飛機草醇提物外用對急性軟組織損傷的實驗研究

秦樹森，　曾春暉，　陳益清，　李先梅，　蔡妮娜，　譚娥玉，　徐明光，　顏 欣，　楊 柯*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西　南寧　530001；2.桂林市婦女兒童醫(yī)院，廣西　桂林　541001）

飛機草醇提物外用對急性軟組織損傷的實驗研究

秦樹森1，2，曾春暉1，陳益清1，李先梅1，蔡妮娜1，譚娥玉1，徐明光1，顏 欣1，楊 柯1*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530001；2.桂林市婦女兒童醫(yī)院，廣西桂林541001）

目的 研究飛機草對小鼠急性軟組織損傷的治療作用及其可能機制。方法 將動物隨機分成空白對照組、模型對照組、陽性對照組、飛機草高、低劑量組，除空白對照組外，其余各組小鼠用重物砸傷造成軟組織損傷模型，應(yīng)用比色法，ELISA法動態(tài)測定損傷組織中SOD活性和MDA、PGE2、NO的水平。另于給藥后第8天取各組余下10只小鼠損傷肌肉，固定于福爾馬林，做病理學(xué)觀察。結(jié)果 飛機草高劑量在試驗期間能明顯升高重物砸傷后損傷組織SOD活性（P＜0.05），明顯降低損傷組織MDA、NO、PGE2水平（P＜0.05），而低劑量僅在給藥后第5天明顯升高重物砸傷后損傷組織SOD活性（P＜0.05）；明顯降低重物砸傷后損傷組織MDA、NO、PGE2水平（P＜0.05）。受損骨骼肌HE染色結(jié)果顯示飛機草給藥后第8天，受損組織炎性反應(yīng)消失，大量成纖維細胞增殖，斷端纖維連接。結(jié)論 飛機草可通過提高SOD活性，降低MDA、NO、PGE2水平來發(fā)揮對急性軟組織損傷的治療作用。

飛機草；急性軟組織損傷；實驗研究

飛機草Eupatorium odoratum L.為菊科植物，載于《壯藥藥材學(xué)》［1］，性微辛、溫，有小毒，具有散瘀消腫，止血，殺蟲功能，主要用于跌打腫痛，外傷出血，旱螞蝗叮咬出血不止，瘡瘍腫毒，民間常用于治療跌打、扭傷等軟組織損傷。前期研究發(fā)現(xiàn)飛機草具有明顯的中樞和外周鎮(zhèn)痛作用［2］，針對其主要功能主治，本實驗著重研究飛機草對重物砸傷小鼠軟組織損傷后改善組織病理變化以及對相應(yīng)致痛物質(zhì)和氧化應(yīng)激相關(guān)物質(zhì)的影響來探討其抗急性軟組織損傷的作用及其機制。

1　材料

1.1藥品與試劑 飛機草于2011年8月在南寧市郊采集，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)教研室冼寒梅教授鑒定為菊科植物飛機草Eupatorium odoratum L.的地上部分；正骨水（廣西玉林制藥集團有限責(zé)任公司）；SOD試劑盒、MDA試劑盒、PGE2試劑盒、NO試劑盒、考馬斯亮蘭試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；蘇木色精、曙紅Y、冰醋酸、鹽酸、二甲苯、無水乙醇均為分析純，購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2主要儀器 超聲勻漿器（寧波新芝科器研究所）；全波長酶標儀（美國Epoch Biotek公司）；EL204電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；BX60顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；高速低溫離心機（德國Heraeus公司）；HM355 S型全自動石蠟切片機（德國MICROM公司）；TU-1901/1900紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；重物砸傷裝置（自制）。

1.3實驗動物 昆明種小鼠，雄性，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：scxk桂2009-0003。

2　實驗方法

2.1受試藥物制備 采集新鮮飛機草地上部分，洗凈，陰干，70%乙醇浸泡提取2次，每次用2倍量溶媒浸泡15 d，合并2次濾液，適當濃縮成1 g生藥/mL，同時調(diào)整酒精體積分數(shù)為30%，室溫陰涼處放置備用。

2.2動物分組及給藥 取雄性健康昆明種小鼠200只，隨機分為5組，即空白對照組（不損傷+30%乙醇）、模型組（損傷+30%乙醇）、陽性組（損傷+正骨水）、藥物高劑量組（損傷+1g生藥/mL 30%乙醇提取物）、低劑量組（損傷+0.5 g生藥/mL 30%乙醇提取物），每組40只。軟組織損傷模型參考McBrier［3］與吳峻等［4］機械沖擊挫傷的造模方法，除空白對照組外，其余各組小鼠在自制砸傷裝置用50 g圓形砝碼從36 cm高處自由落下砸傷鼠右后肢，24 h后各給藥組涂擦相應(yīng)藥液0.5 mL/次，4次/d，每次間隔4 h?？瞻讓φ战M和模型對照組涂擦等量的30%乙醇，連續(xù)7 d。于給藥后第2、第5、第8天各組取10只小鼠處死，取適量損傷部位肌肉組織，于-20℃冰箱保存?zhèn)錅ySOD活性和MDA、PGE2、NO的水平。另于第8天取各組余下10只小鼠右后肢，固定于福爾馬林，做病理學(xué)觀察。

2.3損傷組織中SOD活性、MDA、NO和PGE2水平的測定 取小鼠受損組織稱定質(zhì)量，加入適量NS制成10%組織勻漿液，嚴格按照試劑盒說明書進行測定SOD活性，MDA、NO和PGE2水平。

2.4對損傷組織病理學(xué)改變的影響

2.4.1樣品制備 取固定于福爾馬林溶液的右后肢，沿小腿中線向上打開皮膚，然后再打開外層肌肉，暴露腓腸肌，從跟腱處將腓腸肌鈍性剝離，取出肌肉組織，然后于0～4℃條件下修剪標本，剔去筋膜及神經(jīng)組織，按照常規(guī)HE染色觀察損傷組織病理學(xué)改變。

2.4.2病理切片觀察指標 骨骼肌組織HE染色后，胞漿呈紅色或淡紅色，細胞核呈藍紫色，光學(xué)顯微鏡下觀察肌纖維形態(tài)和肌纖維斷裂情況［5］以及組織的肌細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、排列，明確出血情況，是否有炎性細胞浸潤，直接觀察到血管損傷程度和新生血管情況等，作為組織損傷后病理生理變化的參考標準。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

4　結(jié)果

4.1對受損組織中SOD活性的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠損傷組織在損傷后第2、第5、第8天的SOD活性顯著降低（P＜0.05～0.01）；與模型對照組比較，陽性藥正骨水、飛機草高劑量在給藥后第2、第5天能明顯升高重物砸傷后損傷組織SOD活性（P＜0.05），飛機草低劑量在給藥后第5天能明顯升高重物砸傷后損傷組織SOD活性（P＜0.05）；給藥后第8天，各用藥組與模型組比較，差異無顯著性（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1　飛機草對小鼠受損組織中SOD活性的影響（±s，n=10）

表1　飛機草對小鼠受損組織中SOD活性的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下表同

組別劑量/（g·mL-1）SOD活性/（U·L-1）第2天第5天第8天空白組—53.32±18.08**51.86±17.59**57.23±19.41*模型組—26.68±11.5430.69±10.8540.06±15.73陽性組244.00±21.65*48.70±21.13*53.74±23.32飛機草組247.41±27.78*49.16±24.51*54.25±27.05 1 38.55±21.4246.13±18.68*50.90±20.62

4.2對受損組織中MDA水平的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠損傷組織在損傷后第2、第5、第8天的MDA水平顯著升高（P＜0.05～0.01）；與模型對照組比較，陽性藥正骨水在給藥后第2、第5天能明顯降低重物砸傷后損傷組織MDA水平（P＜0.05），飛機草高劑量在給藥后第2、第5、第8天能明顯降低重物砸傷后損傷組織MDA水平（P＜0.05），飛機草低劑量在給藥后第5天能明顯降低重物砸傷后損傷組織MDA水平（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2　飛機草對小鼠受損組織中MDA水平的影響（±s，n=10）

表2　飛機草對小鼠受損組織中MDA水平的影響（±s，n=10）

組別劑量/（g·mL-1）MDA/（nmo1·g-1）第2天第5天第8天空白組—486.34±232.02**538.86±257.08*502.15±246.50*模型組—982.50±378.15918.61±380.04801.37±349.10陽性組2629.04±251.01*607.98±264.81*558.57±187.56飛機草組2603.61±298.05*560.80±346.11*510.38±140.56*1 768.34±270.01614.33±205.42*572.80±138.70

4.3對受損組織中NO水平的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠損傷組織在損傷后第2、第5、第8天的NO水平顯著升高（P＜0.05～0.01）；與模型對照組比較，陽性藥正骨水在給藥后第2、第5天能明顯降低重物砸傷后損傷組織NO水平（P＜0.05），飛機草高劑量在給藥后第2、第5、第8天能明顯降低重物砸傷后損傷組織NO水平（P＜0.05），飛機草低劑量在給藥后第5天能明顯降低重物砸傷后損傷組織NO水平（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3　飛機草對小鼠受損組織中NO水平的影響（±s，n=10）

表3　飛機草對小鼠受損組織中NO水平的影響（±s，n=10）

組別劑量/（g·mL-1）NO活性/（nmo1·g-1）第2天第5天第8天空白組—7.07±2.91*7.98±3.29*7.29±2.83*模型組—11.25±3.6012.69±4.0710.88±4.29陽性組28.09±2.46*9.13±2.78*8.02±2.93飛機草組28.06±2.57*9.10±2.91*7.66±1.81*1 9.13±1.699.41±2.50*8.88±2.53

4.4對受損組織中PGE2水平的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠損傷組織在損傷后第2、第5、第8天的PGE2水平顯著升高（P＜0.05～0.01）；與模型對照組比較，陽性藥正骨水、飛機草高劑量在給藥后第2、第5、第8天能明顯降低重物砸傷后損傷組織PGE2水平（P＜0.05），飛機草低劑量在給藥后第5天能明顯降低重物砸傷后損傷組織PGE2水平（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4　飛機草對小鼠受損組織中PGE2水平的影響（±s，n=10）

表4　飛機草對小鼠受損組織中PGE2水平的影響（±s，n=10）

組別劑量/（g·mL-1）PGE2/（nmo1·g-1）第2天第5天第8天空白組—376.15±173.91**395.37±175.88**407.21±188.28*模型組—644.86±218.97 729.26±247.63 588.12±191.11陽性組2 422.34±166.69*497.71±209.69*424.22±148.53*飛機草組2 420.05±215.69*455.02±196.99*414.74±152.49*1 514.04±184.53 528.32±146.31*506.50±139.54

4.5對急性軟組織損傷小鼠骨骼肌組織病理學(xué)的影響 實驗結(jié)果表明，飛機草對重物砸傷小鼠后腿所致小鼠腿急性軟組織損傷有抗炎消腫活血化瘀的作用?？瞻捉M動物組織橫紋肌橫紋清晰，無出血，無病理變化；損傷模型組組織出現(xiàn)血腫，炎性細胞浸潤，組織水腫，炎性反應(yīng)明顯；正骨水組組織可見炎性細胞減少，成纖維細胞增殖，肉芽組織增生，疤痕連接，斷端纖維連接且間距??；飛機草高劑量組炎性反應(yīng)消失，大量成纖維細胞增殖，斷端纖維連接；低劑量組炎性反應(yīng)減少，部分成纖維細胞增殖，斷端纖維連接。結(jié)果見圖1。

圖1　飛機草對急性軟組織損傷小鼠骨骼肌組織病理學(xué)的影響（40×）

5　討論

軟組織損傷發(fā)病率較高，有文獻統(tǒng)計該病在美國的發(fā)病率約為21%左右［6］。軟組織損傷廣泛［7］，其中肌肉組織所占的體積最大，因此其損傷的幾率也較高，從10%至55%不等［8］。在組織炎癥或損傷刺激下，細胞膜PLA2被激活，水解細胞膜磷脂的酯鍵，釋放的花生四烯酸經(jīng)COX等酶催化生成大量的PGE2［9］，PGE2除能直接興奮傷害性感受器，增強和延長組胺、5-HT、緩激肽等致痛因子對神經(jīng)末梢的致痛作用外，還能提高傷害性感受器的興奮性，降低其興奮閾值，使傷害性感受器敏感化，同時還能提高毛細血管通透性，改變其舒縮狀態(tài)，促進局部炎癥性新血管形成，影響疼痛的產(chǎn)生和發(fā)展［10-11］。

PG合成同時伴隨有大量氧自由基生成，并與PG合成相互促進。氧自由基［12］主要包括超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫及其中間產(chǎn)物等。在組織損傷情況下，自由基的產(chǎn)生和清除功能失去平衡，造成氧自由基堆積，進而攻擊生物膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸引起脂質(zhì)過氧化，形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（LPO），LPO進一步分解為MDA，使其在組織中積聚過多而引起損傷。MDA的水平常?？煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，并與自由基濃度呈正相關(guān)。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起重要作用，此酶能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。氧自由基在外周和脊髓均有致痛作用，而自由基清除劑如SOD則可以拮抗此致痛作用［13］。

NO是一種重要的炎癥介質(zhì)和免疫分子，具有細胞間和細胞內(nèi)信使以及神經(jīng)遞質(zhì)作用，參與許多生理和病理過程。在炎癥發(fā)展中具有雙重作用，一方面通過刺激巨噬細胞誘導(dǎo)受感染細胞的炎癥和死亡，另一方面NO由iNOS介導(dǎo)促炎性，表現(xiàn)為促進血管擴張，增強血管壁通透性；與O2-反應(yīng)可生成毒性更強的ONOO-，加重氧化損傷；誘導(dǎo)促炎性細胞因子；激活前列腺素合成酶等［14］。它不需要任何中介機制而快速地擴散通過生物膜，將一個細胞產(chǎn)生的信息傳遞到其他周圍的細胞中去。大量證據(jù)表明NO在外周及中樞的不同水平的痛覺調(diào)制中起重要作用［15］。

本實驗結(jié)果表明飛機草通過增加受損組織SOD活性、降低MDA水平等抗氧化應(yīng)激途徑，以及減少受損組織NO、PGE2等致炎致痛介質(zhì)來發(fā)揮抗急性軟組織損傷的作用。

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R285.5

B

1001-1528（2015）01-0196-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.042

2013-10-12

廣西中醫(yī)藥管理局資助課題（gzzc1009）

秦樹森，碩士生，副主任藥師，從事中草藥鎮(zhèn)痛藥理研究。E-mai1：228930028@qq.com

楊 柯，理學(xué)碩士，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥藥理學(xué)研究。Te1：（0771）2279423，E-mai1：kyang_11@126.com