天山雪蓮SikMT2基因的克隆及表達(dá)分析

陳泉等

摘要：從天山雪蓮葉片cDNA文庫(kù)中分析得到一個(gè)類(lèi)金屬硫蛋白基因序列，命名為SikMT2。生物信息學(xué)分析表明，該基因包含一個(gè)完整開(kāi)放閱讀框（225 bp），編碼75個(gè)氨基酸。SikMT2分子量為7.47 ku，理論等電點(diǎn)是4.44，是一個(gè)不具有信號(hào)肽的親水性蛋白。氨基酸多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SikMT2序列在N端和C端保守性較高，具有MT2的典型特征；21個(gè)物種間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，天山雪蓮與蒲公英進(jìn)化關(guān)系最近。

關(guān)鍵詞：天山雪蓮；SikMT2基因；信息學(xué)分析；實(shí)時(shí)定量PCR

中圖分類(lèi)號(hào)： Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0046-04

收稿日期：2014-09-10

金屬硫蛋白（metallothioneins，MTs）超家族是一類(lèi)廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物以及微生物體內(nèi)的一種包含了半胱氨酸豐富區(qū)域小分子蛋白[1]。動(dòng)物體內(nèi)的MTs于1957 年首次從蓄積鎘的馬腎中被發(fā)現(xiàn)[2]，植物MTs最早從1977年從大豆根中被發(fā)現(xiàn)[3]。近些年來(lái)研究表明，MTs在植物中普遍存在，參與了許多生理過(guò)程，如生長(zhǎng)發(fā)育、胚胎發(fā)生、小孢子發(fā)生、衰老、果實(shí)的發(fā)育、成熟和抗逆等[4]。同時(shí)對(duì)植物MTs的研究在基因的組織、器官特異性、表達(dá)特征、基因組結(jié)構(gòu)和染色體定位方面得到快速的發(fā)展[5-7]。不僅如此，有報(bào)道稱(chēng)植物MTs不僅在植物解除重金屬離子的毒害[8]、調(diào)節(jié)金屬離子特定運(yùn)輸方面有重要作用[9]，還參與了細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除[10]和植物抗氧化脅迫[11]。但現(xiàn)階段我們對(duì)植物MTs功能的研究還僅處于起步狀態(tài)，MTs參與了植物的許多生理代謝過(guò)程而且分布十分廣泛，因此對(duì)植物MTs的研究將成為一個(gè)具有重要意義的方向。

天山雪蓮（Saussurea involucrata Kar. et Kir）為菊科鳳毛菊屬，別稱(chēng)新疆雪蓮、雪荷花、雪蓮花等[12]。天山雪蓮主要生長(zhǎng)在新疆天山海拔2 400～4 100 m的高山草甸、高山冰磧石、懸崖峭壁石縫等處，最高月平均溫度3～5 ℃，最低月平均溫-19～-21 ℃，為典型的耐極端低溫的多年生高山植物[13]。天山上常年伴隨著強(qiáng)烈的紫外線照射、極大的晝夜溫差、低溫等惡劣環(huán)境，但是天山雪蓮產(chǎn)生了適應(yīng)極端環(huán)境條件的獨(dú)特的生存機(jī)制[14]，在如此惡劣的環(huán)境下依舊能旺盛生長(zhǎng)并且開(kāi)花[15]。因此，天山雪蓮參與此類(lèi)非生物脅迫的基因值得深入研究。

迄今為止，研究人員已經(jīng)從擬南芥、水稻、蘋(píng)果、西瓜、檉柳、小金海棠等多種植物[16-20]中分離出許多MTs基因。但有關(guān)天山雪蓮MT基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以天山雪蓮為試驗(yàn)材料，克隆得到1個(gè)MT基因，并對(duì)其序列進(jìn)行分析，旨在為研究天山雪蓮的抗逆性生理特征奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

天山雪蓮試管苗由石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自艾德萊生物科技有限公司；M-MLV試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；凝膠電泳回收試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；克隆載體pGM19-T購(gòu)自TaKaRa公司；SYBR GreenⅠMaster Mix購(gòu)自Roche公司。

1.2方法

1.2.1天山雪蓮SikMT2基因的克隆隨機(jī)挑取10個(gè)已構(gòu)建的天山雪蓮葉片組織的cDNA文庫(kù)的單克隆，使用通用引物進(jìn)行PCR鑒定，并對(duì)鑒定為陽(yáng)性的菌株進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)BLAST分析得到的cDNA片段，獲得SikMT2基因序列，利用Primer5.0設(shè)計(jì)SikMT2基因的PCR引物SikMT2-F、SikMT2-R、GAPDH-qRTF和GAPDH-qRTR（表1）。天山雪蓮總RNA的提取采用植物總RNA提取試劑盒；cDNA第一鏈的合成按照M-MLV試劑盒操作步驟進(jìn)行，產(chǎn)物作為RT-PCR模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收連接至載體pGM19-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選陽(yáng)性克隆送至北京六合華大基因完成測(cè)序。

1.2.2天山雪蓮SikMT2基因的序列分析對(duì)獲得的SikMT2基順測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN軟件進(jìn)行分析，確定開(kāi)放閱讀框及相應(yīng)的氨基酸序列。運(yùn)用Conserved Domains（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白的保守區(qū)；用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）和ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析；運(yùn)用Motif Scan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)基序預(yù)測(cè)分析；運(yùn)用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)；運(yùn)用SignalP 3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)；運(yùn)用生物信息學(xué)軟件Jpred3（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/index.html）對(duì)SikMT2蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；運(yùn)用NCBI網(wǎng)站的BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）工具進(jìn)行氨基酸對(duì)比分析；運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)其他物種的同源氨基酸進(jìn)行多重比對(duì)；運(yùn)用Clustalx1.83和MEGA5.2軟件構(gòu)建天山雪蓮SikMT2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3天山雪蓮SikMT2基因的實(shí)時(shí)定量PCR（real time-PCR）分析將用于低溫脅迫的天山雪蓮試管苗移入4 ℃光照培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫處理；將用于鹽脅迫的天山雪蓮試管苗轉(zhuǎn)入含有200 mmol/L的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行處理；將用于干旱脅迫的天山雪蓮試管苗放入含有10%聚乙二醇（polyethyleneglyeol，PEG）的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行處理。分別取處理0（CK）、2、4、8、12、24、36 h的天山雪蓮葉片樣品，液氮速凍，-70 ℃保存?zhèn)溆谩７謩e提取對(duì)照和不同時(shí)間處理的樣品RNA，反轉(zhuǎn)錄以cDNA為模版，對(duì)SikMT2基因在低溫和氧化脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析。按照Roche公司SYBRG GreenⅠMaster Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以天山雪蓮看家基因GAPDHH作為內(nèi)參基因（表l），利用Applied Biosystems 7500 Real time PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCT法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，取平均值。