達原飲解熱作用研究及UPLC-Q-TOF/MS分析

任慧玲，　嚴 彪，　梁之桃，　趙中振，　董 燕，　張 健*

（1.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇　蘇州　215123；2.香港浸會大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中國　香港　999077）

達原飲解熱作用研究及UPLC-Q-TOF/MS分析

任慧玲1，嚴 彪1，梁之桃2，趙中振2，董 燕1，張 健1*

（1.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇蘇州215123；2.香港浸會大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中國香港999077）

目的 研究達原飲對LPS誘導(dǎo)的大鼠發(fā)熱模型的解熱作用及其機制，采用UPLC/Q-TOF-MS法分析達原飲乙醇提取物中的化學(xué)成分。方法 大鼠腹腔注射脂多糖（LPS）建立發(fā)熱模型，藥物處理后連續(xù)監(jiān)測體溫8 h，觀察大鼠體溫變化；運用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測血清IL-6、TNF-α水平，MPO試劑盒檢測肝組織MPO活性。采用UPLC/Q-TOF-MS法，分析達原飲乙醇提取物的化學(xué)成分。結(jié)果 達原飲對LPS引起的大鼠發(fā)熱具有明顯的解熱作用，顯著降低血清中TNF-α、IL-6水平及肝組織中的MPO活性。正離子模式下檢測出達原飲乙醇提取物中48個化合物。結(jié)論 達原飲具有顯著的解熱作用，其作用機制與降低血清中IL-6、TNF-α水平，降低肝組織中MPO活性有關(guān)。通過UPLC/Q-TOFMS分析，達原飲的主要化學(xué)成分為黃酮、皂苷、生物堿和有機酸類化合物。

達原飲；解熱；脂多糖（LPS）；UPLC/Q-TOF-MS

達原飲出自吳又可所著《瘟疫論》，由檳榔、厚樸、草果仁、知母、芍藥、黃芩、甘草七味藥物組成，用于瘟疫或瘧疾邪伏膜原之憎寒壯熱，胸悶嘔惡，頭痛煩躁，脈弦數(shù)，舌邊深紅、苔垢膩等癥，具有開達膜原、辟穢化濁之功［1］。目前，對達原飲臨床治療發(fā)熱的研究已有多篇報道，但作用機制不明［1-2］。本實驗通過建立大鼠發(fā)熱模型，研究達原飲的解熱作用，對其作用機制進行了初步探討，并采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)，通過與對照品比較，質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，參考相關(guān)文獻初步分析達原飲乙醇提取物的化學(xué)成分［3-12］，為進一步探討達原飲解熱功效的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1　解熱實驗

1.1材料和試劑

1.1.1動物 SPF級雄性SD大鼠50只，合格證號NO.SCXK（蘇）2009-0001。體質(zhì)量（200±10）g，自由飲食飲水，環(huán)境溫度控制于（28±0.5）℃。

1.1.2藥物及試劑 各味藥材均購買于蘇州市天靈中藥飲片有限公司（藥材提取物干燥后，混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中）；羧甲基纖維素鈉800～1200（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；阿司匹林（南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司，國藥準字H32026500）；脂多糖LPS 055：B5 L2880（Sigma公司）；MPO測試盒（南京建成賽浩科技有限公司）；大鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒（上海船夫貿(mào)易有限公司）；實驗用水為雙蒸水，生理鹽水。

1.1.3儀器 BT-A21型電子體溫計（深圳市福達康實業(yè)有限公司東莞分公司）；EL303電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；ME215P-OCE電子天平（德國Sartorius AG公司）；TGL-16B臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；ELx800酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；DL-360A超聲波清洗器（上海科島超聲儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1藥物的制備

1.2.1.1阿司匹林混懸液的配制 0.59 g/片，2片藥加50 mL生理鹽水，用玻棒搗碎，置于水浴振蕩器上震蕩溶解，過濾，制成20 mg/mL溶液，封口，滅菌，冰箱保存?zhèn)溆?；將LPS溶于無菌生理鹽水中，配成質(zhì)量濃度為20μg/mL的溶液。

1.2.1.2達原飲水提物制備 稱取檳榔（BL）28.6 g，厚樸（HP）14.3 g，知母（ZM）14.3 g，白芍（BS）14.3 g，黃芩（HQ）14.3 g，草果（CG）7.1 g，甘草（GC）7.1 g，用500 mL水提取，回流2 h，提取2次，合并，減壓濃縮干燥得達原飲水提物。

1.2.1.3達原飲乙醇提取物制備 稱取同樣質(zhì)量各味藥材，加入500 mL 95%乙醇回流提取2次，合并，減壓濃縮干燥得達原飲醇提物。

1.2.2實驗分組及給藥方法 造模前，每日早晚測量各組大鼠的肛溫，連續(xù)測定3 d，每次測之前電子體溫計探頭上涂凡士林，插入大鼠直腸2 cm，選取體溫在36.6～38.3℃，且連續(xù)體溫變化小于0.5℃的大鼠，取其平均值作為正?；A(chǔ)體溫。按照體溫基礎(chǔ)值和體質(zhì)量均衡隨機分成5組（每組10只）：空白組（A）、模型組（B）、達原飲水提物組（C）、達原飲醇提物組（D）、阿司匹林對照組（E）。B、C、D、E組腹腔注射LPS（100 μg/kg），A組注射同體積生理鹽水，30 min后，C、D組分別灌胃給達原飲水提物（936 mg/kg）和醇提物（365 mg/kg），相當(dāng)于生藥量4.2 g/kg、E組灌胃給藥阿司匹林（200 mg/kg），于給藥后1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8 h分別測定肛溫，記錄各組體溫數(shù)據(jù)，與基礎(chǔ)體溫比較，計算各時段溫差。各時段溫差=各時段體溫（℃）-基礎(chǔ)體溫（℃）。

1.2.3炎癥因子TNF-α和IL-6的測定 大鼠造模后8 h，眼眶取血，4℃1500×g離心20 min，取上清液備用。按試劑盒說明測定血清TNF-α和IL-6水平，酶標儀上讀取OD450。

1.2.4髓過氧化物酶（MPO）活性的測定 嚴格按試劑盒說明書進行操作，測定460 nm下吸光度（A）。MPO（U/g）=（測定管A-對照管A）/ 11.3×取樣量（g）。

1.3結(jié)果

1.3.1達原飲對LPS引起大鼠發(fā)熱模型的解熱效應(yīng) 達原飲對大鼠直腸溫度的影響，見圖1，空白組大鼠體溫在整個過程中體溫相對恒定。模型組（B）給予LPS 100μg/kg后，各鼠在3.5～4 h左右出現(xiàn)一個發(fā)熱峰，部份大鼠還出現(xiàn)不同程度腹瀉等癥狀，C、D、E組分別給達原飲水提物、達原飲醇提物和阿司匹林后，體溫明顯低于模型組。

1.3.2達原飲對LPS發(fā)熱大鼠血清TNF-α、IL-6及MPO的影響 結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組在腹腔注射LPS后，血清中IL-6、TNF-α和肝組織中MPO活性明顯增加，而達原飲則不同程度地降低TNF-α、IL-6及MPO的活性（P＜0.05），見表1。

圖1　達原飲對LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱反應(yīng)的影響（n=10）Fig.1　Effect of Dayuanyin on body tem perature in LPS-induced fever rats（n=10）

表1　達原飲對發(fā)熱大鼠血清及肝組織各致熱因子的影響（±s，n=10）Tab.1 Effect of Dayuanyin on pyrogenic factors in serum and Iiver tissue of LPS-treated rats（±s，n=10）

表1　達原飲對發(fā)熱大鼠血清及肝組織各致熱因子的影響（±s，n=10）Tab.1 Effect of Dayuanyin on pyrogenic factors in serum and Iiver tissue of LPS-treated rats（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，ΔP＜0.05

組別MPO/（U·g-1）TNF-α/（pg·mL-1）IL-6/（pg·mL-1）0.70±0.058 5.65±1.40 129.00±21.25模型組1.70±0.27*53.80±10.30*501.67±92.11*達原飲水提物組0.78±0.09Δ16.95±3.82Δ222.67±36.75Δ達原飲醇提物組1.14±0.23Δ34.05±8.45Δ373.67±55.63Δ阿司匹林對照組0.67±0.11Δ5.35±1.73Δ147.67±21.42空白組Δ

2　UPLC-Q-TOF/MS分析

2.1儀器和試藥 ACQUITY UPLC/Q-TOF MS系統(tǒng)（美國Waters公司），采用電噴霧電離（ESI），二元高壓泵，在線脫氣裝置，自動進樣器，數(shù)據(jù)采集與處理采用MassHunter軟件；UPLC C18分析柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm，ACQUITY UPLC BEH，Waters，USA）；數(shù)據(jù)采集與處理采用MassHunter軟件；所有試劑均為色譜純（E.Merck，Darmstadt，Germany），水為超純水系統(tǒng)制備得到（Mi11ipore，Bedford，MA，USA）。

氫溴酸檳榔堿、甘草苷、芒果苷、知母皂苷B-Ⅱ、黃芩苷、芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚對照品均購于成都瑾哲生物科技有限公司。

2.2樣品和對照品制備 稱取檳榔28.6 g，厚樸14.3 g，知母14.3 g，白芍14.3 g，黃芩14.3 g，草果7.1 g，甘草7.1 g，分別用500 mL 95%乙醇提取，回流提取2次。將提取液旋干，用甲醇超聲溶解，制成1 mg/mL的供試品溶液。分別稱取適量氫溴酸檳榔堿、甘草苷、芒果苷、知母皂苷B-Ⅱ、黃芩苷、芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚，加入甲醇配成相應(yīng)的溶液，量取上述溶液適量，混合均勻，配成含有上述各對照品質(zhì)量濃度為1 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3方法與條件

2.3.1色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫（0～18 min，2%～15%B；18～25 min，15%～35%B；25～30 min，35%～70%B；30～31 min，70%～100%B）；體積流量0.4 mL/min；柱溫20℃；進樣體積1.0μL。

2.3.2質(zhì)譜條件 Agi1ent 6540 accurate mass QTOF LC/MS（Agi1ent Techno1ogies，USA）系統(tǒng)，配有電噴霧離子源（正離子模式）和MassHunter數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，霧化氣溫度為300℃，霧化氣體積流量8.0 L/min，脫溶劑氣（N2）體積流量8.0 L/min，毛細管電壓為3 500 V（正離子模式），噴嘴電壓為500 V，掃描范圍m/z 100～1 700。

2.4結(jié)果 達原飲乙醇提取物的正離子模式下色譜圖見圖2，與平衡比較，對比所加對照品的BPC（base peak chromatogram）圖譜，參照各個藥材的圖譜，確定48個共有峰，并對各共有峰進行歸屬判斷，結(jié)果顯示，峰2、15、16、24、35、45為有機酸類化合物。峰1、4、6、8、14、43為生物堿類化合物，主要來源于厚樸、草果。峰18、36、39為甾體皂苷類化合物，主要來源于知母。峰27、40、41、42、48為三萜皂苷類化合物，主要來源于甘草。峰3、5、10、11、13、17、19、20、21、22、23、26、28、29、30、31、33、34、37、41為黃酮類化合物，主要來源于黃芩。分析各峰的質(zhì)譜圖，依據(jù)分子離子峰及碎片離子，參考相關(guān)文獻［3-12］，確定推測化合物，初步鑒定結(jié)果見表2。

圖2　BPC圖譜Fig.2　Peak numbers refered to base peak chromatogram

續(xù)圖2 BPC圖譜Fig.2　Peak numbers refered to base peak chromatogram

表2　達原飲UPLC-ESI-TOF/MS色譜圖中各峰的測定數(shù)據(jù)和鑒定結(jié)果Tab.2 M easurement data and the identification resu Its of Dayuanyin by UPLC-Q-TOF-MS

續(xù)表2

3　討論

解熱實驗中給予大鼠LPS 100μg/kg腹腔注射后，出現(xiàn)典型三相熱，其中以4 h的體溫上升最顯著，最大幅度達1.4℃，同時伴隨寒顫精神萎靡和腹瀉等癥狀，這與臨床感染的炎癥性發(fā)熱極其相似。但給予阿司匹林和達原飲治療后，LPS誘導(dǎo)的三相發(fā)熱反應(yīng)顯著降低，表明了阿司匹林和達原飲對LPS誘導(dǎo)的大鼠發(fā)熱反應(yīng)具有明顯抑制作用。MPO是存在于中性粒細胞與巨噬細胞嗜苯胺藍顆粒中的酶，發(fā)生炎癥時，可以被活化的中性粒細胞和巨噬細胞所釋放；因此，通過測量MPO活性可以間接判斷組織炎性細胞浸潤程度。實驗中發(fā)現(xiàn)，模型組在給予LPS 100μg/kg腹腔注射后，大鼠肝組織中MPO活性明顯升高，但經(jīng)達原飲治療后（實驗D、E組），在體溫下降的同時肝臟中MPO表達量也明顯降低［13］。腫瘤壞死因子（TNF-α）主要由巨噬細胞產(chǎn)生，為內(nèi)源性炎性致病因子，在炎癥反應(yīng)中起到重要作用［14］；IL-6是一種炎癥細胞因子，在發(fā)生炎癥等情況下，血清中IL-6會顯著增加。實驗中發(fā)現(xiàn)，模型組在給予LPS腹腔注射后，大鼠血清中TNF-α、IL-6水平及肝組織中的MPO活性明顯升高，但經(jīng)達原飲處理后則在體溫下降的同時血清中TNF-α、IL-6水平和肝臟中MPO表達量也明顯降低。由此推測，達原飲通過抑制外周肝組織炎癥反應(yīng)和降低內(nèi)源性炎癥細胞因子的分泌而產(chǎn)生解熱效應(yīng)。

本實驗通過對達原飲解熱作用的研究確定了其解熱作用，為了進一步確定活性成分，采用了液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對達原飲乙醇提取物中的化學(xué)成分進行了分析，在高效分離的基礎(chǔ)上，測定了部分成分的相對分子質(zhì)量，對達原飲的主要化學(xué)成分進行了初步研究。實驗結(jié)果表明復(fù)方達原飲中的化學(xué)成分主要為黃酮、皂苷、生物堿和有機酸類。黃芩的主要活性成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和漢黃芩苷等黃酮類化合物，其中，黃芩素和黃芩苷具有一定的解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用，其作用機制主要與抑制PGE2分泌，抑制核因子的活性以及細胞因子的分泌具有密切的關(guān)系［15-16］。知母中的知母皂苷B-Ⅱ具有體外抗炎活性，在mRNA和蛋白表達水平可抑制IL-1、TNF-α和IL-6等炎癥因子的生成，同時抑制細胞核因子-B（NF-κB）和促細胞分裂劑激活性蛋白激酶（p38MAPkinase）的激活［17］。甘草中的甘草酸、甘草多糖和甘草黃酮類化合物具有抗炎活性［18］。此外，白芍［19］和草果［20］也具有抗炎作用。藥理實驗結(jié)果表明達原飲可能是通過抑制外周肝組織炎癥反應(yīng)和降低內(nèi)源性炎癥細胞因子的分泌而產(chǎn)生解熱效應(yīng)。而達原飲的UPLC-Q-TOF/MS化學(xué)成分分析也表明，達原飲含有大量來源于黃芩的黃酮類化合物、及知母中知母皂苷B-Ⅱ等，由此，我們推測達原飲發(fā)揮解熱作用的化學(xué)成分可能主要來源于黃芩中的黃酮類化合物，知母中的知母皂苷B-Ⅱ等。對比各味藥與達原飲的色譜圖，發(fā)現(xiàn)單味藥中的許多峰在達原飲中并沒有出現(xiàn)，這可能由于這些成分量太低未被檢測出。通過對比達原飲水提物和醇提物的液相色譜圖，發(fā)現(xiàn)醇提物與水提物所含化學(xué)成分總數(shù)基本一致，而且醇提物含有量較水提物高，有利于準確推斷可能的有效成分，因此采用UPLC-Q-TOF/MS分析其乙醇提取物中的化學(xué)成分。目前，課題組正在對達原飲水提物進行處理，將利用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)結(jié)合藥理實驗，進一步確定達原飲的解熱活性部位，分析其藥效成分。

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AntifebriIe effect of Dayuanyin and its determ ination by UPLC/Q-TOF-MS

REN Hui-1ing1， YAN Biao1， LIANG Zhi-tao2， ZHAO Zhong-zheng2， DONG Yan1， ZHANG Jian1*
（1.College of Pharmaceutical Science，Soochow University，Suzhou 215123，China；2.School of Chinese Medicine，Hong Kong Baptist University，Kowloon，Hong Kong Special Administrative Region，999077，China）

AIM To observe the effect of Dayuanyin on LPS-induced febri1e response in rats and e1ucidate the antipyreticmechanism of Dayuanyin，and to ana1yze the chemica1 composition in ethano1 extract of Dayuanyin by UPLC/Q-TOF-MS.M ETHODS Fever was induced by intraperitonea11y injecting LPS（100μg/kg），and the temperaturewas observed for8 h，and the changes of temperaturewere observed.IL-6，TNF-α1eve1s and 1iver tissue MPO 1eve1s in ce11supernatantwere detected.Chemica1compositions of Dayuanyin were ana1yzed by UPLC/QTOF-MS.RESULTS Dayaunyin had significant antipyretic effect on rats induced by LPS，cou1d reduce the 1eve1 of TNF-αand IL-6 in serum，and decrease the activity ofMPO in 1iver tissue.Forty-eight compounds in the ethano1 extract of Dayuanyin had been detected in the positive ionmode.CONCLUSION Dayaunyin has significant antipyretic effect by decreasing the 1eve1of IL-6 and TNF-αin serum and reducing the contentof MPO in 1iver tissue. Ana1yzed by UPLC/Q-TOF-MS，themain chemica1compositions of Dayuanyin are f1avonoids，saponins，a1ka1oids，organic acids.

Dayuanyin；antipyretic effect；1ipopo1ysaccharide（LPS）；UPLC/Q-TOF-MS

R284.1

A

1001-1528（2015）01-0131-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.027

2014-01-16

江蘇省優(yōu)勢學(xué)科項目資助（2011）

任慧玲（1991—），女，碩士生。Te1：15295673203，E-mai1：renhui1ing91@163.com

張 ?。?975—），女，博士，副教授，從事天然藥物活性研究。Te1：13814875226，E-mai1：jianzhang@suda.edu.cn