芪蛭皺肺顆粒對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠IFN-γ/IL-4失衡及免疫臟器指數(shù)的影響

張 毅，　李 娟，　李金田，　劉光煒，　張 弢，　劉永琦，　魏舒暢，　蘇 韞

（甘肅中醫(yī)學院敦煌醫(yī)學與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室中藥藥理與毒理學省級重點實驗室，甘肅　蘭州　730000）

［科研報道］

芪蛭皺肺顆粒對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠IFN-γ/IL-4失衡及免疫臟器指數(shù)的影響

張 毅，李 娟，李金田*，劉光煒，張 弢，劉永琦，魏舒暢，蘇 韞

（甘肅中醫(yī)學院敦煌醫(yī)學與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室中藥藥理與毒理學省級重點實驗室，甘肅蘭州730000）

目的 通過觀察芪蛭皺肺顆粒對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）大鼠模型胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及肺泡灌洗液（BALF）、血清中IFN-γ/IL-4平衡的影響，探討芪蛭皺肺顆粒防治COPD的作用機制。方法 采用氣管內(nèi)滴注脂多糖（LPS）加煙熏法建立COPD大鼠模型，治療組自造模第29天起每天給藥一次，正常組及模型組給予生理鹽水，連續(xù)14 d。第43天，檢測胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及BALF、血清中IFN-γ、IL-4的水平變化。結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)降低（P＜0.05）；與模型組比較，芪蛭皺肺顆粒大、中、小劑量組脾臟指數(shù)升高不顯著，而芪蛭皺肺顆粒大、中、小劑量組胸腺指數(shù)升高明顯（P＜0.05）；與空白組比較，模型組大鼠血清、BALF中IFN-γ/IL-4比值明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，芪蛭皺肺顆粒大、小劑量組血清中及芪蛭皺肺顆粒中劑量組BALF中IFN-γ/IL-4比值明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論 芪蛭皺肺顆粒能夠提高IFN-γ功能低下，而抑制IL-4功能亢進，調(diào)節(jié)IFN-γ/IL-4的失衡，從而減輕氣道炎癥浸潤，可能是芪蛭皺肺顆粒防治COPD的機制之一。

慢性阻塞性肺疾?。卉悟伟櫡晤w粒；γ-干擾素；白細胞介素-4；免疫臟器指數(shù)

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pu1monarydisease，COPD），簡稱慢阻肺，是以氣道不完全可逆性氣流受限為特征，氣流受限呈進行性發(fā)展，與肺對有害氣體或有毒顆粒的異常炎癥反應有關(guān)，可伴有氣道高反應性［1］。前期研究表明，芪蛭皺肺顆粒具有控制COPD氣道炎癥、預防肺損傷、促進小氣道重塑等功能［2-5］，對COPD的防治具有一定的作用。本實驗通過觀察COPD大鼠模型肺泡灌洗液（bronchoa1veo1ar 1avage f1uid，BALF）、血清中γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素-4（inter1eukin-4，IL-4）的水平和胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的變化，探討芪蛭皺肺顆粒有無調(diào)節(jié)IFN-γ/IL-4的比值失衡，防治COPD的發(fā)生、發(fā)展。

1　實驗材料

1.1動物 SPF級Wistar雄性大鼠70只，體質(zhì)量（200± 20）g，由甘肅中醫(yī)學院科研實驗中心提供。實驗動物質(zhì)量合格證編號SCXK（甘）2011-0001，動物實驗設(shè)施使用證編號SCXK（甘）2011-0001-0001105。

1.2藥品與試劑 芪蛭皺肺顆粒由黃芪、黨參、麥冬、丹參等藥物組成，具有益氣培元、活血化瘀、癟皺肺脹之功用，由甘肅中醫(yī)學院藥物制劑室制備；蘇子降氣丸（吉林紫鑫藥業(yè)生產(chǎn)，批號11040106102）；羅氟司特（無錫泓興生物醫(yī)藥科技有限公司提供，批號20110905）；脂多糖（LPS）（Sigma公司，批號L-2880）；IFN-γ、IL-4 ELISA（試劑盒購自武漢博士德生物工程公司，批號201128）；戊巴比妥鈉（北京化學試劑公司，批號090822）；蘭州香煙（蘭州煙草公司，批號104193502）。

1.3主要儀器 AE200型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；Benchmark p1us酶標儀（BIO RAD公司）。

2　實驗方法

2.1分組與造模 采用隨機數(shù)字表法將70只Wistar大鼠分為空白組、模型組、蘇子降氣丸組、羅氟司特組與芪蛭大、中、小劑量共7組，每組10只。大鼠適應性喂養(yǎng)3 d，采用氣管內(nèi)滴注LPS加煙熏法復制COPD大鼠模型［6］，方法如下：于第1、第14天氣管內(nèi)滴注LPS（0.1 mg/100 g），2～13 d、15～28 d每日上午在容積為48 L玻璃密閉箱內(nèi)持續(xù)熏蘭州牌香煙霧30 min，每日1次，1支/只。

2.2給藥 從造模第29天起，陽性對照組灌服蘇子降氣丸（相當原藥材1.08g/kg）、羅氟司特（0.045×10-3g/kg）；芪蛭小、中、大劑量組灌服芪蛭皺肺顆粒（分別相當于原藥材0.54、1.08、2.16g/kg）。每天灌服1次，連續(xù)14d。

2.3檢測指標

2.3.1大鼠臟器指數(shù)的檢測 稱定大鼠質(zhì)量，戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉，股動脈采血，處死，解剖，完整取出胸腺、脾臟、稱定質(zhì)量。按公式：脾（胸腺）指數(shù)（g/kg）=脾（胸腺）質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（kg）計算。

2.3.2血清中IFN-γ、IL-4的測定 股動脈采血，4℃，3000r/min，離心10min，制備血清，采用ELISA法檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.3.3肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4的水平測定 解剖出完整的肺和氣管，向左側(cè)肺葉緩慢注入0.9%生理鹽水3mL，再緩慢吸出，重復2次，回收灌洗液（BALF）約為4mL，無菌紗布過濾，置于離心管中，4℃、3000r/min，離心10min，取上清液，采用ELISA法檢測，按照試劑盒說明書進行。

2.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料均以±s表示，組間差異比較采用單因素方差分析，P＜0.05時表示差異有統(tǒng)計學意義。

3　實驗結(jié)果

3.1對臟器指數(shù)的影響 與空白組比較，模型組大鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)降低（P＜0.05）；與模型組比較，芪蛭皺肺顆粒大、中、小劑量組脾臟指數(shù)升高不顯著（P＞0.05），芪蛭皺肺顆粒大、中、小劑量組胸腺指數(shù)升高（P＜0.05），詳見表1。

表1　芪蛭皺肺顆粒對COPD模型大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)變化情況（±s，n=10）

注：與空白組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，●P＜0.05

組別動物數(shù)/只脾臟指數(shù)/（g·kg-1）胸腺指數(shù)/（g·kg-1）空白組102.11±0.250.67±0.10模型組101.69±0.10▲0.46±0.09▲羅氟司特組101.77±0.240.62±0.10●蘇子降氣組101.82±0.220.52±0.10芪蛭皺肺顆粒小劑量組101.85±0.450.57±0.11●芪蛭皺肺顆粒中劑量組101.88±0.270.61±0.14●芪蛭皺肺顆粒大劑量組101.79±0.160.59±0.09●

3.2對血清中IFN-γ、IL-4水平及其比值的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清IFN-γ/IL-4的比值明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，芪蛭皺肺顆粒大、小劑量組IFN-γ/IL-4的比值明顯升高（P＜0.05），詳見表2。

表2　各組大鼠血清中IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4值（±s）

表2　各組大鼠血清中IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4值（±s）

注：與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01

組別動物數(shù)/只IFN-γ/（ng·L-1）IL-4/（ng·L-1）IFN-γ/IL-4空白組1062.64±18.043.62±0.1817.42±5.48模型組1045.25±5.00▲4.71±1.19▲▲10.14±2.78▲▲羅氟司特組1058.10±18.623.60±0.31●●16.25±5.30●●蘇子降氣組1057.61±18.213.53±0.61●●16.29±4.97●●芪蛭皺肺顆粒小劑量組1058.00±17.894.12±0.94●14.44±4.80●芪蛭皺肺顆粒中劑量組1053.30±12.543.94±0.51●●13.62±3.15芪蛭皺肺顆粒大劑量組1057.74±15.284.02±0.37●14.52±4.49●

3.3大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4水平及其比值的影響

與空白組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ/IL-4的比值顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，芪蛭皺肺顆粒中劑量組IFN-γ/IL-4的比值顯著降低（P＜0.05）。詳見表3。

表3　各組大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4值（±s）

表3　各組大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4值（±s）

注：與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01

組別動物數(shù)/只IFN-γ/（ng·L-1）IL-4/（ng·L-1）IFN-γ/IL-4空白組896.18±29.143.46±0.2028.03±9.17模型組953.44±13.85▲▲3.84±0.58▲14.00±3.25▲▲羅氟司特組766.46±31.59●3.57±0.2218.71±8.82蘇子降氣組778.50±30.19●3.48±0.17●22.63±8.96●芪蛭皺肺顆粒小劑量組760.15±24.133.68±0.2016.54±7.01芪蛭皺肺顆粒中劑量組762.85±24.523.48±0.16●●18.01±6.72●芪蛭皺肺顆粒大劑量組751.48±10.183.66±0.1414.21±2.71

4　討論

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）主要病理表現(xiàn)為氣道的炎癥和炎性細胞的浸潤，從而出現(xiàn)肺泡炎和肺氣腫的表現(xiàn)［7-8］。COPD的確切發(fā)病機制目前尚不清楚，近年來研究發(fā)現(xiàn)COPD的發(fā)生主要與T淋巴細胞尤其是Th細胞有關(guān)。COPD氣道高炎癥反應主要是Th細胞的調(diào)節(jié)功能失衡所致［9］。在正常的生理情況下，Th1/Th2細胞因子處于相對平衡的狀態(tài)；當機體發(fā)生功能出現(xiàn)異常時，Th1/Th2細胞因子表達比例失衡，因而影響細胞因子的動態(tài)平衡。Th1/ Th2漂移相關(guān)的細胞因子參與肺組織炎癥反應的調(diào)節(jié)，導致COPD的發(fā)生、發(fā)展［10］。其中Th1介導與細胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應答，主要分泌INF-γ、IL-2、TNF-β等；Th2其主要功能為刺激B細胞增殖并產(chǎn)生抗體，參與體液免疫應答，主要分泌IL-4、IL-5、IL-6等；Th1/Th2的失衡在COPD氣道炎癥中主要表現(xiàn)為Th1功能低下，而Th2功能亢進［11-13］。本實驗模型組IFN-γ水平明顯降低，IL-4的水平明顯升高，IFN-γ/IL-4比值下降，存在IFN-γ功能低下，而IL-4功能亢進，致IFN-γ/IL-4的失衡，與以上文獻報道一致。

胸腺屬于中樞免疫器官，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠分泌多種細胞因子，是T細胞分化、發(fā)育的場所，促進T細胞成熟，在建立自身免疫耐受和維持免疫自穩(wěn)方面發(fā)揮重要作用。脾臟是最大的免疫器官，是細胞免疫和體液免疫的中心。胸腺和脾臟指數(shù)，反映機體免疫功能的改變，中藥可以提高免疫抑制小鼠的胸腺、脾指數(shù)［14-15］。本實驗模型組與正常組比較胸腺、脾指數(shù)均明顯降低。

COPD屬中醫(yī)學之“痰飲”、“虛喘”、“肺脹”等范疇，其病機特點乃本虛標實之證。正氣虛弱為本，與肺、脾、腎關(guān)系密切，涉及肝；痰飲、血瘀、氣滯等為標。故治療當根據(jù)其病機特點應扶正祛邪，標本兼顧，宜益氣培元、祛瘀化痰、理氣行滯，癟皺肺脹。芪蛭皺肺顆粒正是基于COPD的病機特點所凝練的防治方藥，該方由黃芪、黨參、麥冬、丹參等藥物組成，具有益氣培元、活血化瘀、癟皺肺脹之功用。本實驗結(jié)果表明，芪蛭皺肺顆粒能夠升高IFN-γ水平，降低IL-4的水平，升高IFN-γ/IL-4比值、胸腺指數(shù)與脾指數(shù)。提示芪蛭皺肺顆粒能夠提高IFN-γ功能低下，而抑制IL-4功能亢進，調(diào)節(jié)了IFN-γ/IL-4的失衡，從而減輕氣道炎癥浸潤，可能是芪蛭皺肺顆粒防治COPD的機制之一。

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R285.5

B

1001-1528（2015）01-0189-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.040

2014-06-11

甘肅省科技計劃（1011JKCA175，1212RJ2A074）；蘭州市第一批科技計劃（2009-1-141）；甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室開放基金（ZDSYS-KJ-2013-007）；甘肅省財政廳高?；究蒲袠I(yè)務費項目（2012-2）

張 毅（1978—），男，碩士，講師，主要從事道地藥材防治呼吸系統(tǒng)疾病的研究。Te1：13679400481，E-mai1：zhangyidxf @sina.com

李金田（1964—），男，碩士，教授，博士生導師，主要從事中醫(yī)藥防治呼吸系統(tǒng)疾病的研究。