人線粒體DNA基因表達(dá)譜芯片的制備及鑒定*

孫恒文，胡義德，曾子君，潘燚，方良毅，譚佩欣，曾向偉

(1.廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)腫瘤中心放療科，廣州 510080； 2.第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院全軍腫瘤中心，重慶 400037； 3.廣東醫(yī)學(xué)院附屬彭湃紀(jì)念醫(yī)院腫瘤科，廣東 海豐 516400)

1 引 言

基因芯片技術(shù)以其高通量、集約化的特點(diǎn)在分子生物學(xué)迅速發(fā)展的今天應(yīng)用廣泛[1-3]。其實(shí)質(zhì)為Southern技術(shù)的反向應(yīng)用，既把探針固定在載體上，使基因樣本與探針在載體表面雜交。按功能可分為表達(dá)譜芯片[4]、測序芯片[5-6]、甲基化芯片[7]等。表達(dá)譜芯片是目前應(yīng)用最廣泛的基因芯片，是將少則幾十個(gè)、多則成千上萬個(gè)特異的探針固定于一塊載體上，可用以檢測整個(gè)基因組范圍內(nèi)的眾多基因在mRNA水平的變化。表達(dá)譜芯片可以分析2組或2組以上不同來源的mRNA轉(zhuǎn)錄豐度的差異，通過計(jì)算信號的比值和統(tǒng)計(jì)分析來獲取差異表達(dá)基因的信息。它不僅能為癌癥發(fā)生機(jī)制的研究提供強(qiáng)有力的工具，也能為癌癥的診斷治療提供新的依據(jù)。

目前表達(dá)譜芯片逐漸趨向于專業(yè)化，即專注于細(xì)胞功能的某一領(lǐng)域或某一種腫瘤相關(guān)基因[8-9]。線粒體是細(xì)胞能量代謝的中心，能量代謝的異常是腫瘤細(xì)胞的重要特征。因此，研究癌細(xì)胞mtDNA基因的整體表達(dá)變化具有重要生物學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)研發(fā)的線粒體基因芯片將專注于mtDNA編碼基因及凋亡相關(guān)基因。本研究通過設(shè)計(jì)、優(yōu)化、合成寡核苷酸探針，點(diǎn)片成功后，對樣片進(jìn)行熒光洗脫等處理，并采用兩個(gè)細(xì)胞系來源的cDNA文庫進(jìn)行雜交，獲得了清晰的微陣列圖像，通過數(shù)據(jù)分析，能快速比較出兩個(gè)cDNA文庫中目標(biāo)基因的表達(dá)差異。第一批點(diǎn)制此表達(dá)譜芯片20張，為進(jìn)一步用于不同cDNA文庫及組織樣本中目標(biāo)基因的差異表達(dá)研究奠定了物質(zhì)及技術(shù)基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1cDNA文庫 人宮頸癌上皮Hela細(xì)胞cDNA文庫和人腎小管上皮Hc1細(xì)胞cDNA文庫由北京博奧芯片公司提供。

2.1.2主要儀器 美國 Genomic Solution公司Genemachines 芯片點(diǎn)樣儀，Packard Bioscience公司Scanarry Express 雙通道激光掃描儀，Axon Instruments公司GenePix Pro 4.0 圖像分析軟件，Eppendor公司核酸真空濃縮儀。

2.1.3試劑與材料 QiAquick 核酸純化試劑盒購自Qiagen公司，Cy3、Cy5熒光染料、dNTP購自Amersham Pharmacia Biotech公司。Radom primer, 10×Klenow buffer, 5×first strand buffer, 0.1M DTT來自Invitrogen公司, Rnase Inhibitor來自Promege公司。氨基硅烷處理的玻璃基片，尺寸為75 mm×25 mm×1 mm。

2.2 方法

2.2.1芯片靶基因的選取及其特異寡核苷酸探針的設(shè)計(jì) 從Genebank及文獻(xiàn)中查得人mtDNA劍橋序列，以此為模板，設(shè)計(jì)mtDNA編碼的13種多肽、2種rRNA、9種tRNA及5種核調(diào)亡相關(guān)基因的探針序列，共包含目標(biāo)基因29個(gè)(見表1)。

2.2.2寡核苷酸探針合成 設(shè)計(jì)的探針序列每個(gè)長約69 mer，共29個(gè)探針序列送交上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，每個(gè)探針合成2OD。

2.2.3芯片的制備 用美國 Genomic Solution公司的Genemachines 芯片點(diǎn)樣儀按照預(yù)先設(shè)計(jì)矩陣，將探針混合液點(diǎn)至氨基硅烷修飾的玻璃基片上。樣點(diǎn)的直徑150 μm，間距25 μm。雜交區(qū)域包括陽性內(nèi)參照、陰性內(nèi)參照Negative、空白對照、外標(biāo)擬南芥植物基因、芯片洗脫檢測點(diǎn)熒光素Hex和靶基因在內(nèi)，每個(gè)探針作3個(gè)重復(fù)點(diǎn)，每個(gè)雜交區(qū)域包含132個(gè)樣點(diǎn)。

2.2.4細(xì)胞系cDNA文庫的熒光標(biāo)記 所選細(xì)胞系為Hc1和Hela細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)前將這兩個(gè)細(xì)胞系總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA文庫。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用核酸濃縮儀60℃濃縮至14 μl。各加入radom primer 4 μl用PCR儀95℃變性3 min，冰浴5 min。加入10×Klenow buffer 2.5 μl，dNTP 2.5 μl，Kelnow 1.2 μl，Hc1體系中加入Cy3 1 μl，Hela中加入Cy5 1 μl，分別進(jìn)行熒光標(biāo)記。

2.2.5芯片雜交前預(yù)處理 經(jīng)過水合、膠連后，將芯片浸入0.5%SDS中，在脫色搖床上以50 rpm脫色8 min。再將芯片置入雙蒸水中，在脫色搖床上以50 rpm脫色8 min。最后放入無水乙醇中，在脫色搖床上以50 rpm脫色3 min。將清洗后的芯片放入玻片離心機(jī)中低速離心。芯片樣點(diǎn)中的Cy3熒光即被洗脫干凈。

2.2.6芯片的雜交 用3.6 μl滅菌去離子水、3 μl甲酰胺溶解熒光標(biāo)記的cDNA，短暫離心。將溶解液轉(zhuǎn)移到另一管熒光標(biāo)記的cDNA中溶解，將兩種用不同熒光素標(biāo)記的cDNA混合，短暫離心。然后轉(zhuǎn)移到0.2 ml Ependorf管中，加入20×SSC 1.8 μl，1%SDS 2.4 μl, 50×Denhart’s 1.2 μl，混勻后離心。在PCR儀中95℃ 變性10 min，冰浴3 min。蓋玻片的小孔用微量吸頭緩慢注入12 μl的雜交液，雜交液會(huì)憑借液體表面張力在蓋玻片下面的凸面和芯片之間形成一道液膜?？焖侔巡Ｆ湃腚s交盒內(nèi)，放入42℃水浴中，雜交5 h。cDNAHela標(biāo)記Cy3紅色熒光，cDNAHc1標(biāo)記Cy5綠色熒光，按某一基因的轉(zhuǎn)錄水平差異，掃描儀可檢測單個(gè)熒光的信號值，計(jì)算出兩種信號的比值也既兩種cDNA樣本同一基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平。對兩熒光圖進(jìn)行融合，既得到偽色圖。

2.2.7芯片雜交后的洗脫 雜交結(jié)束后，快速將蓋玻片在洗液Ⅰ中去掉，將芯片轉(zhuǎn)移到清洗盒中，放在水平搖床上緩慢清洗。清洗步驟如下：洗液I 2×SSC，0.2%SDS 42℃ 4 min,洗液II 0.2×SSC 42℃ 4 min。芯片清洗后，放在50 ml錐形離心管中低速離心，除去玻片表面殘存的液體，清洗并離心后的芯片立即進(jìn)行掃描。

2.2.8芯片掃描與分析 用Scan Array Express雙通道激光掃描儀掃描芯片，掃描結(jié)果用GenPix Pro 4.0軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 探針同源序列分析

用專業(yè)探針設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)靶基因的寡核苷酸探針，探針長度69 mer，在Gnenbank中進(jìn)行同源序列比對，與其它基因的同源性小于60%，得分137bit，Expect=2e-30，證明探針特異性強(qiáng)，達(dá)到芯片實(shí)驗(yàn)要求[10]。

3.2 芯片的樣片掃描分析

點(diǎn)制完畢并過夜晾干的芯片放入芯片掃描儀內(nèi)掃描。點(diǎn)樣液中除含有探針外，還含有Cy5，可發(fā)出綠色熒光，可直觀觀察點(diǎn)樣質(zhì)量。掃描圖像可見芯片上樣點(diǎn)大小一致、規(guī)整度好，無漏點(diǎn)、連點(diǎn)，背景清晰，樣點(diǎn)矩陣符合預(yù)先設(shè)計(jì)。樣片外觀見圖1。圖2為樣片掃描圖。芯片上靶基因定位見表1。

圖1線粒體基因芯片外觀圖

Fig1AppearancefigureofmtDNAmicroarray

圖2芯片點(diǎn)制后樣片熒光掃描圖

Fig2Fluorescencescanningofsamplemicroarrayafterspotting

3.3 芯片雜交前的洗脫分析

芯片雜交前進(jìn)行預(yù)處理及洗脫后，探針樣點(diǎn)區(qū)域的熒光徹底清洗干凈，整張芯片熒光本底均勻一致，不會(huì)影響后續(xù)雜交樣點(diǎn)的熒光信號。見圖3。

圖3芯片洗脫后掃描圖

Fig3Scanningfigureaftermicroarraywash-out

表1雜交位點(diǎn)熒光信號比值及靶基因定位信息

Table 1 Ratio of fluorescence signal after hybridization andtarget genes locations

注：1、2、3代表每個(gè)靶基因重復(fù)的3個(gè)位點(diǎn)，各靶基因在芯片上的位置由(行，列)坐標(biāo)的方式表示，陰性對照、內(nèi)標(biāo)、外標(biāo)基因的信號值未在表中顯示。

3.4 芯片雜交及信號分析

圖4為兩個(gè)細(xì)胞cDNA文庫與芯片雜交后掃描偽色圖。整張芯片雜交信號均勻，其中陰性對照Negative相應(yīng)位點(diǎn)的熒光信號很弱，陽性對照人GAPDH、Actingβ基因相應(yīng)位點(diǎn)信號較強(qiáng)且穩(wěn)定一致。空白對照熒光信號值和芯片背景信號值一致。

表1中包含各雜交樣點(diǎn)上的熒光比值及對應(yīng)靶基因在芯片上的定位。當(dāng)比值大于2.0或小于0.5時(shí)認(rèn)為該基因上調(diào)或下調(diào)。同一基因的熒光信號比值接近，數(shù)據(jù)具有一致性，芯片上的每個(gè)基因樣點(diǎn)在進(jìn)行表達(dá)檢測時(shí)都是有效的。

圖4 芯片雜交掃描圖

3.5 熒光強(qiáng)度分布

根據(jù)靶基因的兩種熒光強(qiáng)度值作散點(diǎn)圖，見圖5。圖中縱坐標(biāo)為掃描樣點(diǎn)Cy5熒光強(qiáng)度值，橫坐標(biāo)為掃描樣點(diǎn)Cy3熒光強(qiáng)度值。圖4顯示了Hela和Hc1兩種細(xì)胞系mtDNA基因差異表達(dá)情況，結(jié)果可見有10個(gè)樣點(diǎn)信號比值在y=0.5x之下，有5個(gè)樣點(diǎn)信號比值在y=2x之上，癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的mtDNA基因表達(dá)水平存在很大差異，雜交結(jié)果散點(diǎn)圖直觀反映了差異表達(dá)情況。

圖5 熒光強(qiáng)度分布圖

Table5Fluorescenceintensitydistributionfigure

4 討論

DNA芯片(DNA chip)技術(shù)是現(xiàn)代高新生物科技的杰出代表。表達(dá)譜芯片將成千上萬特異探針分子固定于載體表面，用于大規(guī)模平行檢測基因表達(dá)水平?；蛐酒夹g(shù)以其高通量、集約化、快速便捷的特點(diǎn)在眾多分子生物學(xué)技術(shù)中獨(dú)樹一幟。目前，其在抗腫瘤藥物的篩選、腫瘤的分子診斷和分子分型及腫瘤基因多態(tài)性等方面廣泛應(yīng)用[11-14]。

本實(shí)驗(yàn)成功制備了人mtDNA表達(dá)譜寡核苷酸芯片。從點(diǎn)樣后掃描圖可見芯片上樣點(diǎn)大小均勻一致，規(guī)整度好，樣點(diǎn)間無連點(diǎn)，無漏點(diǎn)，芯片點(diǎn)制理想。芯片雜交前洗脫徹底，洗脫后的芯片熒光本底均勻一致，確保雜交信號真實(shí)可信。雜交掃描圖顯示整張芯片雜交信號均勻，各基因的3個(gè)重復(fù)位點(diǎn)熒光信號均勻一致，各質(zhì)控點(diǎn)按預(yù)期要求顯示，保證雜交結(jié)果的可靠性。散點(diǎn)圖真實(shí)反映了癌細(xì)胞和正常細(xì)胞線粒體表達(dá)基因的差異表達(dá)情況。芯片的制備、實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)參數(shù)非常理想，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

應(yīng)用制備的寡核苷酸芯片檢測樣品基因的表達(dá)情況，其影響因素眾多。從實(shí)驗(yàn)儀器的使用、芯片的制備、探針的設(shè)計(jì)合成到最后的雜交、結(jié)果分析判斷都可能對最終的結(jié)果產(chǎn)生影響，導(dǎo)致假陰性、假陽性，甚至出現(xiàn)檢測失敗[15]。下面對人mtDNA基因表達(dá)譜寡核苷酸芯片的制備及檢測，分析討論一些主要的影響因素。

4.1 芯片點(diǎn)樣儀

芯片點(diǎn)樣儀是芯片制備的主要儀器，其核心是集成的運(yùn)動(dòng)控制系統(tǒng)，包括x、y和z三個(gè)軸向的線性執(zhí)行機(jī)構(gòu)。集成控制系統(tǒng)主要包括龍門式和懸臂式兩類。本實(shí)驗(yàn)芯片制備所應(yīng)用的為懸臂式集成控制系統(tǒng)。懸臂式系統(tǒng)可獲得±1 μm的運(yùn)動(dòng)精確度，較龍門式±10 μm高，保證了芯片點(diǎn)樣精確度和規(guī)整度[16]。并采用了微點(diǎn)樣鋼針接觸式點(diǎn)樣，每根鋼針都有一個(gè)平頭，這樣吸樣后鋼針的頭部就會(huì)形成一個(gè)薄膜。因此，點(diǎn)樣直徑在很大程度上由鋼針尖部的尺寸決定，從芯片點(diǎn)制后掃描圖(圖2)上可見樣點(diǎn)直徑均一，這為后續(xù)準(zhǔn)確檢測每個(gè)樣點(diǎn)的信號提供了重要保證。接觸式點(diǎn)樣并不能保證探針溶液在樣點(diǎn)范圍內(nèi)的均勻分布，但這并不影響芯片數(shù)據(jù)的數(shù)模轉(zhuǎn)換及后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析。

4.2 芯片掃描儀

芯片掃描儀將雜交的結(jié)果保存為圖像信息，并通過特殊軟件將圖像信息轉(zhuǎn)化為數(shù)字信息，即微陣列芯片的檢測過程。掃描儀的相關(guān)參數(shù)決定了芯片檢測的質(zhì)量和效率，如通量、精度、重復(fù)性、分辨率、靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍等。其中與本芯片最相關(guān)的一個(gè)重要指標(biāo)是通道數(shù)，通道數(shù)決定了芯片能夠檢測不同標(biāo)記物的數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)使用的掃描儀為激光雙通道掃描儀，可一次性得到兩個(gè)熒光圖像。與單通道掃描相比具有快速、圖像重疊簡單和無機(jī)械位移造成的偏差等優(yōu)點(diǎn)。要得到高質(zhì)量的圖像和穩(wěn)定的數(shù)據(jù)，芯片掃描有以下幾點(diǎn)體會(huì)：(1)由于芯片掃描儀具有極高的靈敏度和分辨率，應(yīng)注意芯片實(shí)驗(yàn)操作的潔凈；(2)芯片完成雜交和清洗后，盡可能立即掃描，防止熒光分子的光漂白；(3)掃描儀中有機(jī)械傳動(dòng)裝置，儀器應(yīng)放置在平穩(wěn)堅(jiān)固的平臺(tái)上，并防止外源性震動(dòng)。

4.3 探針設(shè)計(jì)

寡核苷酸芯片要求靶基因的序列是已知的。設(shè)計(jì)探針時(shí)所用的模板序列必須是被國際認(rèn)同的標(biāo)準(zhǔn)序列。本實(shí)驗(yàn)采用人mtDNA的劍橋序列為模板序列，該序列是國際公認(rèn)的人mtDNA標(biāo)準(zhǔn)序列。

寡核苷酸探針的長度也會(huì)影響芯片實(shí)驗(yàn)，探針包含的堿基數(shù)越多探針雜交特異性越強(qiáng)，芯片結(jié)果的假陽性也就會(huì)越少。另外，較長的寡核苷酸探針不易受到局部極端序列組成的影響，因?yàn)镚C和AT富含區(qū)通常只延續(xù)很短的長度。本實(shí)驗(yàn)采用69 mer探針的長度范圍可以對這種極端序列造成的影響有很好的平均效應(yīng)。但有時(shí)無法從本身長度較短的基因序列中選出符合要求的探針。本實(shí)驗(yàn)原計(jì)劃將mtDNA編碼的2種rRNA、22種tRNA、13種mRNA共47種基因全部選為靶基因。但22種tRNA基因中有些基因自身長度只有70～80bp，無法選出符合條件的探針，只能將其從靶基因中剔除。經(jīng)過篩選，本芯片的靶基因中包括了22種tRNA基因中的9種。

4.4 芯片數(shù)據(jù)處理及結(jié)果的分析判斷

歸一化是芯片數(shù)據(jù)采集中必需的，是數(shù)據(jù)采集后的第一步，是對不同通道和不同芯片來源的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析之前，消除各系統(tǒng)誤差的過程。對不同數(shù)據(jù)集進(jìn)行數(shù)據(jù)處理的數(shù)值稱為歸一化因子。進(jìn)行歸一化處理不會(huì)改變數(shù)據(jù)的內(nèi)容，而是糾正其中次要的不平衡，這些因素來自下列各種差異對成像過程的影響，包括標(biāo)記和雜交效率及洗脫的差異、不同染料的量子產(chǎn)量差異、激光功率和監(jiān)測儀靈敏度的變化，以及許多其它原因造成不同芯片和不同通道間的微小差異。歸一化保證了比值計(jì)算和其它數(shù)值比較結(jié)果的精確性，未經(jīng)歸一化處理的圖像可能無法正確顯示這些比較結(jié)果。

4.5 假陽性、假陰性原因分析

基因芯片的巨大優(yōu)勢在于其高通量。由于生物學(xué)反應(yīng)過程中，例如酶學(xué)反應(yīng)、RNA抽提等過程有一些不能完全人為控制的因素存在，因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有時(shí)會(huì)產(chǎn)生假陽性、假陰性。要得到一個(gè)重要的生物學(xué)結(jié)論，往往需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。對于一對樣品，若要真實(shí)了解其中差異表達(dá)的基因，至少做兩張芯片，進(jìn)行熒光交換。而對一種現(xiàn)象，如藥物對細(xì)胞的影響，還要進(jìn)行生物材料上的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。對于研究腫瘤樣品中與正常人的差異表達(dá)基因，可以選擇多個(gè)腫瘤樣品，每個(gè)樣品與正常樣品比較，同時(shí)在一張芯片上雜交，而后尋找在多個(gè)腫瘤樣品中共同變化的基因。另外，對芯片實(shí)驗(yàn)中的陽性或陰性基因用Northen或real-time PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可直接檢驗(yàn)芯片實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，也是排除假陽性、假陰性的最有力的方法[17]。

本實(shí)驗(yàn)制備的芯片在初步應(yīng)用時(shí)雖未采取對同一樣本的重復(fù)雜交實(shí)驗(yàn)，但是在芯片上對同一靶基因探針進(jìn)行了3次重復(fù)點(diǎn)樣，并采用了熒光交換。這樣對同一個(gè)靶基因可得到6個(gè)熒光信號比值，并用t檢驗(yàn)作出統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)論，從而最大程度的降低假陽性或假陰性的發(fā)生，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)可靠。最后用real-time PCR對陽性表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說明芯片制備過程及實(shí)驗(yàn)方法科學(xué)、合理，得出的結(jié)論可反映基因表達(dá)的真實(shí)變化。

本實(shí)驗(yàn)成功制備了人mtDNA基因表達(dá)譜芯片，完善了該芯片的制備和使用程序，通過初步應(yīng)用，證明所研制的人mtDNA基因表達(dá)譜芯片具有特異性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于不同組織或細(xì)胞樣本cDNA文庫mtDNA基因差異表達(dá)分析。