UPLC指紋圖譜法考察丹蛭降糖膠囊的不同制備工藝

莊星星，　楊曉旭，　魏良兵，　韓燕全，　高家榮，*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽　合肥　230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽　合肥　230031）

UPLC指紋圖譜法考察丹蛭降糖膠囊的不同制備工藝

莊星星1，楊曉旭1，魏良兵2，韓燕全2，高家榮1，2*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽合肥230031）

目的 運(yùn)用超高效液相色譜（UPLC）法對兩種制備工藝的丹蛭降糖膠囊特征指紋圖譜進(jìn)行初步研究比較，考察不同制備方法對藥物指紋圖譜的影響，為制備工藝的優(yōu)化以及后續(xù)的藥效學(xué)研究提供理論依據(jù)。方法 采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸進(jìn)行梯度洗脫；體積流量0.25 mL/min；柱溫30℃；檢測波長230 nm。結(jié)果 以芍藥苷和丹皮酚為參照峰，新工藝（醇水雙提）丹蛭降糖膠囊的特征指紋圖譜共確定了15個共有峰，老工藝（水提）丹蛭降糖膠囊確定了12個共有峰。結(jié)論 丹蛭降糖膠囊新制備工藝特征指紋圖譜確認(rèn)的共有峰多，表明提取的有效成分多。對比指紋圖譜的峰面積，新工藝峰面積明顯高于老工藝，說明新工藝提取效率更高。

丹蛭降糖膠囊；UPLC指紋圖譜；制備工藝

丹蛭降糖膠囊為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑（皖藥制字Z20090006），由太子參、生地黃、牡丹皮、菟絲子、澤瀉、水蛭六味藥物組成。具有益氣養(yǎng)陰，活血化瘀之功效，臨床主要用于治療Ⅱ型糖尿病之氣虛陰虧血瘀證及其慢性并發(fā)血管病變，療效顯著［1-3］。前期丹蛭降糖膠囊的制備工藝為水提法，并對其進(jìn)行了指紋圖譜研究［4］。2010年，丹蛭降糖膠囊獲得國家“十二五”重大新藥創(chuàng)制項目，對其制備工藝從新進(jìn)行了研究。本實驗采用超高效液相色譜（UPLC）法對新制備工藝（醇水雙提法）生產(chǎn)的丹蛭降糖膠囊特征指紋圖譜進(jìn)行了研究，考察新老工藝的丹蛭降糖膠囊對藥物主要有效成分的影響，并與老工藝的指紋圖譜進(jìn)行了比對，為工藝優(yōu)化提供理論支持［5］。

1　儀器與試藥

1.1儀器 Waters Acquity H-C1ass UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Acquity UPLC BEHC18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；Acquity PDA檢測器以及Waters Empower2軟件；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；有機(jī)相針式濾器（13 mm× 0.22μm）（上海安普科學(xué)儀器有限公司）；BP211D十萬分之一天平（德國塞多利斯公司）；

1.2試藥 芍藥苷對照品（批號110736-200934，20 mg/支，純度為94.9%）和丹皮酚對照品（批號0708-9704，20 mg/支，純度為98.0%）均由中國食品藥品生物研究院提供；丹蛭降糖膠囊（老工藝生產(chǎn)批號分別為20121125、20111217、20120107、20120221、20120315、20120409、20120503、20120527、20120618、20120715；新工藝生產(chǎn)批號分別為20120816、20120908、20121015、20121104、20121128、20121226、20130127、20130309、20130402、20130426）均由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供；乙腈、甲醇均為色譜純，水為屈臣氏雙蒸水，其余試劑均為分析純。

2　實驗方法

2.1制備工藝

2.1.1醇水雙提法制備工藝 處方中牡丹皮、澤瀉藥材加牡丹皮質(zhì)量3倍量的95%乙醇浸泡0.5 h，90℃回流提取2 h，過濾，濾液在55℃減壓濃縮至原體積1/20倍，保存；牡丹皮和澤瀉提取后殘渣與太子參、地黃和菟絲子三味藥材及90%處方量水蛭加水浸泡0.5 h，煎煮提取2次，第1次加5倍量的水煎煮1.5 h，第2次加5倍量水煎煮1 h，分次濾過，合并濾液，濾液濃縮至原體積1/3，趁熱緩緩加入濃縮液體積1.5倍量的95%乙醇，并不斷攪拌，醇沉過夜?；靹蚝筮^濾，減壓回收乙醇，真空干燥，干浸膏粉碎。剩余10%處方量的水蛭粉碎，加少量95%乙醇浸泡過夜后與牡丹皮和澤瀉乙醇提取濃縮液合并。在乙醇提取濃縮液中加入適量糊精，55℃減壓干燥，再與上述干浸膏粉末混合均勻，裝膠囊，制成1 000粒，即得。

2.1.2水提取制備工藝 處方中六味藥材，加水煎煮提取3次，第1次加10倍量水煎煮1.5 h，第2、第3次分別加8倍量水煎煮1 h。合并煎液，濾過，靜置48 h，吸取上清液，減壓濃縮至相對密度為1.2（60℃）的稠膏，真空干燥，干浸膏粉碎，加入糊精150 g，80%乙醇制粒，干燥（≤80℃），整粒，裝入膠囊，制成1 000粒，即得。

2.2供試液制備 取兩種工藝制備的丹蛭降糖膠囊內(nèi)容物，研缽中研成粉末，精密稱取0.5 g。加75%甲醇，25 mL，超聲提取（150 W）30 min。超聲提取后，冷卻，補(bǔ)足失質(zhì)量，濾過，濾液以0.22μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液［6］。

2.3對照品制備 精密稱取芍藥苷對照品和丹皮酚對照品適量，制成混合液。以0.22μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得對照品溶液。其中芍藥苷質(zhì)量濃度為0.256 mg/mL，丹皮酚為0.240 mg/mL。

2.4色譜條件 BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%磷酸，進(jìn)行梯度洗脫，見表1；檢測波長為230 nm；柱溫35℃；體積流量為0.25 m L/min；進(jìn)樣量1μL［7］。

表1　丹蛭降糖膠囊UPLC特征指紋圖譜流動相梯度洗脫程序

2.5方法學(xué)考察

2.5.1精密度試驗 同一批樣品經(jīng)“2.2”項供試液處理方法，按“2.4”項色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次測定指紋圖譜。使用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）對測定的指紋圖譜進(jìn)行相似度評價，6次測定的指紋圖譜相似度在0.99以上。各色譜圖主要峰相對保留時間和峰面積的RSD均＜3%，均符合要求，表明儀器精密度好。

2.5.2穩(wěn)定性試驗 同一批樣品經(jīng)“2.2”項供試液處理方法，按“2.4”項色譜條件，在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行進(jìn)樣，測定相應(yīng)時間的指紋圖譜。使用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）對測定的指紋圖譜進(jìn)行相似度評價，6次測定的指紋圖譜經(jīng)相似度評價相似度在0.98以上，各色譜主要峰相對保留時間和峰面積的RSD均＜3%，表明供試液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3重復(fù)性試驗 同一批樣品經(jīng)“2.2”項供試液處理方法，按“2.4”項色譜條件，進(jìn)樣測定6份供試液的指紋圖譜。使用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）對測定的指紋圖譜進(jìn)行相似度評價，6次測定指紋圖譜經(jīng)相似度評級相似度在0.98以上，各色譜主要峰相對保留時間和峰面積的RSD均＜3%，表明實驗方法重復(fù)性好。

2.5.4空白試驗 取適量75%甲醇，按色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果說明空白溶劑對樣品指紋圖譜色譜峰無干擾，見圖1。

圖1　提取溶劑（75%甲醇）色譜圖

3　兩種工藝制備工藝丹蛭降糖膠囊的UPLC特征指紋圖譜的建立及評價

3.1丹蛭降糖膠囊的UPLC特征指紋圖譜的建立 分別取10批新老工藝的丹蛭降糖膠囊，按“2.2”項供試液處理方法平行處理。在“2.4”項色譜條件下，進(jìn)樣1μL，建立兩種不同工藝的特征指紋圖譜。將得到的指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）進(jìn)行色譜分析。水提取工藝制備的丹蛭降糖膠囊共有12個主要共有峰，醇水雙提法制備的丹蛭降糖膠囊有15個主要共有峰。如圖2、3所示。

圖2　水提取制備工藝丹蛭降糖膠囊UPLC指紋圖譜

圖3　醇水雙提制備工藝丹蛭降糖膠囊UPLC指紋圖譜

3.2兩種制備工藝UPLC特征指紋圖譜的評價［3］以處方中君藥牡丹皮中的主要有效成分丹皮酚和芍藥苷為參照峰，比較兩種制備工藝條件下丹蛭降糖膠囊UPLC特征指紋圖譜的共有模式［8］，如圖4所示。

圖4　兩種制備工藝條件下丹蛭降糖膠囊UPLC特征指紋圖譜共有模式比較

利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）分析比較兩種工藝指紋圖譜共有模式中各峰的峰面積［9］，見表2。其中7號峰為芍藥苷，16號峰為丹皮酚。

表2　兩組工藝共有模式特征指紋圖譜峰面積比較

通過比較兩種不同制備工藝所得的特征指紋圖譜，醇水雙提制備工藝生產(chǎn)的丹蛭降糖膠囊特征指紋圖譜共有15個共有峰，水提制備工藝生產(chǎn)的丹蛭降糖膠囊特征指紋圖譜有12個共有峰。表明醇水雙提法對處方中有效成分的煎出明顯優(yōu)于水提取法。比較兩種制備工藝的峰面積，醇水雙提工藝組大部分峰的峰面積大于水提取工藝組［10］。比較參照峰的峰面積，醇水雙提工藝組芍藥苷和丹皮酚含量分別是水提工藝組的1.7倍和45.8倍。說明對于方中君藥牡丹皮的主要成分提取效率，醇水雙提的制備工藝是明顯高于水提的制備工藝。

4　討論

4.1參照物的選擇 通過比較兩種不同的提取工藝，結(jié)合實際實驗情況，選擇了牡丹皮中的芍藥苷和丹皮酚為參照物。通過查閱相關(guān)的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)丹皮酚水溶性差，水提法的提取率低，同時丹皮酚和芍藥苷在降低血糖和治療血管相關(guān)疾病方面有著廣泛的藥理作用［11-13］。所以選擇丹皮酚和芍藥苷為參照物。

4.2水提醇沉對指紋圖譜的影響 通過比較兩種不同制備方法生產(chǎn)的丹蛭降糖膠囊的特征指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)醇水雙提組的峰面積普遍要比水提組高。分析原因可能是醇水雙提組在水提取后加入了95%的乙醇進(jìn)行水提醇沉，除去了不必要的雜質(zhì)，提高了膠囊的實際載藥率。因此在相同處理條件下，醇水雙提組的有效成分含有量高于水提組。同時比較兩組特征指紋圖譜的共有模式（表2）發(fā)現(xiàn)14號峰的峰面積水提法明顯大于醇水雙提法。分析原因可能是某水溶性成分，在新工藝水提醇沉過程中有部分損失［14］。

本實驗運(yùn)用UPLC特征指紋圖譜法對兩種不同制備工藝的丹蛭降糖膠囊進(jìn)行初步研究，水提取法制備的丹蛭降糖膠囊確定了12個共有峰，醇水雙提法制備的丹蛭降糖膠囊確定了15個共有峰。通過比較兩種工藝特質(zhì)指紋圖譜的共有模式，結(jié)合參照峰的峰面積，發(fā)現(xiàn)醇水雙提的制備工藝在藥材提取效率方面高于水提的制備工藝，為后續(xù)的丹蛭降糖膠囊后續(xù)的制備工藝優(yōu)化和后續(xù)的藥效學(xué)研究提供理論依據(jù)。

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R944

B

1001-1528（2015）01-0207-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.046

2013-11-12

國家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)科研專項課題（JDZX2012003）；科技部重大新藥創(chuàng)制項目（2010ZX09102-209）

莊星星（1990—），男，碩士生，研究方向：中藥藥劑新劑型。Te1：13696510131，E-mai1：zxx900913@126.com

高家榮（1964—），男，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥制劑工藝和新藥研發(fā)。Te1：（0551）62838556，E-mai1：zyfygjr2006@163.com