溶液浸泡小苗幾分鐘，既能殺菌消毒，又可使小苗傷口快速氧化愈合，從而提高成活率，此結(jié)論經(jīng)實(shí)踐總結(jié)得出。組培苗于春季移栽，若栽培管理得當(dāng)?shù)?年春節(jié)即可開(kāi)花。

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