星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選糖腎寧顆粒乙醇提取工藝的研究

翟永松，　尚雅文，　龔慕辛，　張 賽，　王滿元，　李朝霞

（首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京　100069）

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選糖腎寧顆粒乙醇提取工藝的研究

翟永松，尚雅文，龔慕辛*，張 賽，王滿元，李朝霞

（首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京100069）

目的 優(yōu)選糖腎寧顆粒（黃芪、葛根、黃蜀葵花、大黃等）乙醇提取部分的工藝。方法 以黃芪甲苷、金絲桃苷和葛根素提取率的總評(píng)歸一值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、提取時(shí)間為主要影響因素，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法選擇提取工藝的最佳條件。結(jié)果 確定糖腎寧顆粒醇提部分的最優(yōu)提取工藝為加12倍63%乙醇回流提取2次，每次2.5 h。結(jié)論 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選的糖腎寧顆粒醇提部分工藝，方法簡(jiǎn)便，精度更高。

糖腎寧顆粒；星點(diǎn)設(shè)計(jì)；效應(yīng)面法；乙醇提取

糖腎寧方系我院糖尿病專家高彥彬教授的臨床有效驗(yàn)方，由黃芪、葛根、黃蜀葵花、大黃等七味中藥組成，具有益氣固腎、化瘀降濁的功效，可有效降低糖尿病腎病患者尿蛋白，改善腎功能。原方以湯劑形式應(yīng)用于臨床，療效確切，但湯劑需要臨用煎煮且服用不便。為使糖腎寧方適應(yīng)時(shí)代要求，更好的服務(wù)患者，將其開發(fā)成顆粒劑型。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法是常用于優(yōu)化藥材和制劑提取工藝、篩選處方的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。該方法簡(jiǎn)便、直觀，且在模型建立上采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)合相關(guān)系數(shù)較高，預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值［1-3］。本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)選糖腎寧顆粒的醇提工藝。

1　儀器與材料

Agi1ent-1200高效液相色譜儀，Agi1ent1100高效液相色譜儀（A11tech2000 ELSD蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）；CP224C型電子分析天平［奧豪斯儀器（上海）儀器有限公司］；DV215CD型電子分析天平（Ohaus Co.）；真空干燥箱（德國(guó)美墨爾特公司）；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀有限公司）。

黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)110781-200613，供含量測(cè)定用）；葛根素對(duì)照品（批號(hào)110752-200912，供含量測(cè)定用）；金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)111521-201205，供含量測(cè)定用）；均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純，娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

所用飲片購自安國(guó)國(guó)藥樂仁堂飲片廠，經(jīng)我校鑒定教研室羅容老師鑒定均符合2010年版《中國(guó)藥典》一部各項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。

2　方法與結(jié)果

2.1黃芪甲苷的測(cè)定［4-6］

2.1.1色譜條件 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（32∶68）；體積流量1.0 mL/min；漂移管溫度101℃；載氣體積流量2.7 L/min，進(jìn)樣量20μL。結(jié)果見圖1。

圖1　乙醇提取浸膏中黃芪甲苷HPLC-ELSD測(cè)定圖譜Fig.1　HPLC-ELSD chromatogram s of astragaIoside IV in the ethanoIextraction soIution

2.1.2對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成528μg/mL的溶液，即得。

2.1.3供試品溶液的制備 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，對(duì)四味飲片進(jìn)行提取后，進(jìn)行減壓濃縮和干燥，得到干膏粉。取約相當(dāng)于黃芪飲片4 g的干膏粉，精密稱定，加水20 mL微熱使溶化，用水飽和的正丁醇萃取4次，每次60 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液萃取2次，每次60 mL，棄去氨試液，將正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，放冷，通過D101型大孔樹脂柱（1.5 cm×12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，用30 mL 40%乙醇洗脫，棄去洗脫液，再用80 mL 70%乙醇洗脫，收集洗脫液蒸干，甲醇溶解并定容于5 mL量瓶中，制得樣品液。

2.1.4線性關(guān)系考察 精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液1、5、10、20、30μL，分別進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量（mg）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)Ⅹ，以黃芪甲苷峰面積積分值的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)Y，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為Y=1.564Ⅹ+16.043（r=0.999 2）。結(jié)果表明，黃芪甲苷對(duì)照品在0.528～15.84μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.1.5精密度考察 以已知質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，RSD為2.57%，符合分析要求。

2.1.6重復(fù)性考察 精密稱取相當(dāng)于約原藥材4 g干膏粉，平行操作6份，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算RSD值為4.54%，符合分析要求。

2.1.7回收率試驗(yàn) 取相當(dāng)于2 g黃芪生藥量的已知成分含有量干膏6份，精密稱定，分別加入與樣品含有量相等的對(duì)照品后，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備樣品，在上述色譜條件下進(jìn)樣20μL，測(cè)定，計(jì)算黃芪甲苷回收率為90%，RSD為4.64%。

2.2 葛根素、金絲桃苷的測(cè)定

2.2.1色譜條件 色譜柱Purospher?STAR LP RP-18 endcapped（5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸（15∶85），體積流量1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm（葛根素）和360 nm（金絲桃苷），進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果見圖2，圖3。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葛根素、金絲桃苷對(duì)照品，加甲醇溶解并定容，配制成含葛根素401.2μg/mL、金絲桃苷560.6μg/mL的對(duì)照品貯備溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 取“2.1.3”項(xiàng)下干膏粉0.1 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷后稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4線性關(guān)系考察 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取質(zhì)量濃度分別為10.03、50.15、100.3、200.6、401.2μg/mL的葛根素對(duì)照品溶液，各取10μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)Ⅹ，得回歸方程為Y=40 695Ⅹ-21 426（r=0.999 9），葛根素在0.10～4.0μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖2　乙醇提取浸膏中葛根素HPLC-UV測(cè)定圖譜Fig.2　HPLC-UV chromatogram s of puerarin in the ethanoIextraction soIution

金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取質(zhì)量濃度分別為11.212、56.06、112.12、280.3、560.6μg/mL的金絲桃苷對(duì)照品溶液，各取10μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)Ⅹ，得回歸方程為Y=21 098Ⅹ-14 103（r= 0.999 9），金絲桃苷在0.11～5.6μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度考察 取同一質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，在色譜條件下進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，葛根素的RSD為0.08%，金絲桃苷的RSD為0.18%，符合分析要求。

2.2.6重復(fù)性考察 精密稱取干膏粉約0.1 g，平行操作6份，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算RSD值，葛根素RSD為1.67%，金絲桃苷RSD為2.77%，符合分析要求。

2.2.7回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的供試品0.05 g，平行操作6份，分別加入與樣品中成分含有量相等的對(duì)照品溶液，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算回收率，葛根素回收率為100.25%，RSD為0.69%；金絲桃苷回收率為102.09%，RSD為1.26%，符合分析要求。

圖3　乙醇提取浸膏中金絲桃苷HPLC-UV測(cè)定圖譜Fig.3　HPLC-UV chromatogram s of hyperin in the ethanoI extraction soIution

2.3乙醇提取工藝條件的優(yōu)選

2.3.1星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)［7-12］根據(jù)處方中各藥主要成分的性質(zhì)確定采用乙醇回流的提取方法，并進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定影響因素主要是乙醇量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)，并對(duì)其范圍進(jìn)行了考察。其中提取次數(shù)為非連續(xù)變量，不適于回歸處理，故預(yù)先對(duì)提取次數(shù)進(jìn)行單因素考察，發(fā)現(xiàn)以2次為佳。因素水平表見表1。

表1　因素水平Tab.1 Factors and IeveIs

按處方量稱取黃芪等中藥飲片，按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)三因素表安排試驗(yàn)見表2。進(jìn)行不同體積分?jǐn)?shù)、不同用量乙醇和提取時(shí)間進(jìn)行回流提取，濾過，收集濾液，回收乙醇，濃縮至稠浸膏，干燥，粉碎，稱量。選取黃芪甲苷、葛根素、金絲桃苷含有量（mg/g生藥量）的總評(píng)歸一值為評(píng)價(jià)指標(biāo)。將黃芪甲苷、葛根素、金絲桃苷量三個(gè)指標(biāo)用Hansan法進(jìn)行歸一化，即dij=（Ⅹij-Ⅹmin）/（Ⅹmax-Ⅹmin），以各指標(biāo)的“歸一值”求算幾何均數(shù)，得到總評(píng)歸一值，其公式如下：OD=（d1×d2……× dn）1/k（其中n為指標(biāo)數(shù)），結(jié)果見表2。

表2　星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Arrangement and resuIts of centraIcomposite design

2.3.2結(jié)果分析 應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以O(shè)D值為指標(biāo)進(jìn)行多元非線性回歸擬合，結(jié)果見表3、表4，由模型失擬檢驗(yàn)表可以看出，軟件推薦采用二次多項(xiàng)式模型，三次模型已出現(xiàn)混淆現(xiàn)象。得到乙醇體積分?jǐn)?shù)（Ⅹ1）、料液比（Ⅹ2）及提取時(shí)間（Ⅹ3）與OD值之間的二次多項(xiàng)回歸方程，模型項(xiàng)P＜0.05，說明Y與Ⅹ1、Ⅹ2、Ⅹ3回歸方程的關(guān)系是顯著的，失擬項(xiàng)P＞0.05，說明所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例小，方程表示Y與Ⅹ1、Ⅹ2、Ⅹ3回歸方程的關(guān)系是良好的?；貧w方程為（以代碼為自變量）：Y=0.59-0.042Ⅹ1+0.067Ⅹ2+0.073Ⅹ3+ 0.078Ⅹ1Ⅹ2-0.071Ⅹ1Ⅹ3+0.11Ⅹ2Ⅹ3-0.13Ⅹ21-0.047Ⅹ22-0.011Ⅹ23，回歸方程系數(shù)r2=0.808 3（r=0.899 1），說明模型能解釋89.91%響應(yīng)值的變化，表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)實(shí)際情況。

表3　模型失擬檢驗(yàn)Tab.3 Lack of fit test

表4　分析及回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Regression coefficients and anaIysis of variance of the response surfacemodeIs

2.3.3響應(yīng)面分析及最優(yōu)提取條件的確定 依據(jù)回歸方程，在保持1個(gè)因素編碼值為0時(shí)，借助Design-Expert8.0軟件繪制其他2個(gè)因素與響應(yīng)值關(guān)系的三維響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖4～圖5。通過Design-Expert8.0軟件分析，得出回歸模型存在最大值點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的實(shí)測(cè)值乙醇體積分?jǐn)?shù)（Ⅹ1）為63%，料液比（Ⅹ2）為12，提取時(shí)間（Ⅹ3）為150 min，此時(shí)OD值的最大估計(jì)值為0.772。

2.3.4模型驗(yàn)證 為了驗(yàn)證此提取模型方程的適用性，在乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間最優(yōu)的水平上，重復(fù)試驗(yàn)3次，OD值為0.73（RSD為4.8%），與預(yù)測(cè)值吻合好，說明用此模型指導(dǎo)實(shí)踐具有好的效果。

3　討論

圖4　響應(yīng)面的等高線圖Fig.4　Contour map of response surface

圖5　響應(yīng)面3D圖Fig.5　3D response surface

3.1在醇提物中黃芪甲苷測(cè)定時(shí)，經(jīng)多次試驗(yàn)，排除各種影響因素，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷加樣回收率仍偏低。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，覃紅萍等［13］研究發(fā)現(xiàn)黃芪藥材中以原型存在的黃芪甲苷即黃芪皂苷Ⅳ的量是很低的，但經(jīng)藥典條件堿化處理后黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ的量大幅下降，同時(shí)轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷Ⅳ，使其測(cè)定值升高，對(duì)此現(xiàn)象做出了解釋。

3.2在提取工藝優(yōu)化的最優(yōu)點(diǎn)附近，自變量和應(yīng)變量往往呈非線性關(guān)系，因此，在醇提部分工藝條件優(yōu)選時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用了適應(yīng)該特點(diǎn)的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法，并通過“歸一化”消除了不同評(píng)價(jià)指標(biāo)的量綱不同帶來的影響，然后運(yùn)用總評(píng)歸一值對(duì)多個(gè)有效成分進(jìn)行綜合評(píng)分，再進(jìn)行非線性擬合，建立數(shù)學(xué)模型，描繪響應(yīng)面，從而預(yù)測(cè)優(yōu)化區(qū)域并預(yù)測(cè)最佳工藝條件，適合于復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

3.3因《中國(guó)藥典》收載的黃芪甲苷測(cè)定制樣步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)，影響因素多，檢測(cè)較復(fù)雜，同時(shí)考慮各藥均含有治療糖尿病腎病的有效成分，工藝考察中以多指標(biāo)評(píng)價(jià)為好，增加了葛根素、金絲桃苷兩個(gè)測(cè)定指標(biāo)。通過分析藥典方法，發(fā)現(xiàn)兩者供試品制備過程、所用溶劑極性相似，嘗試同步測(cè)定。對(duì)同時(shí)提取葛根素及金絲桃苷的方法，包括提取溶劑、方法和時(shí)間進(jìn)行了考察，最后選定最優(yōu)提取方法為甲醇超聲提取30 min。對(duì)同時(shí)測(cè)定葛根素及金絲桃苷的色譜條件進(jìn)行摸索，結(jié)果葛根素在金絲桃苷測(cè)定的流動(dòng)相條件下即乙腈-0.1%磷酸（15∶85）響應(yīng)值較大，分離度較好，采用PDA檢測(cè)器能夠同時(shí)進(jìn)行多波長(zhǎng)掃描，可實(shí)現(xiàn)對(duì)葛根素（檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm）和金絲桃苷（檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm）的同時(shí)測(cè)定，能夠簡(jiǎn)化樣品處理的過程，縮短分析時(shí)間，提高效率。此外，實(shí)驗(yàn)中還對(duì)川芎中阿魏酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該成分在提取過程中不穩(wěn)定，難以測(cè)定。

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Optim ization of ethanoIextraction for Tangshenning Granu Ies by centraI composite design-response surfacemethod

ZHAIYong-song， SHANG Ya-wen， GONGMu-xin*， ZHANG Sai， WANGMan-yuan， LIZhao-xia
（School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Tangshenning Granu1es（Astragalimembranacei Radix，Puerariae Radix，Rhei Radix et Rhizoma，etc.）；centra1 composite design；response surfacemethod；ethano1extract

R284.2

A

1001-1528（2015）01-0099-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.020

2013-12-14

北京市教育委員會(huì)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（201325）；北京市教育委員會(huì)“首都中醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)研究專項(xiàng)”課題（2012-2013，12ZYH09）

翟永松（1979—），男，講師，研究方向：中藥制劑工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mai1：zhaiyongsong@139.com

龔慕辛（1968—），女，教授，研究方向：中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。Te1：（010）83911632，E-mai1：gongmuxin@126.com

日期：2014-07-02

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20140702.0851.001.htm1