醋蒸對南五味子木脂素類成分在大鼠肝臟分布的影響

鄧 翀，　鄭 潔，　姜 祎，　宋小妹

（1.陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西　咸陽　712046；2.漢中市3201醫(yī)院，陜西　漢中　723000）

［飲片炮制］

醋蒸對南五味子木脂素類成分在大鼠肝臟分布的影響

鄧 翀1，鄭 潔2，姜 祎1，宋小妹1

（1.陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西咸陽712046；2.漢中市3201醫(yī)院，陜西漢中723000）

目的 考察醋蒸對南五味子木脂素類化學(xué)成分在大鼠肝臟代謝的影響。方法 給大鼠分別灌服醋蒸和未醋蒸南五味子乙醇提取物，HPLC法測定不同時間點大鼠肝臟組織中的五味子酯甲和五味子甲素.采用DAS 2.0藥物代謝動力學(xué)分析軟件計算它們的藥代動力學(xué)參數(shù)，相對攝取率和峰濃度比。結(jié)果 和未醋蒸南五味子生品組比較，醋蒸南五味子的五味子酯甲和五味子甲素達峰時間較晚，半衰期延長，在肝臟的平均滯留時間明顯延長，Ka變小；另外，五味子酯甲和五味子甲素的相對攝取率和峰濃度比均大于1。結(jié)論 醋蒸過程延長南五味子中木脂素類成分在肝臟的滯留時間與南五味子“醋制入肝”的中藥炮制理論相一致。

醋蒸；南五味子；木脂素；五味子酯甲；五味子甲素；肝臟分布；大鼠

南五味子是木蘭科植物華中五味子Schisandrasphenanthera Rehd.Et Wi1s的干燥果實，傳統(tǒng)功效為收斂固澀、益氣生津、補腎寧心等［1］?，F(xiàn)代研究表明，南五味子的主要活性成分包括五味子甲素、五味子酯甲等聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素，并以五味子甲素、酯甲為主，對肝炎有較好的降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用，臨床應(yīng)用廣泛［2-5］。另一方面，中藥傳統(tǒng)炮制理論有“醋制入肝”之說，醋制引藥入肝經(jīng)，南五味子醋制可增強其降酶保肝的功效［6-7］?；诖耍狙芯恳源渍襞谥魄昂箫嬈瑸檠芯繉ο?，考察其主要活性化學(xué)成分五味子酯甲和五味子甲素在大鼠肝臟分布代謝特征，為進一步闡明醋蒸五味子“醋制入肝”炮制理論提供參考依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器和試劑 高效色譜儀（L-2130雙泵，L-2400檢測器，日本日立）；GB2042電子天平（瑞典薩多利斯公司）；LG15-W離心機（上海醫(yī)用離心機廠）；渦旋混合儀（上海瀘西分析儀器有限公司）；五味子酯甲﹙批號11529-200503）、五味子甲素（批號110764-200609）對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；烏來糖（中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號WS20050411）；乙腈和甲醇均為色譜純；水為重蒸餾水；其余試劑均為分析純。

1.2實驗動物 SD大鼠，7～8周齡，雌雄各半，清潔級，體質(zhì)量約（220±20）g，購自西安交通大學(xué)動物實驗中心（合格證2007-01）。

2　方法與結(jié)果

2.1對照品和受試藥物的配制 精密稱取南五味子醋制前后樣品粉末（60目篩）約500 g，16倍量55%乙醇回流提取2次，每次60 min，濾過，合并提取液濃縮至干［8］。經(jīng)檢測南五味子炮制前干膏樣品五味子酯甲含有量為0.832%，五味子甲素含有量為0.929 8%；炮制后干膏樣品五味子酯甲為0.895 1%，五味子甲素為0.990 3%（五味子酯甲和五味子甲素含有量是以生藥量進行計算）。

精密稱定5.64 mg五味子酯甲、6.08 mg五味子甲素，分別放置于25 mL量瓶中，95%乙醇溶解，然后定容至刻度，五味子酯甲和五味子甲素對照品溶液質(zhì)量濃度分別為0.225 6、0.243 2 mg/mL。

2.2樣品處理 精密稱取肝組織約2.0 g，加入4.0 mL生理鹽水破碎勻漿，制成質(zhì)量濃度為50%的肝組織勻漿液。精密量取肝組織勻漿液1.0 mL，放置到容積5 mL的圓底離心管里，先加入0.1 mL三氯乙酸，再加入2 mL乙醚進行提取，渦旋混合1 min，超聲1 min，以3 500 r/min離心10 min，分取上清液（乙醚層），沉淀部分再重復(fù)加入2 mL乙醚，按照上述步驟，一共用乙醚萃取3次，合并乙醚層。乙醚層用氮氣吹干（37℃），殘渣加0.2 mL甲醇復(fù)溶，以10 000 r/min離心10.0 min，然后進樣20μL進行HPLC分析。

2.3色譜條件 依利特ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～35min，55%～65%A；35～50 min，65%～70%A；50～65 min，70%～80%A）；體積流量0.8 mL/min；檢測波長230 nm。

2.4分析方法的確證

2.4.1方法的專屬性及檢測限 分別取1.0 mL空白對照肝組織液，混合對照品加空白對照肝組織液，大鼠給藥后的肝勻漿樣品（炮制前、后），按照“2.2”項方法處理樣品，進樣分析得色譜圖1。結(jié)果表明，組織中的內(nèi)源性物質(zhì)對五味子酯甲和五味子甲素的測定不干擾。

圖1　肝組織勻漿中的五味子酯甲和五味子甲素色譜Fig.1　Chromatograms of schisantherin and deoxyschizandrin in Iiver homogenate

2.4.2 標準曲線制備 取6份空白肝勻漿（每份1.0 mL），分別置于5 mL離心試管中，均加入適量五味子酯甲和五味子甲素混合對照品溶液，使勻漿液中五味子酯甲的質(zhì)量濃度分別為12.16、6.08、2.432、1.216、0.608、0.304μg/mL，五味子甲素的質(zhì)量濃度分別為11.28、5.64、2.256、1.128、0.564、0.282μg/mL，按照“2.2”項方法處理混合肝勻漿樣品，并在“2.3”項色譜條件下進樣10μL進行分析，采集色譜圖數(shù)據(jù)。把肝勻漿中五味子酯甲質(zhì)量濃度Ⅹ（μg/mL）對色譜峰面積Y作線性回歸，得標準曲線方程Y= 1 588 787 761Ⅹ+29 806，r=0.999 3，線性范圍為12.16～0.304μg/mL。以肝勻漿中五味子甲素質(zhì)量濃度Ⅹ（μg/mL）對色譜峰面積Y作線性回歸，得標準曲線方程：Y=233 168Ⅹ+65 550，r= 0.999 3，線性范圍為11.128～0.282μg/mL。

2.4.3精密度 取空白肝組織勻漿液加入適量五味子酯甲和五味子甲素混合對照品溶液，配制成高、中、低3個質(zhì)量濃度，肝組織勻漿液中五味子酯甲的質(zhì)量濃度分別為6.08、2.432、0.608 μg/mL，肝組織勻漿液中五味子甲素的質(zhì)量濃度分別為5.64、2.256、0.564μg/mL。

在1 d內(nèi)按“2.3”項色譜條件每一質(zhì)量濃度重復(fù)測定5次，計算出五味子酯甲的日內(nèi)RSD分別為1.4%、1.8%、1.8%，五味子甲素日內(nèi)RSD分別為0.7%、1.4%、0.9%。5 d內(nèi)分別相繼重復(fù)測定5次上述3個質(zhì)量濃度的肝組織樣品，先算出每一天的均值，再以5 d的平均值來計算出五味子酯甲的日間RSD分別為1.0%、2.1%、2.4%，五味子甲素日間RSD分別為1.0%、1.9%、1.8%。

2.4.4提取回收率和方法回收率 取低、中、高3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品（質(zhì)量濃度見“精密度”考察），每一質(zhì)量濃度制備5份生物樣本，按“生物樣品處理”項下方法操作，進樣分析得到各成分色譜峰面積A；再取上述相應(yīng)等質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，直接進樣分析得到色譜峰面積B，A與B的比值為提取回收率。根據(jù)當(dāng)日標準曲線計算的質(zhì)控樣品質(zhì)量濃度與配制生物樣品質(zhì)量濃度進行比較，得到相對回收率。低、中、高3個質(zhì)量濃度肝組織勻漿液中五味子酯甲和五味子甲素的提取回收率均在70.1%～92.6%之間，五味子酯甲和五味子甲素方法回收率均在87.2%～109.4%之間。RSD在15.0%以內(nèi)，表明檢測方法穩(wěn)定可行。

2.4.5穩(wěn)定性 取低、中、高3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品（質(zhì)量濃度見“精密度”考察），每一質(zhì)量濃度制備5份生物樣本，各質(zhì)量濃度樣品在-20℃冰箱中保存14 d，室溫下放置4 h反復(fù)凍融2次。按照“2.2”項方法處理混合肝勻漿樣品后室溫下放置8 h后，測定生物樣本中五味子酯甲和五味子甲素含有量。穩(wěn)定性結(jié)果表明，樣品中五味子酯甲和五味子甲素在上述條件下穩(wěn)定性良好，各組的RSD均小于10%，五味子酯甲和五味子甲素方法回收率均在87.2%～109.4%之間。

2.5實驗方案 本實驗中參考的成人（以60 kg計）臨床用量為0.1 g生藥/（kg·d），大鼠的用量為10 g生藥/（kg·d），相當(dāng)于成人臨床用量的100倍（前期預(yù)試結(jié)果）。提取物用0.5%的CMC-Na溶液配制成混懸液口服給藥。實驗分3組，即為：空白對照組、炮前給藥組和炮后給藥組。南五味子炮制前樣品等同給予五味子酯甲的量為83.2 mg/kg，五味子甲素的量為92.98 mg/kg；炮制后樣品相當(dāng)給予五味子酯甲的量為89.51 mg/kg，五味子甲素的量為99.03 mg/kg。

炮制前后各給藥組按各自給藥劑量口服給藥，分別在服藥后的0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、16、24 h時間點以10%烏來糖溶液麻醉動物（每一時間點平行取樣動物數(shù)為5只），腹部剖取肝組織，以生理鹽水洗去組織表面血漬，濾紙吸干表面水分，保存于-80℃冰箱待測。

2.6藥代動力學(xué)研究結(jié)果 以五味子酯甲和五味子甲素含有量為指標，監(jiān)測不同時間點的肝勻漿藥時濃度，計算出南五味子炮制前給藥組和炮制后給藥組各時間點下的肝勻漿藥時濃度平均值，結(jié)果見圖2。采用藥物代謝動力學(xué)分析軟件（DAS ver2.0版），來分析處理炮制前給藥組和炮制后給藥組不同時間點的肝勻漿平均濃度值，權(quán)重參數(shù)為1，計算出其藥代動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表1。

2.7結(jié)果分析 Re用來反映同一器官或組織中2種不同制劑的分布情況，計算公式：Re=（AUCi）實驗/（AUCi）對照，即同一器官或組織中實驗組和對照組的AUC之比。若Re＞1，表示藥物在該器官或組織中具有靶向性，反之則不具有靶向性［9］。Re值越大則靶向效果越好。Ce反映每個組織或器官的藥物分布的差異性，計算公式：Ce=（Cmax）實驗/（Cmax）對照，Ce值越大，代表藥物分布差異越大［10］。Ce和Re均大于1，就說明藥物在該組織中分布量多［11］。結(jié)果見表2。

圖2　炮制前給藥組和炮制后給藥組中五味子酯甲和五味子甲素的藥-時曲線比較Fig.2　Mean Iiver concentration-time curves of schisantherin and deoxyschizandrin after intragastric adm inistration of pre-processed and processed drug group

表1　五味子酯甲和五味子甲素的平均藥動學(xué)參數(shù)Tab.1 Average pharmacokinetic parameters of schisantherin and deoxyschizandrin

表2　五味子酯甲和五味子甲素在肝組織中的相對攝取率（Re）、峰濃度比（Ce）Tab.2 ReIative uptake rate（Re），ratio of peak concentration（Ce）at Iiver tissue of schisantherin and deoxyschizandrin

3　討論

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，大鼠口服給予南五味子生品后，肝組織在30 min可檢測出五味子酯甲和五味子甲素，說明五味子酯甲和五味子甲素到達大鼠肝臟速度較快。比較五味子酯甲和五味子甲素在生品組和醋制組中的各項藥代動力學(xué)參數(shù)可知：和南五味子生品組比較，醋制組藥物達峰時間（Tmax）較晚，半衰期（t1/2）延長，在肝臟的平均滯留時間（MRT）明顯延長，Ka變?。贿@些參數(shù)變化表明醋制過程減慢南五味子中五味子酯甲和五味子甲素在大鼠肝臟的吸收和代謝，延長了南五味子中五味子酯甲和五味子甲素在大鼠肝臟的滯留時間。南五味子醋制組中五味子酯甲和五味子甲素的平均藥時曲線下面積（AUC）均大于生品組，表明醋制南五味子的生物利用度高于南五味子生品。另外，從圖1可知炮制前后給藥組五味子酯甲、五味子甲素在肝內(nèi)分布過程存在雙峰甚至多峰現(xiàn)象，這可能與五味子酯甲、五味子甲素在吸收代謝中存在肝腸循環(huán)現(xiàn)象有關(guān)［12-13］。

本研究在數(shù)據(jù)評價方面引入了應(yīng)用生物藥劑學(xué)Re和Ce概念和方法，這兩個概念可以反映靶向制劑較普通制劑在某一臟器中的藥物濃度顯著提高直接反映了靶向制劑對某一臟器的靶向性顯著優(yōu)于普通制劑［14］?；诖耍狙芯恳韵鄬z取率（Re）、峰濃度比（Ce）的概念和方法，比較醋制南五味子中五味子酯甲、五味子甲素相對于其生品而言的相對攝取率（Re）、峰濃度比（Ce）差異，探討醋蒸過程對南五味子五味子酯甲、五味子甲素肝臟組織分布的影響。實驗結(jié)果表明，雖然五味子酯甲和五味子甲素的Ce和Re均大于1，但是僅五味子酯甲的Re較大，而五味子酯甲Ce和五味子甲素的Ce和Re分別為1.060±0.287、1.081±0.385、1.133±0.217，均與1差異不大，說明醋制炮制過程主要增強南五味子中五味子酯甲在肝臟分布，但對五味子甲素在肝臟的分布也有一定影響。本研究結(jié)果體現(xiàn)醋制對南五味子化學(xué)成分肝臟代謝規(guī)律有一定的影響，從而為探討南五味子“醋制入肝”炮制理論提供方法學(xué)參考。也將為建立歸經(jīng)理論與藥物靶向性分布相結(jié)合研究方法探討中藥“醋制入肝”的炮制原理，從而為科學(xué)詮釋“醋制入肝”中藥炮制理論提供研究思路和啟示。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：227-228.

［2］王曉明，劉學(xué)敏，張 疑.五味子的藥理作用研究［J］.北方藥學(xué)，2013，10（2）：72.

［3］宋平順，丁永輝，趙建邦.南五味子不同炮制品中五味子酯甲和五味子甲素含量的HPLC法測定［J］.中藥材，2008，31（5）：652-654.

［4］沈芳儀，葛海英，曾 嶸.異型南五味子醇提物對四氯化碳致大鼠急性肝損傷的保護作用［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（6）：232-235.

［5］曲 玲，郭蓮軍，呂 青，等.緋紅南五味子對大鼠四氯化碳肝損傷的保護作用［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2003，11（5）：278-279.

［6］楊掌利.淺議中藥醋制作用［J］.光明中醫(yī)，2012，27（10）：2123-2124.

［7］鄭 潔，張 萌，鄧 翀，等.從抗氧化角度評價南五味子“醋制入肝”的炮制機制［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，18（20）：189-192.

［8］鄧 翀，顏永剛，梁 婷，等.多指標綜合評價南五味子木脂素提取工藝［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（9）：4-6.

［9］郭東艷，楊大堅，陳士林.葛根素衍生物4ac納米粒在小鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)及組織分布考察［J］.中國中藥雜志，2010，35（22）：2029-2032.

［10］馬 麗，吳鴻飛，魯傳華，等.川芎嗪油基納米混懸劑在小鼠體內(nèi)的組織分布研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23（10）：2415-2417.

［11］平其能.現(xiàn)代藥劑學(xué)［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1998：616.

［12］陳 曦，馬越鳴，鐘 杰.藥物濃度-時間曲線雙峰現(xiàn)象研究進展［J］.中國新藥與臨床雜志，2012，31（8）：432-437.

［13］劉曉雪，陳 冰.與肝腸循環(huán)相關(guān)的轉(zhuǎn)運體及其基因多態(tài)性［J］.中國藥師，2013，16（4）：618-621.

［14］袁 東.引經(jīng)藥醋柴胡對大黃酸在大鼠體內(nèi)分布的影響［D］.廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2008.

The steaming Kadsura Japonica with vinegar on distribution of Iignans in Iiver of rat

DENG Chong1， ZHENG Jie2， JIANG Yi1， SONG Xiao-mei1
（1.Shaanxi University of Chinese Medicine，Ⅹianyang 712046，China；2.3201 Hospital in Hanzhong City，Hanzhong 723000，China）

AIM To study the effects of steaming Kadsura Japonicaon with vinegar on the metabo1ism of 1ignans in rat 1iver.METHODS Ratswere fed with ethano1ic extracts of steamed Kadsura Japonica with vinegar or ethano1ic extracts of Kadsura Japonica，and their 1iver tissues were co11ected at different time and the contents of schisantherin and deoxyschizandrin weremeasured by HPLC.The DAS 2.0 drug pharmacokinetic ana1ysis software was used to ca1cu1ate pharmacokinetic parameters，re1ative uptake rate and the peak concentration ratio.RESULTS Comparing the Kadsura Japonicaon without vinegar steaming，the contents of schisantherin and deoxyschizandrin reached peak time 1ater，ha1f-1ife and the average residence time in the 1iverwere extended with sma11er Ka.Additiona11y，both the re1ative uptake rate and the peak concentration ratio of schisantherin and deoxyschizandrin were 1arger than 1.CONCLUSION The process of steaming Kadsura Japonica with vinegar that cou1d extend the residence time of 1ignans is tune with the TCM concept of“steaming with vinegar he1p enter 1iver”.

steamingwith vinegar；Kadsura Japonicaon；1ignans；schisantherin；deoxyschizandrin；1iver distribution；rat

R283.1

A

1001-1528（2015）01-0145-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.030

2013-12-26

國家自然科學(xué)基金項目（30902002，81374028）；陜西省中醫(yī)藥管理局項目（13-ZY014）；陜西省重點科技創(chuàng)新團隊計劃（2013KCT-26）

鄧 翀（1978—），博士，副教授，研究方向：中藥炮制化學(xué)及中藥炮制原理。Te1：（029）38185165，E-mai1：fmmudz217@ 126.com