HPLC-UV法測定五味子中5-羥甲基糠醛

李 越，　安開龍，　李德坤，　楊悅武，　余伯陽，　鞠愛春*

（1.中國藥科大學(xué)，江蘇　南京　210009；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇　南京　210095；3.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，天津　300402）

HPLC-UV法測定五味子中5-羥甲基糠醛

李 越1，安開龍2，李德坤3，楊悅武3，余伯陽1，鞠愛春3*

（1.中國藥科大學(xué)，江蘇南京210009；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京210095；3.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，天津300402）

目的 建立五味子藥材中5-羥甲基糠醛（5-HMF）的定量測定方法。方法 采用HPLC-UV，Diamonsi1C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為甲醇-0.5%醋酸水（15∶85）；檢測波長284 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30℃。結(jié)果 5-羥甲基糠醛在1.14～18.21μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為100.1%，RSD為1.0%。五味子鮮果和干燥種子中均未檢出5-HMF，干燥果肉中5-HMF含有量較高，12批五味子中5-羥甲基糠醛的含有量范圍為0.09～2.40 mg/g。結(jié)論 五味子中的5-羥甲基糠醛主要是由五味子鮮果果肉在加熱烘干過程中產(chǎn)生，不同批號的五味子中5-HMF的量差異較大。

五味子；5-羥甲基糠醛；HPLC-UV

五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Bai11.為木蘭科五味子屬Schisandra多年生左旋落葉木質(zhì)藤本植物，其成熟果實(shí)干燥后作藥用，因其果實(shí)甘、酸、辛、苦、咸五味俱全，故名五味子［1］，主產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧等地，習(xí)稱“北五味子”。具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功能。用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、津傷口渴、短氣脈虛、內(nèi)熱消渴、心悸失眠等癥［2］。五味子多為9月前后成熟，為漿果，果實(shí)含水量較高，采收后需及時(shí)加工干燥以利于貯存保證藥材品質(zhì)。傳統(tǒng)多采用陰干、曬干等方式，因其需要大量勞動力且受天氣情況影響干燥過程不易控制，現(xiàn)多采用烘干的方式進(jìn)行干燥。但是不同的干燥時(shí)間和干燥溫度對藥材品質(zhì)具有重要影響［3］。

5-羥甲基糠醛（5-HMF），又稱5-羥甲基-2-糠醛，是由葡萄糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下產(chǎn)生的一個(gè)醛類化合物，是Mai11ard反應(yīng)的典型產(chǎn)物之一［4］，溫度對美拉德反應(yīng)的影響較大，5-HMF的含有量隨著溫度的升高呈上升趨勢［5-6］。文獻(xiàn)中表述該化合物對人體橫紋肌和內(nèi)臟有損害［7］，具有神經(jīng)毒性，能與人體蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生積蓄中毒，《中國藥典》2010年版二部中明確規(guī)定了它在含葡萄糖注射液中的限量［8］。此外，近年來也有研究表明，它具有抗氧化、抗心肌缺血、改變血液流變學(xué)等對人體有益的作用［9-10］。目前5-HMF測定主要為UV法和HPLC法［9］，五味子應(yīng)用廣泛，在加工干制的過程中會產(chǎn)生5-HMF。目前文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)五味子中5-HMF的定量測定多是以加熱煎煮提取5-HMF［3，11］，五味子藥材在加熱的過程中可能會產(chǎn)生新的5-HMF，造成測量結(jié)果不能客觀地反映原始藥材中5-HMF的量。因此，本實(shí)驗(yàn)采用冰浴超聲提取五味子藥材中的5-HMF，避免加熱對5-HMF含有量的影響，建立五味子藥材中5-HMF定量測定的HPLC法，為藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1　儀器和試藥

1.1儀器與試劑 Agi1ent1100型高效液相色譜儀（美國Agi1ent公司），萬分之一天平（AL204梅特勒-托利多儀器有限公司），十萬分之一天平（XS105梅特勒-托利多儀器有限公司），Mi11i-Q超純水機(jī)，電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司制造），超聲波清洗器（KQ5200型，昆山市超聲波儀器有限公司），L-550低速自動平衡離心機(jī)（長沙湘儀離心儀器有限公司），WK-200B高速藥物粉碎機(jī)（青州市精誠機(jī)械有限公司）。

5-HMF對照品（批號111626-201308，中國食品藥品檢定研究院），甲醇（色譜純），醋酸（色譜純），水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水，其他試劑均為分析純。

1.2藥材 五味子鮮果于2013年9月15日采自遼寧省新賓縣，五味子干燥果實(shí)、種子和果肉由鮮果在相同的條件下烘干而成，20081001等12批五味子藥材由天津天士力之驕藥業(yè)有限公司提供（產(chǎn)地遼寧），以上藥材經(jīng)中國藥科大學(xué)余伯陽教授鑒定。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Diamonsi1C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為甲醇-0.5%醋酸水（15∶85）等度洗脫；體積流量1 mL/min；檢測波長284 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL；外標(biāo)法定量。在本色譜條件下，5-HMF色譜峰分離較好。結(jié)果見圖1。

圖1　對照品（A）、樣品（B）和空白（C）HPLC圖譜Fig.1　HPLC chromatograms of reference substances（A）、sam p Ie（B）and b Iank（C）

2.2供試品溶液的制備 取五味子藥材粉末（過60目篩）約1.00 g，精密稱定，置離心管中，加入甲醇12 mL，冰浴超聲提取，每次25 min，共提取4次，合并提取液，離心，過濾，至50 mL量瓶中，用甲醇加至刻度，搖勻，過0.45μm濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3對照品溶液的制備 精密稱取5-HMF對照品6.07 mg置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻。從中精密吸取3 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即得，4℃儲藏備用。

2.4線性關(guān)系的考察 精密量取對照品貯備液，分別稀釋2、4、8、10、16、32倍，分別進(jìn)樣10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為A= 55 810C+1.092 1，r=0.999 9，5-HMF在1.14～18.21μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10μL，測定5-HMF的峰面積。測得5-HMF峰面積的RSD為0.2%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取新制的供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行色譜分析。測得5-HMF峰面積的RSD為1.0%。結(jié)果表明樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取樣品（批號20081001）6份，分別按“2.2”項(xiàng)下供試品制備方法和“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。測得5-HMF平均含有量為0.161 8mg/g，RSD為2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取9份已知含有量的五味子藥材粉末（批號20081001），每份0.50 g，精密稱定，根據(jù)其含有量的80%、100%、120%分別加入對照品貯備液1.8、2.2、2.7 mL，平行3份，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率和RSD值。結(jié)果表明其平均加樣回收率為100.1%，RSD為1.0%。具體結(jié)果見表1。

表1　5-HMF加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Resu Its of recovery tests for 5-HMF

2.9檢測限與定量限 在選定的色譜條件下，精密量取5-HMF對照品溶液適量，逐級稀釋進(jìn)樣。最終確定檢測限為0.04 ng（S/N=3），定量限為2.85 ng（S/N≥10）。

2.10樣品測定 分別按上述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，以峰面積代入回歸方程中計(jì)算5-HMF的量，結(jié)果見表2。

五味子鮮果和五味子干燥種子中未檢出5-羥甲基糠醛，五味子干燥果實(shí)和干燥果肉中均含有5-羥甲基糠醛，且干燥果肉中5-羥甲基糠醛含有量較高。檢測了2008—2013年的12批五味子干燥果實(shí)樣品，其含有量差異較大，范圍為0.09～2.40 mg/g。

表2　五味子不同部位及不同批號樣品中5-HM F測定結(jié)果（n=3）Tab.2 Content of 5-HMF in different parts and batches of Schisandra chinensis（n=3）

3　討論

3.1檢測波長的確定 采用PDA檢測器對5-HMF進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示5-HMF在284 nm有最大吸收波長，所以本實(shí)驗(yàn)選擇284 nm作為測定波長。另外，本實(shí)驗(yàn)采用PDA檢測器對樣品和對照品進(jìn)行了峰純度驗(yàn)證，結(jié)果表明在本實(shí)驗(yàn)所確定的檢測條件下，5-HMF峰不含其他干擾成分。

3.2提取方法的選擇 5-HMF的生成與溫度密切相關(guān)，溫度較高可能導(dǎo)致或加速美拉德反應(yīng)的發(fā)生［5-6，12］，所以沒有考慮熱提取的方法以避免加熱過程產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)考察了冰浴超聲提取法與冰浴振搖提取法，結(jié)果表明兩種方法相差不大，考慮到超聲提取法操作簡單故確定了本實(shí)驗(yàn)樣品制備方法。

3.3提取溶劑用量，提取時(shí)間，提取次數(shù)的選擇通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)最終確定溶劑用量為12倍甲醇，冰浴超聲提取4次，每次25 min。由于本實(shí)驗(yàn)超聲提取時(shí)間較長，為了驗(yàn)證5-HMF在提取條件下是否發(fā)生變化，將定容搖勻后的提取液，分別超聲0、30、60、90、120、150 min，測定，其RSD為0.5%，說明在本實(shí)驗(yàn)超聲提取過程中5-HMF未發(fā)生變化。

3.4色譜條件的選擇 選用了不同比例的甲醇-0.5%醋酸水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)比例為15∶85，10∶90和5∶95時(shí)5-HMF的分離效果和峰形沒有明顯區(qū)別，但是后兩者保留時(shí)間較長，為了節(jié)省分析時(shí)間，所以選擇甲醇-0.5%醋酸水（15∶85）為流動相。選擇了不同牌子的色譜柱XAqua C18（4.6 mm×250 mm，10μm），Diamonsi1C18（4.6 mm×250 mm，5μm）和Waters symmrtry C18（4.6 mm×250 mm， 5μm），發(fā)現(xiàn)Diamonsi1C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）峰形最好，所以選用Diamonsi1C18（2）色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm）。

3.5本實(shí)驗(yàn)分別用水、甲醇、不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇、乙酸乙酯冰浴超聲提取五味子新鮮果實(shí)1 h，以及用水冷浸24 h后再冰浴超聲提取1 h，均未檢出5-HMF，說明5-HMF并不是在五味子生長過程中產(chǎn)生的。對五味子干燥全果、果肉、種子的檢測發(fā)現(xiàn)種子中未檢出5-HMF，干燥后的果實(shí)和果肉中均檢出5-HMF，且果肉中5-HMF含有量較高，說明五味子藥材中的5-HMF主要來源于果肉部分，可能是由五味子果肉中的糖在加熱烘干的過程中產(chǎn)生，這有利于研究五味子中5-HMF的產(chǎn)生機(jī)理。不同批號的五味子藥材中5-HMF的含有量差異較大，可能是由于加工干制的過程中烘干時(shí)間和溫度等條件不統(tǒng)一，這說明對五味子藥材中5-HMF建立合適的限度標(biāo)準(zhǔn)，從而對規(guī)范五味子的加工干制過程和提高五味子藥材的質(zhì)量具有重要意義。

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Determ ination of 5-hydroxmethy IfurfuraI in Schisandra Chinensis Fructus by HPLC-UV

LIYue1， AN Kai-1ong2， LIDe-kun3， YANG Yue-wu3， YU Bo-yang1， JU Ai-chun3*
（1.China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；3.Tianjin Tasly Pride Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tianjin 300402，China）

AIM To estab1ish an HPLCmethod for determining 5-hydroxymethy1furfura1 in Schisandra Chinensis Fructus.METHOD The HPLC ana1ysiswas performed on a Diamonsi1C18（2）co1umn（4.6mm×250 mm，5 μm）and themobi1e phase consisted ofmethano1-0.5%acetic acid（15∶85）at a f1ow rate of 1.0 mL/min.The detection wave1ength was setat284 nm and the co1umn temperaturewasmaintained at30℃.RESULTS The 1inear range of 5-hydroxmethy1furfura1was in the range of 1.14-18.21μg/mL（r=0.999 9），average recovery was 100.1%，and RSD was 1.0%.5-HMF was undetected in fresh and dried seeds of S.chinensis Fructus，but their dried pu1ps presented the higher content.5-HMF content in 12 batches of S.chinensis Fructus was in the range of 0.086 1-2.395 8 mg/g.CONCLUSION The 5-HMF is produced in the process of heating dried of fresh pu1ps of Schisandra chinensis Fructus.5-HMF content ismain1y stemmed from the hot-processing pu1p of S.chinensis.There are significant differences of 5-hydroxmethy1furfura1 in Schisandra chinensis Fructus among different batches.

Schisandra chinensis Fructus；5-hydroxymethy1furfura1；HPLC-UV

R284.1

A

1001-1528（2015）01-0142-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.029

2014-03-01

李 越（1989—），女，碩士生，主要從事中藥質(zhì)量控制研究。Te1：（022）26736121，E-mai1：1iyuehappy@163.com

鞠愛春（1973—），男，副高級工程師，主要從事中藥注射劑工藝及質(zhì)量控制方向的研究。E-mai1：juach@tas1y.com