提高芍藥愈傷組織中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含有量

馬瑩瑩，　胡 升，　江海龍，　馮定軍，　俞 偉，　梅樂和，*

（1.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江　杭州　310027；2.浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江　寧波　315100；3.寧波立華制藥有限公司，浙江　寧波　315174）

提高芍藥愈傷組織中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含有量

馬瑩瑩1，胡 升2，江海龍3，馮定軍3，俞 偉3，梅樂和1，2*

（1.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江杭州310027；2.浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江寧波315100；3.寧波立華制藥有限公司，浙江寧波315174）

目的 進(jìn)一步優(yōu)化芍藥愈傷組織中積累芍藥雙苷（芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷）的培養(yǎng)條件。方法 以芍藥愈傷組織中芍藥雙苷的量為響應(yīng)值，采用P1ackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計對8個影響愈傷組織生長和芍藥雙苷積累的植物激素（NAA、2，4-D、6-BA、TDZ）的質(zhì)量濃度、蔗糖的含有量、Ca2+量、NH4+∶NO3-的比例及光照中篩選出了3個關(guān)鍵因素，通過最陡爬坡逼近和響應(yīng)面優(yōu)化方法確定這些因素的最適水平。結(jié)果 三個因素的最佳條件為：40.20 g/L蔗糖、0.33 mg/L 6-BA和1.08 mg/L NAA。結(jié)論 在此最優(yōu)培養(yǎng)條件下，芍藥愈傷組織合成芍藥雙苷的能力比優(yōu)化前提高了33%，芍藥雙苷占愈傷組織干重含有量達(dá)到37.60 mg/g。

愈傷組織；芍藥苷；芍藥內(nèi)酯苷；P1ackett-Burman法；中心組合實(shí)驗(yàn)；優(yōu)化；萘乙酸（NAA）；6-芐氨基嘌呤（6-BA）

中藥材白芍是毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pa11.的干燥根，主產(chǎn)于浙江、四川、安徽等省。白芍氣微，味微苦、酸，具有養(yǎng)血、柔肝、斂陰、收汗、緩急止痛等功效。白芍的主要藥效成分是屬于單萜苷類化合物［1］，以芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷（二者合稱為芍藥雙苷）為主要成分的芍藥總苷。在《中國藥典》2010年版中，已將芍藥總苷作為白芍的質(zhì)量控制指標(biāo)［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，芍藥總苷能通過多途徑抑制自身免疫反應(yīng)［3］，因而具有抗炎、止痛、保肝和抑制自身免疫等多種藥理作用，目前在臨床已用于對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療，并取得了良好的治療效果［4］。

芍藥苷的傳統(tǒng)制備方法是先種植芍藥，待芍藥生長2～4年后挖取芍藥根，經(jīng)曬干炮制得到赤芍或白芍，然后制藥企業(yè)從白芍產(chǎn)地收購赤芍或白芍后再從中分離提取芍藥苷。由于整個生產(chǎn)過程所需的周期較長，而且赤芍和白芍中芍藥雙苷的含有量較低（一般為干質(zhì)量的1%左右），這使得從赤芍或白芍中提取芍藥雙苷存在成本高、效率低的問題，不僅限制了產(chǎn)量，而且產(chǎn)品的價格也居高不下。此外，芍藥中芍藥雙苷的含有量還受到芍藥生長產(chǎn)地、季節(jié)、氣候以及栽培管理水平等多種因素的影響，導(dǎo)致它們的含有量有常常低于這一水平。更不利的是，日趨嚴(yán)重的土壤、水和空氣污染還使得產(chǎn)品的安全性由于重金屬及農(nóng)藥殘留的存在而受到影響。這些不足也是傳統(tǒng)天然藥物提取和生產(chǎn)所面臨的普遍性問題。

為了解決這些問題，開展了芍藥愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)研究，以期通過誘導(dǎo)并規(guī)模化培養(yǎng)芍藥愈傷組織，縮短芍藥細(xì)胞中芍藥雙苷的積累時間，并通過對愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化，促進(jìn)細(xì)胞中芍藥雙苷的積累，提高細(xì)胞中芍藥雙苷的含有量。雖然目前已有一些關(guān)于芍藥愈傷組織的研究，但這些研究主要是從芍藥的育種目的出發(fā)，通過對芍藥愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和分化培養(yǎng)，進(jìn)行芍藥的品種改良和高效繁殖［5-7］。除此之外，有關(guān)芍藥的研究主要涉及對藥材中芍藥雙苷的提取、檢測［8-9］；芍藥主要成分的分離測定［1，10］；以及芍藥苷的藥效和藥物動力學(xué)研究［11］。迄今為止，還未見通過愈傷組織制備芍藥雙苷的研究。在前期研究中，已經(jīng)利用芍藥的根、莖、葉等不同外植體獲得了相應(yīng)的芍藥愈傷組織，并從培養(yǎng)的愈傷組織中提取獲得了芍藥雙苷，并發(fā)現(xiàn)愈傷組織中芍藥雙苷的含有量高于它們在芍藥外植體中的含有量。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對芍藥愈傷組織生產(chǎn)芍藥雙苷的培養(yǎng)條件進(jìn)行了考察和優(yōu)化，通過對關(guān)鍵影響因素的優(yōu)化來提高愈傷組織中芍藥雙苷含有量，為實(shí)現(xiàn)芍藥雙苷的愈傷組織規(guī)模化制備創(chuàng)造條件。

1　材料與方法

1.1儀器與材料 LC2000高效液相色譜儀（Hitachi L-2400單波長紫外檢測器）（天美中國儀器科技公司），SinoChrom ODS-BP反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）（大連依利特）；AL204電子分析天平（Mett1er To1edo）。

芍藥苷對照品（≥97%，批號1023930）、芍藥內(nèi)酯苷對照品（≥97%，批號1023928）由西亞試劑提供；甲醇、乙腈為色譜純（批號分別為3C290281、4C180115；上海安普科學(xué)儀器有限公司）；磷酸二氫鉀為分析純，水為超純水；樣品材料（亳州芍藥葉愈傷組織）為本實(shí)驗(yàn)室自行培養(yǎng)。

1.2愈傷組織培養(yǎng) 選取實(shí)驗(yàn)室種植的生長旺盛、無病蟲害的亳州芍藥植株葉片，反復(fù)沖洗干凈后于超凈工作臺內(nèi)用75%乙醇消毒30 s，然后用10% NaC1O浸泡10 min，再用無菌水沖洗3～5次，置無菌濾紙上晾干，切為1 cm2左右后接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基（WPM培養(yǎng)基［12］+2 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.2 mg/L萘乙酸（NAA）+0.2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D））中進(jìn)行培養(yǎng)，25 d后將誘導(dǎo)出的生長較好的愈傷組織切割成小塊后轉(zhuǎn)接至固體繼代培養(yǎng)基（WPM培養(yǎng)基+0.5 mg/L 6-BA+ 1 mg/L NAA+0.1 mg/L脫葉靈（TDZ））中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（24±1）℃，光照強(qiáng)度1 500 1x，以32 d為一次繼代培養(yǎng)周期，在繼代過程中選取相同繼代批次的愈傷組織進(jìn)行相同類型的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最終以相對于原始培養(yǎng)下生長的同一代愈傷組織作比較來確定最優(yōu)條件。

1.3芍藥愈傷組織中芍藥雙苷的提取及測定 在60℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱將愈傷組織樣品干燥至恒定質(zhì)量，研磨為粉，用一定體積的甲醇浸漬約5 min，爾后60℃下超聲處理30 min（功率為120W），萃取液在10 000 r/min離心10min后收集上清，離心上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，獲得芍藥雙苷粗提物。樣品中芍藥雙苷的種類通過與對照品保留時間對比鑒定，濃度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算求取。通過HPLC參數(shù)測定樣品溶液與對照品溶液中芍藥雙苷含有量，求出樣品溶液中芍藥雙苷的量Mi。而芍藥雙苷在愈傷組織干燥品中的含有量Pi（mg/g）則按下式計算：

其中V為定容體積10 mL，Mi為芍藥雙苷質(zhì)量濃度，Mw為稱取的愈傷組織干品質(zhì)量。

1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計

1.4.1P1ackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計 P1ackett-Burman設(shè)計是1946年由P1ackett和Burman提出［13］的，用來篩選和評價影響響應(yīng)值的主要因素。根據(jù)植物細(xì)胞生長所需營養(yǎng)要素的基本原則及查閱文獻(xiàn)，最終選取可能影響芍藥愈傷組織生長及芍藥雙苷產(chǎn)量的8個因素作為變量，愈傷組織中芍藥雙苷合成量為響應(yīng)值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到一個多元一次方程：

式中：Y—預(yù)測響應(yīng)值；β0—模型截距；βi—一次系數(shù)；Ⅹi—自變量水平。

1.4.2最陡爬坡試驗(yàn) 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)是根據(jù)P1ackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行設(shè)計，用于找到逼近最大效應(yīng)區(qū)域的點(diǎn)并將其用作進(jìn)一步優(yōu)化的中心點(diǎn)。最陡爬坡法以試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長，能快速、有效地逼近最大響應(yīng)區(qū)域［14］。

1.4.3中心組合試驗(yàn) 中心組合試驗(yàn)是一種國際上較為常用的響應(yīng)面法［15］。在最陡爬坡試驗(yàn)確定的區(qū)域內(nèi)，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到以愈傷組織合成芍藥雙苷的含有量為響應(yīng)值的多元二次回歸方程。該方程為描述響應(yīng)變量（因變量）與自變量（操作條件）關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?/p>

式中：Y—預(yù)測響應(yīng)值；k—變量的數(shù)目；β0—模型常量；βi—一次系數(shù)；βii—二次系數(shù)；βij—相互作用系數(shù)。

利用“Design Expert.V 8.0.6.1”軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和方差分析，估計模型在每種情況下的擬合度，并對影響因變量的各因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評價，指明實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的方向，并對不同變量的優(yōu)化組合所預(yù)測得到的最大響應(yīng)值驗(yàn)證該模型的準(zhǔn)確性［16］。

2　結(jié)果與討論

2.1影響芍藥愈傷組織合成芍藥雙苷能力的關(guān)鍵因素 基于P1ackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計的原理，本研究確定的8個影響參數(shù)包括四種植物激素（NAA、2，4-D、6-BA、TDZ）的質(zhì)量濃度、蔗糖的含有量、Ca2+的量、NH4+：NO3-的比例及有無光照。為對這8個因素進(jìn)行全面考察，選用了n=12的PB設(shè)計，并余留4個空項作誤差分析。每個因素取2個水平：低水平“-”與高水平“+”。高水平取低水平的1.4～2.5倍。實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果如表1所示，各參數(shù)所代表因素、水平及效應(yīng)見表2。P1ackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計及數(shù)據(jù)分析采用Statistica軟件（Version 6.0，Stat Soft，Inc.，USA）進(jìn)行設(shè)計與分析。

表1　PIackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果（n=12）Tab.1 PIackett-Burman design and resu Its（n=12）

由表2可知，對愈傷組織產(chǎn)芍藥雙苷能力有顯著影響（≥90%）的是植物激素6-BA、NAA的質(zhì)量濃度及蔗糖的量，適當(dāng)降低6-BA質(zhì)量濃度，提高NAA質(zhì)量濃度及蔗糖的量可增強(qiáng)愈傷組織產(chǎn)芍藥雙苷的能力。因此，選擇6-BA、NAA、蔗糖的量這三個因素作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素。

表2　因素、水平及效應(yīng)Tab.2 Variab Ies，IereIs and effects

2.2最陡爬坡試驗(yàn) 由P1ackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果表明，植物激素NAA質(zhì)量濃度和蔗糖含有量具有正效應(yīng)，6-BA質(zhì)量濃度具有負(fù)效應(yīng)，因此在最陡爬坡試驗(yàn)中，增大NAA質(zhì)量濃度和蔗糖的量，降低6-BA質(zhì)量濃度更有利于愈傷組織中次級產(chǎn)物的代謝。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際需要，對以上3個重要影響因素的步長進(jìn)行了相應(yīng)設(shè)計，設(shè)計及結(jié)果如表3，而其他因素的取值則根據(jù)正效應(yīng)的因素取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素取較低值，具體安排如下：2，4-D為0.2 mg/L，TDZ為0.25 mg/L，NH4+∶NO3-比值為1∶2，Ca2+的量為正常WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基的兩倍并進(jìn)行無光照培養(yǎng)。

由表3可見最優(yōu)培養(yǎng)條件在處理3與處理4之間，故以處理3條件為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)。

表3　最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Tab.3 Design and resu Its of the steepest ascent experiment

2.3響應(yīng)面的擬合及最優(yōu)條件確定 影響芍藥愈傷組織生長速率和愈傷組織的芍藥雙苷積累能力的因素較多，在前期研究中，采用單因素試驗(yàn)對培養(yǎng)基組成——包括培養(yǎng)基中4種植物激素（NAA、2，4-D、6-BA、TDZ）的質(zhì)量濃度、蔗糖的量、Ca2+的量、NH4+∶NO3-的比例，生長溫度，光照條件對愈傷組織生長及愈傷組織中芍藥雙苷含有量的影響進(jìn)行了考察，并在單因素實(shí)驗(yàn)中初步確定了這些因素的適宜水平。但是，由于這些因素間可能存在的交互效應(yīng)，單因素實(shí)驗(yàn)難以確定愈傷組織培養(yǎng)的最佳條件。為了高效、準(zhǔn)確的了解這些因素對愈傷組織生長和芍藥雙苷積累能力的影響規(guī)律，并確定最佳的愈傷組織培養(yǎng)條件，有必要采取適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計優(yōu)化方法進(jìn)行更全面和深入的培養(yǎng)條件優(yōu)化研究。

響應(yīng)面分析法（response surface methodo1ogy，RSM）是一種進(jìn)行復(fù)雜條件優(yōu)化的有效方法，它能對多個影響因素及它們的交互效應(yīng)進(jìn)行考察，通過描述影響因素與響應(yīng)之間的數(shù)學(xué)模型，幫助研究者認(rèn)識和分析相關(guān)因素影響特定響應(yīng)的規(guī)律，并通過對過程的回歸擬合和響應(yīng)曲面、等高線的繪制，可方便地確定對應(yīng)最大響應(yīng)的最佳條件。同時，此方法考慮了試驗(yàn)隨機(jī)誤差，并將復(fù)雜的未知的函數(shù)關(guān)系在小區(qū)域內(nèi)用簡單的多項式模型來擬合，計算簡便，是降低開發(fā)成本、優(yōu)化加工條件、提高產(chǎn)品質(zhì)量、解決生產(chǎn)過程中的實(shí)際問題的一種有效方法，已在制藥工程、生物工程、化學(xué)化工等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［17-18］。為了對準(zhǔn)確認(rèn)識培養(yǎng)基中關(guān)鍵成分和光照條件等因素對芍藥雙苷積累水平的影響規(guī)律，并確定最佳的愈傷組織培養(yǎng)條件，我們在通過PB實(shí)驗(yàn)識別了關(guān)鍵因素后，也采用了響應(yīng)面方法進(jìn)行了芍藥愈傷組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究。

由PB試驗(yàn)結(jié)果和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果可知，處理3是響應(yīng)變量Y值最逼近最大芍藥雙苷合成量區(qū)域。因此，以處理3條件為中心點(diǎn)施行中心組合試驗(yàn)，同時在原始培養(yǎng)基中接入同一代的愈傷組織作為對照。因?yàn)橛?個自變量，為了使擬合響應(yīng)方程具有旋轉(zhuǎn)性和通用性，選擇中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)數(shù)為6，星號臂長γ=1.682［14］。各自變量水平見表4，試驗(yàn)設(shè)計見表5。

表4　中心組合試驗(yàn)中變量及其水平Tab.4 LeveIsandcodesofthevariabIesforCCD

表5　中心組合試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Tab.5 DesignandresuItsofCCD

利用“DesignExpert.V8.0.6.1”軟件對表5中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸擬合，得到芍藥雙苷總量對植物激素6-BA、NAA質(zhì)量濃度及蔗糖質(zhì)量濃度的二次模型為：

Y=39.52+4.40A-3.38B-1.17C+2.99AB+ 2.34AC-2.62BC-3.31A2-2.33B2-2.52C2

式中，Y為芍藥愈傷組織中芍藥雙苷含有量的預(yù)測值；A、B、C分別為植物激素6-BA、NAA質(zhì)量濃度及蔗糖的量的編碼值。該模型的方差分析見表6。結(jié)果表明，該模型的可信度水平均大于99.99%（P＜0.0001），說明該模型極顯著，在被研究的整個回歸區(qū)域擬合較好；復(fù)相關(guān)系數(shù)為r2= 0.9642，說明預(yù)測值和實(shí)際值之間相關(guān)性較好；Adjr2=0.9320，說明應(yīng)變量中芍藥雙苷含有量僅有約6.8%的變異不能由該模型表示；變異系數(shù)為Rsp=5.4%，說明實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度較高；精密度（AdeqPrecision）是有效信號和噪聲的比值，大于4.0視為合理，實(shí)驗(yàn)的精密度達(dá)到了19.740。因此我們認(rèn)為該經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂捎脕眍A(yù)測響應(yīng)值。

表6　芍藥雙苷含有量響應(yīng)面二次模型的變量分析Tab.6 AnaIysisofvariances（ANOVA）forresponsesurfacequadraticmodeIoftotaIgIucosidescontent

圖1　6-BA、NAA及蔗糖對芍藥愈傷組織中芍藥雙苷的影響Fig.1　ResponsesurfacepIotofeffectsontotaIgIucosidesproductionbysucrose，6-BAandNAA

每個響應(yīng)面分別代表著兩個獨(dú)立變量之間的相互作用，此時第三個變量保持在編碼0的水平，由響應(yīng)面圖1可直觀地看出各因子對響應(yīng)面的影響變化趨勢，求解方程（1）可得模型極值點(diǎn)坐標(biāo)：A= 0.33 mg/L，B=1.08 mg/L，C=40.20 g/L，此時模型預(yù)測的芍藥雙苷含有量最大值為36.81 mg/g，是原始培養(yǎng)基的1.31倍（同時接入的同批次的愈傷組織在原始WPM培養(yǎng)基中，測得芍藥雙苷含有量為28.03 mg/g）。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在最佳培養(yǎng)基條件和原始培養(yǎng)基條件分別進(jìn)行了另一批次的愈傷組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，最優(yōu)條件下愈傷組織芍藥雙苷總量達(dá)到37.60 mg/g，而原始條件下愈傷組織芍藥雙苷總量28.27 mg/g。這一結(jié)果不僅表明所建立的模型具有較為準(zhǔn)確的預(yù)測能力，而且也證明通過響應(yīng)面優(yōu)化，使芍藥愈傷組織的芍藥雙苷含量提高了33%，較好地實(shí)現(xiàn)了研究目的。

由優(yōu)化結(jié)果可知，A-6-BA和B-NAA這兩種激素對愈傷組織中芍藥雙苷的含有量具有最顯著的影響，它們在培養(yǎng)基中的最佳的質(zhì)量濃度分別為0.33 mg/L和1.08 mg/L；而在優(yōu)化前，這兩種激素的質(zhì)量濃度分別為0.20mg/L和2.00mg/L。這兩個激素的使用質(zhì)量濃度都有顯著的變化，分別提高了65%和減少了46%。由于激素不僅直接影響細(xì)胞的生長，而且還調(diào)控代謝產(chǎn)物的合成，因此這兩種激素使用濃度的改變是促進(jìn)愈傷組織中芍藥雙苷積累的關(guān)鍵原因。細(xì)胞分裂素6-BA具有促進(jìn)細(xì)胞分裂，促進(jìn)生物體內(nèi)物質(zhì)積累，防止老化等作用［19］，而生長素NAA主要作用于促進(jìn)生長及增產(chǎn)［20］，其兩者之間的比例不同，對植物生長及活性物質(zhì)的積累影響也不同［21］。在另一方面，由于植物細(xì)胞和組織在培養(yǎng)中缺乏自養(yǎng)能力，需要外源碳源提供能量，因此增加培養(yǎng)基中蔗糖的含有量［22］可以促進(jìn)愈傷組織的生長和芍藥雙苷在愈傷組織的積累。

3　結(jié)語

影響芍藥愈傷組織的生長及代謝產(chǎn)物的積累的因素較多，包括培養(yǎng)基的各組分質(zhì)量濃度及光照都對愈傷組織中芍藥雙苷的含有量產(chǎn)生影響。為了有效提高愈傷組織中芍藥雙苷的含有量，本實(shí)驗(yàn)首先通過P1ackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出了決定芍藥愈傷組織中芍藥雙苷合成的主要因素，然后通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計對這些因素的具體水平進(jìn)行了優(yōu)化，確定了有利于愈傷組織積累芍藥雙苷的最適培養(yǎng)條件：WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.2 mg/L 2，4-D+ 0.33 mg/L 6-BA+1.08 mg/L NAA+0.25 mg/L TDZ+40.20 g/L蔗糖，同時調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中NH4+∶NO3-比值為1∶2，Ca2+的量為正常WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基的兩倍并進(jìn)行無光照培養(yǎng)。通過優(yōu)化，使芍藥愈傷組織中芍藥雙苷的質(zhì)量濃度較原始培養(yǎng)條件的濃度提高了33%，取得了較好的優(yōu)化效果，為利用芍藥愈傷組織進(jìn)行芍藥雙苷的規(guī)模化制備創(chuàng)造了有利條件。

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Content increase of paeonifIorin and aIbifIorin in caIIus cu Iture of Paeonia lactiflora PaII.

MA Ying-ying1，HU Sheng2，JIANG Hai-1ong3， FENG Ding-jun3， YUWei3， MEILe-he1，2*
（1.Department of Chemical and Biochemical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China；2.College of Biological and Chemical Engineering，Ningbo Institute of Technology of Zhejiang University，Ningbo 315100，China；3.Ningbo Liwah Pharmaceutical Co.，Ltd.，Ningbo 315174，China）

AIM To optimize key factors in ca11us cu1ture of Paeonia lactiflora Pa11.for accumu1ation increase of paeonif1orin and a1bif1orin.METHODS With the tota1amountof paeonif1orin and a1bif1orin as the response indicator，three out of eight parameters for the measurement of ca11us cu1ture of Paeonia lactiflora Pa11.，phytohormone（NAA、2，4-D、6-BA、TDZ），sucrose，Ca2+，ratio of NH4+and NO3-，and 1ight treatmentwere checked by P1ackett-Burman experimenta1design.The steepest ascentmethod in combination with centra1composite designand response surfacemethod were app1ied to determining the optima1 1eve1s of these factors.RESULTS 40.20 g/L sucrose，0.33 mg/L 6-BA，and 1.08 mg/L NAA were identified as themost satisfactory conditions.CONCLUSION The abovementioned conditions breed a tota1content increase（of near1y 33%）of paeonif1orin and a1bif1orin，37.60 mg/g，ca1cu1ated at dry weight.

ca11us，paeonif1orin and a1bif1orin，P1ackett-Burman design，response surfacemethod，optimization 6-benzy1aminopurine（6-BA）；naphthy1acetic acid（NAA）

R282.2

A

1001-1528（2015）01-0078-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.016

2013-12-15

國家自然科學(xué)基金項目（21176220，31240054）；寧波市重大科技項目（2011C11023）；浙江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目（Z13B060008）

馬瑩瑩（1989—），女，碩士生，研究方向：中藥質(zhì)量控制及分析。Te1：18868819116，E-mai1：xiazhipaomo@163.com

梅樂和（1964—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：蛋白質(zhì)分子設(shè)計和定向進(jìn)化、生物制藥。Te1：（0571）87953161，E-mai1：mei1h@zju.edu.cn

日期：2014-05-14

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20140514.0939.001.htm1