HPLC法測定藏藥五味甘露藥浴顆粒中槲皮素、山柰素和鹽酸麻黃堿

馮 欣，　周 剛，　王 茜，　登巴達(dá)吉*

（1.中國藏學(xué)研究中心藏醫(yī)藥研究所，北京　100101；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)食品藥品檢驗所，內(nèi)蒙古　呼和浩特　010020）

HPLC法測定藏藥五味甘露藥浴顆粒中槲皮素、山柰素和鹽酸麻黃堿

馮 欣1，周 剛2，王 茜1，登巴達(dá)吉1*

（1.中國藏學(xué)研究中心藏醫(yī)藥研究所，北京100101；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)食品藥品檢驗所，內(nèi)蒙古呼和浩特010020）

目的 采用RP-HPLC法測定藏藥五味甘露藥浴顆粒（麻黃、刺柏、大籽蒿、水柏枝、烈香杜鵑）中槲皮素、山柰素和鹽酸麻黃堿的量。方法 槲皮素、山柰素的測定，采用Zorbax SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（20∶80）；檢測波長360 nm；體積流量1.0mL/min；柱溫30℃。鹽酸麻黃堿的測定，流動相為乙腈-0.092%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）（1.5∶98.5）；檢測波長為210 nm；體積流量1.0 mL/min。結(jié)果 槲皮素、山柰素分別在0.019 8～0.990 0μg（r=0.999 8）、0.014 4～0.721 2μg（r=0.999 9）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為97.5%、99.3%，RSD分別為1.4%、1.6%（n=6）。鹽酸麻黃堿在0.016 592～0.248 9μg（r=0.999 9）范圍內(nèi)線性良好。平均回收率為101.4%，RSD為1.4%（n=6）。結(jié)論 本方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于該藥的質(zhì)量控制。

槲皮素；山柰素；鹽酸麻黃堿；五味甘露藥浴顆粒；藏藥

“五味甘露藥浴”最早記載于著名藏醫(yī)經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》［1］中，是由麻黃、刺柏、大籽蒿、水柏枝、烈香杜鵑五味藥組成的復(fù)方制劑，臨床中主要用于治療四肢僵直、關(guān)節(jié)腫痛、肌肉萎縮等“黃水”疾病，但此藥禁忌對高血壓、心臟病、高燒等患者進(jìn)行治療。該藥的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油類、黃酮類、萜、生物堿類。該藥品目前的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅收載定性鑒別和薄層掃描法測定鹽酸麻黃堿的量，操作繁瑣，且準(zhǔn)確性差，因此本實驗采用HPLC法測定了大籽蒿、烈香杜鵑中黃酮類成分槲皮素、山柰素的量，修訂了麻黃中鹽酸麻黃堿的定量測定方法，從而為完善該藏藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1　儀器與試藥

U1tiMate 3000高效液相色譜儀系統(tǒng)（Chrome-1eon c1ient色譜工作站）；Chrome1eon 6.80變色龍軟件；U1tiMate 3000 Variab1e Wave1ength Detector二極管陣列檢測器；U1tiMate 3000 Pump泵；U1tiMate 3000 Autosamp1er自動進(jìn)樣器；U1tiMate 3000 RS Co1umn Compartment柱溫箱；槲皮素對照品（批號100081-200406）、山柰素對照品（批號086-200002）、鹽酸麻黃堿（批號171241-200506）均購于中國食品藥品檢定研究院；五味甘露藥浴顆粒（西藏奇正藏藥股份有限公司生產(chǎn)，批號分別為Z20110915、Z20120121、Z20120709）；甲醇（色譜純，J.T.Baker公司，批號112700471）；高純水（自制）；磷酸（天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司，批號20110104）；乙腈（色譜純，CALEPURE公司，批號70145）；三乙胺、二正丁胺為AR級。

2　方法與結(jié)果

2.1槲皮素、山柰素的測定

2.1.1供試品溶液的制備［2-7］取本品粉末（過三號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2對照品溶液的制備 精密稱取120℃干燥4 h的槲皮素、山柰素對照品0.024 75 g、0.009 02 g，置同一50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1.0 mL置25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL分別含槲皮素19.8μg、山柰素7.2μg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3陰性對照溶液的制備 按五味甘露藥浴顆粒處方比例稱取適量除烈香杜鵑、大籽蒿的其余藥味，按五味甘露藥浴顆粒的前處理和制劑生產(chǎn)工藝制成缺烈香杜鵑、大籽蒿的五味甘露藥浴的陰性樣品，再按“2.1.1”項制備陰性供試品溶液并測定，結(jié)果空白溶液在與槲皮素、山柰素對照品相同保留時間處均未顯色譜峰，故認(rèn)為無干擾。見圖1。

圖1　槲皮素山柰素HPLC色譜圖Fig.1　HPLC chromatograms of quercetin and kaempferoI

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取槲皮素、山柰素對照品溶液0.2、1、2、3、4、5、10 mL置50 mL量瓶中加甲醇至刻度，搖勻。在上述條件下分析，以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫座標(biāo)，峰面積為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。槲皮素回歸方程Y= 2.395×106Ⅹ-1.410×103，r=0.999 8；山柰素回歸方程Y=2.332×106Ⅹ+5.570×103，r= 0.999 9。結(jié)果表明，槲皮素在0.019 8～0.990 0 μg范圍內(nèi)線性良好，山柰素在0.014 4～0.721 2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，求得槲皮素RSD為0.2%，山柰素RSD為0.2%。

2.1.6穩(wěn)定性試驗 在室溫下，將同一供試品溶液（批號Z20110915）分別于配制后0、2、4、6、12、24 h，進(jìn)行測定，結(jié)果槲皮素RSD為0.9%，山柰素RSD為0.4%。

2.1.7重復(fù)性試驗 取同一供試品（批號Z20110915）5份，分別處理測定5次，求得槲皮素RSD為1.8%，山柰素RSD為1.4%。

2.1.8加樣回收試驗 精密稱取已知含有量（槲皮素1.073 8 mg/g，山柰素0.201 6 mg/g）的同一批號供試品（批號Z20110915）0.5 g，精密加入含槲皮素20.06μg/mL、山柰素4.02μg/mL的混合對照品甲醇溶液25 mL，按供試品溶液的方法制備，進(jìn)樣10μL，計算回收率，結(jié)果槲皮素平均回收率為97.5%，RSD為1.4%，山柰素平均回收率為99.3%，RSD為1.6%。具體見表1、表2。

表1　槲皮素回收率試驗（n=6）Tab.1 Resu Its of recovery tests for quercetin（n=6）

表2　山柰素回收率試驗（n=6）Tab.2 Resu Its of recovery tests for kaem pferoI（n=6）

2.2鹽酸麻黃堿的測定

2.2.1供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率600W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用1.44%磷酸溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿對照品0.010 37 g，置50 mL量瓶中，加1.44%磷酸溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5.0 mL置25 mL量瓶中，加1.44%磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含鹽酸麻黃堿41.48μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3陰性對照溶液的制備 按五味甘露藥浴顆粒處方比例稱取適量除麻黃的其余藥味，按五味甘露藥浴顆粒的前處理和制劑生產(chǎn)工藝制成缺麻黃的五味甘露藥浴的陰性樣品，再按“2.2.1”項制備陰性樣品溶液并測定，結(jié)果陰性樣品溶液在與鹽酸麻黃堿對照品相同保留時間處均未顯色譜峰，故認(rèn)為無干擾。見圖2。

圖2　鹽酸麻黃堿HPLC色譜圖Fig.2　HPLC chromatogram s of ephedrine hydroch Ioride

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取鹽酸麻黃堿對照品溶液1、2、4、5、10、15 mL置25 mL量瓶中加1.44%磷酸溶液至刻度，搖勻。在上述條件下分析，以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫座標(biāo)，峰面積為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。鹽酸麻黃堿回歸方程Y=9.467×106Ⅹ-8.879×102，r=0.999 9。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿在0.016 592～0.248 9μg范圍內(nèi)線性良好。

2.2.5精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，求得鹽酸麻黃堿RSD為1.0%。

2.2.6穩(wěn)定性試驗 在室溫下，將一供試品溶液分別于配制后0、2、4、6、12、24 h，進(jìn)行測定，結(jié)果鹽酸麻黃堿RSD為1.5%。

2.2.7重復(fù)性試驗 取同一供試品（批號Z20110915）5份，分別處理測定5次，求得鹽酸麻黃堿RSD為1.1%。

2.2.8加樣回收試驗 精密稱取已知含有量（鹽酸麻黃堿0.201 6 mg/g）的同一批號供試品（批號Z20110915），精密加入鹽酸麻黃堿（1.037 μg/mL）對照品1.44%磷酸溶液50 mL，按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣10μL，計算回收率，結(jié)果鹽酸麻黃堿平均回收率為101.4%，RSD為1.4%。結(jié)果見表3。

表3　鹽酸麻黃堿回收率試驗（n=6）Tab.3 ResuItsofrecoverytestsforephedrinehydrochIoride（n=6）

2.3樣品測定 3批樣品，各按“2.1”項及“2.2”項進(jìn)行操作，制備成供試品溶液，測定，結(jié)果見表4。

表4　樣品測定結(jié)果（n=3）Tab.4 ResuItsofsampIedetermination（n=3）

3　討論

3.1藏藥制劑中處方藥物組成多、成分復(fù)雜，選擇合適的提取方法是質(zhì)量分析的關(guān)鍵。本實驗選擇甲醇、80%甲醇、50%甲醇、乙醇，分別采用超聲不同時間（15、30、60min）、加熱回流60min進(jìn)行提取，結(jié)果采用甲醇回流60min樣品中槲皮素、山柰素的峰型較好，雜峰干擾較小，提取完全。

3.2本實驗前期先測定烈香杜鵑中槲皮素和山柰素的量，在陰性對照中出現(xiàn)槲皮素峰，通過試驗，發(fā)現(xiàn)烈香杜鵑和大籽蒿中均含有槲皮素，因此最后測定成藥的總槲皮素、山柰素量［8-13］。

3.3鹽酸麻黃堿測定參考《中國藥典》2010年版，考察了回流提取30min，超聲處理20min、30、60min進(jìn)行提取，結(jié)果采用1.44%磷酸溶液超聲處理30min即可以達(dá)到提取完全［2］。

3.4采用HPLC法測定鹽酸麻黃堿的量，方法準(zhǔn)確度更高，且鹽酸麻黃堿作為一個特殊管理的化學(xué)物質(zhì)，應(yīng)該在生產(chǎn)中嚴(yán)格管控。

［1］納順達(dá)來，賽西婭.試述五味甘露藥?。跩］.中國民族醫(yī)藥雜志，2006，12（6）：47.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：296.

［3］徐 飛，陸兔林，謝 輝.HPLC測定復(fù)方銀杏顆粒中槲皮素、山柰素、異鼠李素及總黃酮醇苷含量［J］.中成藥，2007，29（11）：1617.

［4］楊立昌，乙 引，林俊清，等.RP-HPLC測定苗藥黑白保肝清顆粒中槲皮素的含量［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（11）：64.

［5］梁 潔，柳賢福，孫正伊，等.HPLC測定魚腥草配方顆粒中槲皮素含量［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（11）：140.

［6］尹 玲，馮 蕓，吳 姍，等.HPLC法測定菝葜提取物中槲皮素的含量［J］.中國藥房，2010，21（35）：3312.

［7］許乾麗，鮑家科，茅向軍，等.HPLC測定杠板歸中槲皮素的含量［J］.中國中藥雜志，2009，34（16）：2105.

［8］宋 勤，楊理明.HPLC法測定消渴降糖膠囊中槲皮素的含量［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2011，（1）：50.

［9］杜小偉，王京輝，肖斯婷，等.HPLC測定不同產(chǎn)地羅布麻葉中槲皮素、山柰素的含量［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，1（20）：51.

［10］黃興富，黎其萬，劉宏程，等.高效液相色譜法同時測定苦蕎中蘆丁、槲皮素和山柰酚的含量［J］.中成藥，2011，33（2）：158-160.

［11］黃茲英，王繼良，黃敏潔，等.HPLC法同時測定夏枯草中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰酚［J］.中成藥，2012，34（3）：137-140.

［12］黃俊忠，曾小平.HPLC法同時測定田七痛經(jīng)膠囊中異鼠李素、槲皮素、山柰素［J］.中成藥，2012，34（10）：76-79.

［13］周逸芝，劉訓(xùn)紅，陳 菲，等.高效液相色譜法同時測定龍柴方中槲皮素、山柰素、異鼠李素［J］.中成藥，2013，35（10）：103-106.

Determ ination of quercetin，kaem p feroIand ephedrine hydroch Ioride in W uwei Gan Iu Yaoyu Granu Ies by HPLC

FENG Xin1， ZHOU Gang2， WANG Qian1， DENG-ba-da-ji*
（1.Tibetan Medicine Institute，China Tibetology Research Center，Beijing 100101，China；2.HohhotCity in Inner Mongolia AutonomousRegion Institute for Food and Drug Control，Hohhot010020，China）

quercetin；kaempfero1；ephedrine hydroch1oride；Wuwei Gan1u Yaoyu Granu1es；Tibetmedicine

R927.2

A

1001-1528（2015）01-0120-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.024

2014-03-23

馮 欣（1982—），男，助理研究員，從事藏藥研究。Te1：（010）64972883，E-mai1：fengxin0303@163.com

登巴達(dá)吉（1959—），男（藏），研究員，從事藏醫(yī)藥研究。E-mai1：dbdj2009@1ive.cn