不同黃芪劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)功能及氧化應(yīng)激的作用

賁 瑩，　張鳳華，　梁文杰，　張 冬，　方 倩

（河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北　石家莊　050200）

不同黃芪劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)功能及氧化應(yīng)激的作用

賁 瑩，張鳳華，梁文杰，張 冬，方 倩

（河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北石家莊050200）

目的 探討不同黃芪劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠周圍神經(jīng)功能及氧化應(yīng)激的作用。方法 用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)建立SD大鼠糖尿病周圍神經(jīng)病變模型，并隨機(jī)分為模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組和α-硫辛酸組。黃芪60 g組和黃芪120 g組分別用含對(duì)應(yīng)量黃芪的補(bǔ)陽(yáng)還五湯濃煎劑灌胃，α-硫辛酸組用20 mg/（kg·d）α-硫辛酸灌胃。另設(shè)正常組。給藥12周后，檢測(cè)空腹血糖（FBG）、坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，血中超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）水平以及坐骨神經(jīng)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）活性。結(jié)果 與正常組相比，模型組的FBG、MDA水平和caspase-3活性明顯升高，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、SOD、CAT、GSH-Px的活力明顯下降（P＜0.01）。與模型組比較，黃芪120 g組和α-硫辛酸組MDA水平和caspase-3活性明顯下降，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、SOD、CAT、GSH-Px的活力明顯上升（P＜0.05，P＜0.01）；黃芪60 g組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、SOD、CAT的活力明顯上升，MDA水平顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。與黃芪60 g組比較，黃芪120 g組SOD活性顯著提高（P＜0.01）；神經(jīng)傳導(dǎo)速度、CAT、GSH-Px活性有增高趨勢(shì)，MDA水平及caspase-3活性有減低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。黃芪120 g組與α-硫辛酸組比較各指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論 補(bǔ)陽(yáng)還五湯能有效減低糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮其保護(hù)作用。120 g黃芪用量的補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗氧化作用略佳。

糖尿病周圍神經(jīng)病變；氧化應(yīng)激；補(bǔ)陽(yáng)還五湯；黃芪

糖尿病周圍神經(jīng)病變是常見(jiàn)的糖尿病慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病率高達(dá)90%［1］，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但大量研究表明氧化應(yīng)激可以直接或間接地?fù)p傷神經(jīng)細(xì)胞，在糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生中起到了重要作用［2-3］。中醫(yī)認(rèn)為本病主要為絡(luò)氣虛滯，淤血阻絡(luò)［4］，臨床治法上我們應(yīng)用補(bǔ)氣活血通絡(luò)的補(bǔ)陽(yáng)還五湯加減治療取得了較好的療效。但對(duì)其能否通過(guò)改善氧化應(yīng)激而減少周圍神經(jīng)損傷，還缺少客觀實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究旨在觀察不同黃芪劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠氧化應(yīng)激及周圍神經(jīng)功能的作用，以期明確補(bǔ)陽(yáng)還五湯方發(fā)揮治療作用的途徑、效果及方中黃芪的最佳劑量，以指導(dǎo)臨床用藥及科研。

1　材料

1.1動(dòng)物 雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g（2月齡左右），購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，單位許可證號(hào)SYXK（冀2008-0026）；動(dòng)物合格證號(hào)1301053。

1.2藥物 補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方來(lái)源《醫(yī)林改錯(cuò)》，黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，川芎4.5 g，赤芍4.5 g，地龍3 g，紅花3 g，桃仁3 g，簡(jiǎn)稱黃芪120 g組。另設(shè)黃芪60 g，其余藥物劑量不變，簡(jiǎn)稱為黃芪60 g組。以上兩組藥物分別加水浸泡2 h，水煎2次，每次40 min，先后兩次藥液合并、濃縮，分別制成含生藥2.4、1.36 g/mL的藥液。α-硫辛酸購(gòu)于Puritan's Pride公司（100 mg×60粒，批號(hào)：250597-09 EXP 10/12）。

1.3試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購(gòu)于Sigma公司；微量丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（g1utathion peroxidase；g1utathione peroxidase，GSH-Px）測(cè)試盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；大鼠半胱天冬酶3（caspase-3）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒構(gòu)于BG公司

1.4儀器 One touchII型血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生公司）；DANTEC Cantata肌電圖誘發(fā)電位儀；島津紫外分光光度計(jì)UV-1700，pharmaSpec SHIMADIU。

2　方法

2.1分組、建立動(dòng)物模型 60只SD大鼠按體質(zhì)量相似隨機(jī)分為5組，正常組、模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組、α-硫辛酸組，每組10只。在禁食12 h后模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組、α-硫辛酸組大鼠予一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg，72 h后大鼠禁食8 h測(cè)鼠尾靜脈血，血糖≥16.7 mmo1/L確立為糖尿病大鼠模型，正常對(duì)照組大鼠注射等量的檸檬酸緩沖液。

2.2給藥 造模成功立即開(kāi)始灌胃，黃芪60 g組、黃芪120 g組按10 mL/（kg·d）分別用相應(yīng)黃芪量藥液灌胃；α-硫辛酸組按20 mg/（kg·d）用α-硫辛酸灌胃；正常組和模型組給予等體積的蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間自由飲食，連續(xù)給藥12周。

2.3觀察指標(biāo)

2.3.1坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定 給藥結(jié)束后，水合氯醛麻醉大鼠，用肌電圖儀檢測(cè)大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度［5］。以坐骨窩為第一刺激部位，踝部為第二刺激部位。均經(jīng)皮插入2個(gè)針電極，間距為2 mm，尾部接地，保持皮溫30℃。（1）運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MCV）：方形波刺激神經(jīng)，用2個(gè)針電極于同側(cè)足部骨間肌，記錄復(fù)合肌肉動(dòng)作電位及潛伏期。檢測(cè)3對(duì)不同M波的潛伏期，取平均值。兩個(gè)刺激部位間的傳導(dǎo)時(shí)間為近端、遠(yuǎn)端潛伏期差，測(cè)量?jī)蓚€(gè)刺激部位間的距離。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（m/s）=距離/潛伏期差值。（2）感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SCV）：方形波記錄6對(duì)在坐骨窩和踝激發(fā)的H反射潛伏期，測(cè)量?jī)蓚€(gè)刺激部位間的距離。感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（m/s）=距離/潛伏期差值。

2.3.2血液指標(biāo)測(cè)定 每月1次尾靜脈采血，血糖儀測(cè)定空腹血糖（FBG）；給藥結(jié)束取血，比色法測(cè)定SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA水平。

2.3.3坐骨神經(jīng)caspase-3活性檢測(cè) 給藥結(jié)束后，腹腔注射烏拉坦麻醉大鼠，分離雙側(cè)坐骨神經(jīng)，迅速取下，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液洗去雜質(zhì)和血漬，濾紙吸干，在-196℃液氮中保存。按試劑盒說(shuō)明用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定Caspase-3活性。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，檢測(cè)結(jié)果±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析和SNK法兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠空腹血糖及坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度（±s，n=10）

表1　不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠空腹血糖及坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度（±s，n=10）

注：與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別空腹血糖/（mmo1·L-1）4周8周12周MCV/（m·s-1）SCV/（m·s-1）正常組4.96±0.63△△5.02±0.58△△4.87±0.51△△45.26±4.35△△46.45±7.12△△模型組26.54±3.77 25.83±4.14 26.10±3.81 30.17±5.16 29.21±9.38黃芪60 g組27.21±3.26 26.36±3.52 25.97±2.72 35.82±6.36△37.06±6.74△黃芪120 g組26.25±3.89 25.74±3.16 24.16±3.05 37.32±6.22△40.17±5.22△△α-硫辛酸組26.12±4.02 26.27±3.35 26.14±3.44 36.79±7.08△39.55±6.38△

3　結(jié)果

3.1空腹血糖變化 模型組、黃芪120 g組、黃芪60 g組、α-硫辛酸組FBG顯著高于正常組。黃芪120 g組FBG略低于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

3.2各組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的比較 與正常組比較，模型組坐骨神經(jīng)MCV和SCV明顯減慢（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪60 g組、黃芪120 g組和α-硫辛酸組MCV和SCV明顯提高（P＜0.05），其中黃芪120 g組SCV增高更明顯（P＜0.01）；三藥物干預(yù)組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。

3.3各組氧化指標(biāo)及caspase-3活性的變化 模型組比正常組SOD、GSH-Px、CAT活性均明顯下降（P＜0.01），MDA水平、caspase-3活性明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪60 g組MDA水平降低（P＜0.05），SOD活性上升（P＜0.01）CAT水平升高（P＜0.05）；黃芪120 g組及α-硫辛酸組SOD、GSH-Px、CAT活性均上升（P＜0.01），MDA水平、caspase-3活性顯著降低（P＜0.01）。三藥物干預(yù)組間比較黃芪120 g組與α-硫辛酸組SOD活性較黃芪60 g組升高（P＜0.01），其余指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠血液SOD、GSH-Px、CAT活性、MDA及坐骨神經(jīng)caspase-3活性比較

4　討論

糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病主要的慢性并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了，一般認(rèn)為與多元醇通路、己糖胺途徑、蛋白激酶C途徑的激活和糖基化終產(chǎn)物的形成、微血管病變、氧化應(yīng)激反應(yīng)等諸多因素有關(guān)［6-7］。其中氧化應(yīng)激在周圍神經(jīng)病變中的作用受到了越來(lái)越多的重視。Brown1een［8］提出的統(tǒng)一機(jī)制學(xué)說(shuō)認(rèn)為，經(jīng)典的糖尿病并發(fā)癥的多元醇途徑、糖基化終產(chǎn)物（AGES）途徑、蛋白激酶C（PKC）途徑和氨基已糖途徑均是高糖條件下線粒體呼吸鏈中氧自由基生成過(guò)多導(dǎo)致的結(jié)果。氧化應(yīng)激在糖尿病并發(fā)癥發(fā)生中處于核心的角色。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitro-gen species，RNS）產(chǎn)生過(guò)多，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。糖尿病高血糖狀態(tài)導(dǎo)致ROS和RNS生成增多，氧化應(yīng)激反應(yīng)增加［9］。一方面，氧自由基可攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物。神經(jīng)髓鞘中含有大量脂類，體外試驗(yàn)表明在坐骨神經(jīng)組織勻漿中加入20 mmo1/L葡萄糖，使脂質(zhì)過(guò)氧化物增加超過(guò)4倍［10］。脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的最終產(chǎn)物為MDA。脂質(zhì)過(guò)氧化作用可放大ROS的作用，交聯(lián)核酸、蛋白質(zhì)及磷脂，也可使蛋白質(zhì)巰基氧化，引起神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步損傷［11］。另一方面，氧化應(yīng)激反應(yīng)可直接引發(fā)單鏈DNA的斷裂，或通過(guò)JNK、P38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞中一系列半胱天冬酶激活，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［12-13］。其中caspase-3在死亡受體和線粒體介導(dǎo)的經(jīng)典細(xì)胞凋亡途徑中均起著核心作用。由此可見(jiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)是糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)病的重要機(jī)制，目前臨床應(yīng)用抗氧化劑α-硫辛酸治療糖尿病周圍神經(jīng)病變，取得了較好療效［14-15］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯有與α-硫辛酸近似的作用，可使糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度增高，提升體內(nèi)抗氧化劑SOD、GSH-Px、CAT活性，而使MDA水平及caspase-3活性明顯下降，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯能有效減低糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠的氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮其保護(hù)作用。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯為清代醫(yī)家王清任所創(chuàng)，配伍用量特點(diǎn)為君藥黃芪劑量是其他活血通絡(luò)藥總和的5倍，《醫(yī)林改錯(cuò)》中寫到“黃芪用一二兩，以后漸加至四兩”，重用黃芪旨在令氣旺血行而瘀去絡(luò)通。為進(jìn)一步探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯配伍中重用黃芪的科學(xué)內(nèi)涵，確定黃芪的最佳劑量，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中設(shè)置了黃芪60 g組和黃芪120 g組進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示黃芪60 g組與模型組比較神經(jīng)傳導(dǎo)速度、SOD、CAT活性均顯著增高，MDA水平顯著下降。黃芪120 g組與模型組比較除上述指標(biāo)有如上變化外，GSH-Px活性顯著增高，caspase-3活性明顯下降。但不同黃芪劑量組間比較，除黃芪120 g組SOD活性較60 g組顯著提高外，神經(jīng)傳導(dǎo)速度、GSH-Px、CAT活性有增高趨勢(shì)，MDA水平及caspase-3活性有減低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說(shuō)明使用60 g黃芪的補(bǔ)陽(yáng)還五湯就已經(jīng)顯示了較強(qiáng)的抗氧化作用，增大黃芪劑量可使其抗氧化效果略有增強(qiáng)，臨床治療時(shí)推薦按王清任原方120 g黃芪用量使用。

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R285.5

B

1001-1528（2015）01-0199-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.043

2013-11-01

河北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究青年基金項(xiàng)目（QN2014019）

賁 瑩（1979—），女，碩士，講師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)病學(xué)。Te1：13315989821，E-mai1：benyfortunate@sohu.com