HPLC法同時測定尿毒靈灌腸液中的地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新婦苷和白藜蘆醇

吳建華，　李玉山

（1.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院，湖北　恩施　445000；2.湖北民族學(xué)院，湖北　恩施　445000）

HPLC法同時測定尿毒靈灌腸液中的地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新婦苷和白藜蘆醇

吳建華1，李玉山2*

（1.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院，湖北恩施445000；2.湖北民族學(xué)院，湖北恩施445000）

目的 建立同時測定尿毒靈灌腸液中地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新婦苷和白藜蘆醇方法。方法HPLC法采用依利特Hypersi1C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5μm）；流動相A為甲醇-乙腈（1∶1），流動相B為0.5%磷酸溶液；體積流量1.2 mL/min；地榆皂苷-Ⅰ和地榆皂苷-Ⅱ的檢測波長為203 nm，花旗松素和落新婦苷的檢測波長為289 nm，白藜蘆醇的檢測波長為306 nm。結(jié)果 地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新婦苷和白藜蘆醇分別在0.072 8～1.456 0μg（r=0.999 7）、0.037 4～0.748 0μg（r=0.999 8）、0.012 6～0.252 0μg（r= 0.999 3）、0.086 2～1.724 0μg（r=0.999 9）、0.035 6～0.712 0μg（r=0.999 5）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新婦苷和白藜蘆醇的平均加樣回收率分別為98.6%、97.6%、96.9%、99.1%、98.4%，RSD（n=6）分別為0.8%、0.7%、0.7%、0.6%、0.5%。結(jié)論 本法所測5個組分均能達(dá)到基線分離，各組分峰型良好，分離度均大于2。

尿毒靈灌腸液；地榆皂苷-Ⅰ；地榆皂苷-Ⅱ；花旗松素；落新婦苷；白藜蘆醇

尿毒靈灌腸液處方源自國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二十冊，由甲組和乙組兩部分組成。甲組為灰綠色的粉末，味淡。由地榆、土茯苓、大黃、連翹、龍骨（煅）、蒺藜、牡蠣（煅）、丹參、桂枝、槐米、鉤藤、青黛、梔子、黃柏、金銀花等15味藥物組成，是方中的主組分。乙組為棕褐色的液體，味淡。由生曬參、麥冬、枸杞、白茅根、紅花5味藥物組成，是方中的輔助成分。尿毒靈灌腸液具有通腑泄?jié)?、利尿消腫的功效，可用于全身浮腫，惡心嘔吐，大便不通，無尿少尿，頭痛煩躁，舌黃，苔膩，脈實(shí)有力，以及各種原因引起的腎功能衰竭、氮質(zhì)血癥及腎性高血壓等癥的治療。原部頒標(biāo)準(zhǔn)中僅對方中部分藥材進(jìn)行了定性鑒別，未對方中的任何藥物進(jìn)行成分定量測定［1-2］，不能有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量和療效，同時地榆皂苷-Ⅰ和地榆皂苷-Ⅱ?yàn)榈赜艿闹饕煞郑ㄆ焖伤?、落新婦苷、白藜蘆醇為土茯苓的主要成分和有效成分［3］，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相梯度洗脫法對尿毒靈灌腸液中地榆中的地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ和土茯苓中的花旗松素、落新婦苷、白藜蘆醇進(jìn)行定量測定方法研究，為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1　試藥與儀器

1.1儀器 Agi1ent 1200高效液相色譜儀，G1311A四元泵、G1330B自動進(jìn)樣器恒溫器、G1322A脫氣機(jī)、Chemstation色譜工作站、G1315B可變波長檢測器，XP205型梅特勒電子天平（精度：0.01 mg）。

1.2試藥 地榆皂苷-Ⅰ對照品（批號111952-201301，純度95.1%）、花旗松素對照品（批號111816-201102，純度98.9%）、落新婦苷（批號111798-201303，純度92.4%）、白藜蘆醇（批號111535-200502，純度100.0%）均購于中國食品藥品檢定研究院；地榆皂苷-Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?5286-59-0，純度98.0%）購于上海田源生物技術(shù)有限公司；尿毒靈灌腸液（市售；甲組每瓶裝20 g，乙組每瓶裝200 mL；批號分別為20140101、20140102、20140103）；甲醇、乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；磷酸（分析純，廣州化學(xué)試劑二廠）。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件 依利特Hypersi1 C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5μm）；體積流量1.2 mL/min；流動相A為甲醇-乙腈（1∶1），流動相B為0.5%磷酸溶液［4-7］，梯度洗脫（0～10 min，45.0%A；10～27 min，45.0%→60.0%A；27～40 min，60.0%A；40～45 min，60.0%→45.0% A）；檢測波長（0～27 min，λ1=203 nm［8-9］；27～35 min，λ2=289 nm［10］；35～45 min，λ3= 306 nm［11］）；進(jìn)樣量10μL。此系統(tǒng)條件下所測組分與其他組分分離效果良好，理論塔板數(shù)按花旗松素計(jì)不得低于3 000，分離度均大于2。

2.2樣品制備

2.2.1混合對照品溶液配制 精密稱取5種對照品地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新婦苷和白藜蘆醇各適量，分別置于5個20 mL量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密吸取上述溶液10、5、2、10、5 mL置于50 mL量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液（地榆皂苷-Ⅰ為0.072 8 mg/mL，地榆皂苷-Ⅱ?yàn)?.037 4 mg/mL，花旗松素為0.012 6 mg/mL，落新婦苷為0.086 2 mg/mL，白藜蘆醇為0.035 6 mg/mL）。

2.2.2供試品溶液的制備 取本品甲組成分適量，研細(xì)，混勻，稱取約1.0 g，精密稱定，精密加入60%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲波（功率160 W，頻率50 kHz）超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3陰性對照試驗(yàn) 按尿毒靈灌腸液處方比例稱取除地榆的其余藥味和除土茯苓的其余藥味各一份，按尿毒靈灌腸液的制備工藝分別制成地榆空白樣品和土茯苓空白樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成地榆空白溶液和土茯苓空白溶液。分別精密吸取10 μL的供試品溶液、混合對照品溶液、地榆空白溶液及土茯苓空白溶液，按上述方法測定，結(jié)果顯示各待測組分分離效果良好，陰性樣品無干擾。見圖1。

圖1　地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新婦苷和白藜蘆醇的HPLC圖譜Fig.1　HPLC of ziyu-gIycosideⅠ，ziyu-gIycosideⅡ，taxifoIin，astiIbin and resveratroI

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液1.0、5.0、10.0、15.0、20.0μL，依次注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行分析測定，以峰面積Y與進(jìn)樣量Ⅹ進(jìn)行線性回歸，得地榆皂苷-Ⅰ回歸方程為：Y=3.151 6×106Ⅹ-415.7，r=0.999 7，線性范圍為0.072 8～1.456 0μg；地榆皂苷-ⅡY=2.304 2×106Ⅹ+197.5，r=0.999 8，線性范圍為0.037 4～0.748 0μg；花旗松素Y=1.298 1×106Ⅹ-263.6，r=0.999 3，線性范圍為0.012 6～0.252 0 μg；落新婦苷Y=3.361 9×106Ⅹ+513.8，r= 0.999 9，線性范圍為0.086 2～1.724 0μg；白藜蘆醇Y=2.611 9×106Ⅹ+394.1，r=0.999 5，線性范圍為0.035 6～0.712 0μg。結(jié)果表明：各成分在對應(yīng)的線性范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.2精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對照品溶液按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取混合對照品溶液10μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測得5種成分的峰面積，計(jì)算各成分相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD分別為0.5%（地榆皂苷-Ⅰ）、0.9%（地榆皂苷-Ⅱ）、0.9%（花旗松素）、0.4%（落新婦苷）和0.8%（白藜蘆醇）。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批號供試品（批號131201），按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件依法進(jìn)樣測定，計(jì)算各成分含有量和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD分別為0.5%（地榆皂苷-Ⅰ）、0.8%（地榆皂苷-Ⅱ）、0.9%（花旗松素）、0.3%（落新婦苷）和0.7%（白藜蘆醇）。結(jié)果表明，本法測定重復(fù)性良好。

2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批樣品（批號131201）的同一供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后，每次進(jìn)樣10μL，測定其峰面積值，求得各組分RSD分別為0.5%（地榆皂苷-Ⅰ）、0.8%（地榆皂苷-Ⅱ）、0.9%（花旗松素）、0.4%（落新婦苷）和0.6%（白藜蘆醇）。表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的同一批（批號131201）尿毒靈灌腸液甲組成分（地榆皂苷-Ⅰ為3.67 mg/g、地榆皂苷-Ⅱ?yàn)?.85 mg/g，花旗松素為0.634mg/g，落新婦苷為4.32mg/g，白藜蘆醇為1.76 mg/g）適量，研細(xì)，混勻，取約0.5 g，精密稱定，精密加入混合對照品溶液25 mL和60%甲醇25 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法制備加樣供試品試液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算各組分回收率，結(jié)果見表1。

2.4樣品測定 取3個批號的樣品甲組成分，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定本品中地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新婦苷和白藜蘆醇，結(jié)果見表2。

表1　地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新婦苷和白藜蘆醇回收率試驗(yàn)Tab.1 ResuItsofrecoverytestsforziyu-gIycosideⅠ，ziyu-gIycosideⅡ，taxifoIin，astiIbinandresveratroI

表2　樣品測定結(jié)果（±s，n=3）Tab.2 ResuItsofcontentdetermination（±s，n=3）

表2　樣品測定結(jié)果（±s，n=3）Tab.2 ResuItsofcontentdetermination（±s，n=3）

批 號地榆皂苷-Ⅰ/（mg·g-1）地榆皂苷-Ⅱ/（mg·g-1）花旗松素/（mg·g-1）落新婦苷/（mg·g-1）白藜蘆醇/（mg·g-1）1312013.67±0.041.85±0.020.634±0.0044.32±0.021.76±0.02 1312023.42±0.021.78±0.020.641±0.0064.57±0.041.82±0.02 1312033.89±0.031.96±0.010.629±0.0034.19±0.021.68±0.01

3　討論

3.1供試品溶液提取方法的選擇 在選擇供試品溶液提取方法時，考察比較了超聲提取和回流提取兩種方法對提取效果的影響，按照本實(shí)驗(yàn)中的色譜條件測定，結(jié)果加熱回流2h與超聲提取30min結(jié)果相當(dāng)，考慮操作簡便性，選用超聲提取30min作為供試品溶液制備的提取方法。

3.2流動相的選擇 在流動相的選擇中，還曾考察了不同比例的甲醇-0.5%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水為流動相梯度洗脫，結(jié)果以甲醇-0.5%磷酸溶液梯度洗脫時，各組分分離度差，地榆皂苷-Ⅰ和地榆皂苷-Ⅱ出現(xiàn)峰型重疊；以乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水為流動相梯度洗脫，地榆皂苷-Ⅰ和地榆皂苷-Ⅱ峰形對稱，但花旗松素、落新婦苷和白藜蘆醇峰型不對稱，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。而以甲醇-乙腈（1∶1）與0.5%磷酸溶液為流動相梯度洗脫時，所測5個組分均能達(dá)到基線分離，各組分峰型良好，分離度均大于2。

［1］國家藥典委員會.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑：第二十冊［S］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：128.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：17-18，117-118，附錄30，附錄36.

［3］翟延君，佟苗苗，程 飛，等.花旗松素和3，3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用［J］.中成藥，2012，34（2）：217-220.

［4］張學(xué)文，韋 瑋，程 悅，等.地榆藥材中總皂苷及地榆皂苷-Ⅰ的含量測定［J］.中藥新藥與臨床藥理，2013，24（2）：186-191.

［5］譚 鵬，蒲旭峰，文永盛，等.HPLC-ELSD法測定地榆升白片中地榆皂苷-Ⅰ的含量［J］.中藥與臨床，2013，4（1）：21-23.

［6］蔡 果，龔春燕，申國慶.HPLC法同時測定復(fù)方土茯苓膠囊中落新婦苷和蘆丁的含量［J］.中國藥房，2012，23（47）：4486-4488.

［7］李啟艷，朱日然，徐麗華.RP-HPLC法測定銀屑顆粒中落新婦苷［J］.中成藥，2011，33（6）：1089-1091.

［8］張東方，袁長季，祝 崢，等.HPLC法測定不同地區(qū)地榆中地榆苷-Ⅰ的含量［J］.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32（1）：37-39，42.

［9］張東方，周美環(huán)，沙 明，等.高效液相色譜法對地榆中地榆苷-Ⅱ定量評價研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2003，30（3）：229-230.

［10］鄧少東，肖鳳霞，林 勵，等.不同產(chǎn)地土茯苓藥材UPLC及HPLC指紋圖譜的構(gòu)建研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2012，23（3）：308-311.

［11］肖鳳霞，鄧少東，鄧超明，等.HPLC法測定土茯苓中3種活性成分的含量［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，27（6）：604-608.

Determ ination of ziyu-gIycosideⅠ，ziyu-gIycosideⅡ，taxifoIin，astiIbin and resveratroI in Niaodu Iing Enema by HPLC

WU Jian-hua1， LIYu-shan2*
（1.University Hospital of Hubei University for Nationalities，Enshi445000，China；2.Hubei University For Nationalities，Enshi445000，China）

AIM To deve1op amethod for determination of the contents of ziyu-g1ycosideⅠ，ziyu-g1ycosideⅡ，taxifo1in，asti1bin and resveratro1in Niaodu1ing Enema.METHODS The HPLCmethod was app1ied and the chromatographic co1umn was an Hypersi1 C18co1umn（4.6 mm×200 mm，5μm）.The f1ow rate was 1.2 mL/min.Themobi1e phase A consisted ofmethano1-acetonitri1e（1∶1），themobi1e phase B consisted of 0.5% phosphoric acid so1ution；λ1=203 nm（ziyu-g1ycosideⅠand ziyu-g1ycosideⅡ），λ2=289 nm（taxifo1in and asti1bin），λ3=306 nm（resveratro1）.RESULTS There was a good 1inear re1ationship between the concentration of ziyu-g1ycosideⅠ，ziyu-g1ycosideⅡ，taxifo1in，asti1bin，resveratro1and peak area va1uewhen the concentrations of ziyu-g1ycosideⅠ，ziyu-g1ycosideⅡ，taxifo1in，asti1bin and resveratro1 were within the ranges of 0.072 8-1.456 0μg（r=0.999 7），0.037 4-0.748 0μg（r=0.999 8），0.012 6-0.252 0μg（r=0.999 3），0.086 2-1.724 0μg（r=0.999 9），0.035 6-0.712 0μg（r=0.999 5），respective1y.The average recoveries were 98.6%（RSD=0.8%），97.6%（RSD=0.7%），96.9%（RSD=0.7%），99.1%（RSD=0.6%）and 98.4%（RSD=0.5%），respective1y.CONCLUSION Themethod can make fivemeasured constituents the base1ine reso1ution with good peak shape，and their reso1utions aremore than two.

Niaodu1ing Enema；ziyu-g1ycosideⅠ；ziyu-g1ycosideⅡ；taxifo1in；asti1bin；resveratro1

R927.2

A

1001-1528（2015）01-0112-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.022

2014-04-12

吳建華（1975—），男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事泌尿系統(tǒng)的臨床基礎(chǔ)研究。E-mai1：wujianhua1unwen@163.com

李玉山（1969—），男，副教授，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究工作，Te1：（0718）8437479，E-mai1：1iyushan1unwen@163.com