丹參素異丙酯經(jīng)鼻吸收的影響因素

韓姣姣，　曲 秦，　呂 卓，　王玥月，　鄭曉暉，　張亞軍*

（1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西　西安　710069；2.陜西新藥技術(shù)研究開發(fā)中心，陜西　西安　710075；3.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西　西安　710065）

丹參素異丙酯經(jīng)鼻吸收的影響因素

韓姣姣1，曲 秦2，呂 卓3，王玥月1，鄭曉暉1，張亞軍1*

（1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710069；2.陜西新藥技術(shù)研究開發(fā)中心，陜西西安710075；3.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西西安710065）

目的 探究丹參素異丙酯的經(jīng)鼻吸收特性及影響因素。方法 采用大鼠鼻腔循環(huán)灌流法，考察丹參素異丙酯鼻腔給藥的吸收性能，以及溶液pH值、吸收促進(jìn)劑和P-gp抑制劑對(duì)吸收的影響。結(jié)果 丹參素異丙酯質(zhì)量濃度在100～1 000μg/mL范圍內(nèi)，鼻黏膜的最大吸收速度常數(shù)為5.2×10-3/min；溶液pH對(duì)鼻腔吸收速度常數(shù)無顯著影響；0.50%、1.00%β-環(huán)糊精和2.00%泊洛沙姆能顯著提高鼻腔吸收（P＜0.05），0.25%～1.00%去氧膽酸鈉和0.50%～2.00%吐溫-80對(duì)丹參素異丙酯的鼻腔吸收無明顯影響；0.10%維拉帕米可提高丹參素異丙酯的鼻腔吸收（P＜0.05）。結(jié)論 丹參素異丙酯能夠透過鼻黏膜吸收；β-環(huán)糊精維拉帕米可提高丹參素異丙酯的鼻腔吸收速度常數(shù)。

鼻腔循環(huán)灌流法；丹參素異丙酯；鼻腔吸收速度常數(shù)；影響因素；β-環(huán)糊精；維拉帕米

丹參素異丙酯是本課題組從復(fù)方丹參方的眾多代謝產(chǎn)物中篩選出的效應(yīng)成分［1］，化學(xué)名為β-（3，4-二羥基苯基）-α-羥基丙酸異丙酯（isopropy13-（3，4-dihydroxypheny1）-2-hydroxypropanoate，IDHP），結(jié)構(gòu)式見圖1，已實(shí)現(xiàn)化學(xué)合成制備［2］。藥理學(xué)研究表明［3-5］，丹參素異丙酯可延長氣管阻斷所致的大鼠死亡時(shí)間，延長小鼠斷頭呼吸時(shí)間，增加氰化鉀中毒小鼠的存活率；顯著改善腦缺血模型大鼠神經(jīng)癥狀，提高大腦ATP水平，降低丙二醛的水平，減輕水腫，降低腦梗死面積，具有良好的抗腦缺氧和腦缺血作用，作為軍用特需抗高原缺氧候選藥物，獲“十一五”國家“重大新藥創(chuàng)制”專項(xiàng)資助（2009ZXJ09004-081）。鼻腔給藥是一種黏膜給藥途徑，藥物吸收迅速，無肝首過效應(yīng)，給藥方便，并可繞過血腦屏障直接進(jìn)入腦脊液或腦組織而發(fā)揮療效［6］。本研究通過在體大鼠鼻腔循環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)，探究丹參素異丙酯經(jīng)鼻給藥的吸收特性和影響因素，為鼻腔給藥新制劑開發(fā)提供依據(jù)。

圖1　丹參素異丙酯的結(jié)構(gòu)式Fig.1　Chem icaIstructure of IDHP

1　儀器與試藥

Agi1ent1100型高效液相系統(tǒng)，F(xiàn)E20梅特勒-托利多PH計(jì)，Sartorius BP211D電子分析天平；HH-2型恒溫水浴箱（北京科偉科技公司）；Anke TGL-16G型高速離心機(jī)，蠕動(dòng)泵（保定蘭格恒流泵有限公司）。

丹參素異丙酯原料（純度＞98%，西北大學(xué)中草藥現(xiàn)代化工程研究中心提供，批號(hào)120325）；丹參素異丙酯對(duì)照品（純度＞99%，西北大學(xué)中草藥現(xiàn)代化工程研究中心提供，批號(hào)111002）；去氧膽酸鈉（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；β-環(huán)糊精（天津市博迪化工有限公司）；吐溫-80（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）；泊洛沙姆188（德國BASF）；維拉帕米（美國Sigma-A1drich公司）；甲醇（色譜純），其余試劑均為分析純。

雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～280 g，西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（陜）2012-003。

2　方法與結(jié)果

2.1大鼠鼻腔循環(huán)灌流液中丹參素異丙酯的測(cè)定方法學(xué)考察

2.1.1色譜條件 Agi1ent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.2%甲酸水溶液（50∶50）；檢測(cè)波長284 nm；體積流量0.8 mL/min；柱溫25℃。

2.1.2大鼠鼻腔循環(huán)灌流樣品的采集和處理 取SD大鼠，參考文獻(xiàn)建立鼻腔循環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］。循環(huán)灌流液體積10 mL，體積流量2.0 mL/min，溫度（37±1）℃，分別于0、10、20、30、45、60、90、120 min取樣200μL，同時(shí)補(bǔ)充等體積循環(huán)灌流液。樣品溶液適當(dāng)稀釋，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液20μL進(jìn)樣分析。

循環(huán)灌流液溶劑的配制：按《中國藥典》2010年版二部附錄XV D緩沖液項(xiàng)下“磷酸鹽緩沖液（pH 5.8）”的組成和用量［8］，加入4.7 g氯化鈉調(diào)節(jié)等滲，加水溶解至1 000 mL，即得。

2.1.3方法專屬性考察 精密量取循環(huán)灌流液溶劑10 mL，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法灌流120 min，即得空白鼻循環(huán)液。另取循環(huán)灌流液溶劑，配制400μg/mL丹參素異丙酯溶液，循環(huán)灌流60 min，取樣、處理，即得樣品溶液，注入液相色譜儀。大鼠空白鼻循環(huán)液、空白鼻循環(huán)液加對(duì)照品、樣品溶液色譜圖見圖2。結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，丹參素異丙酯色譜峰峰形好，柱效高，空白鼻循環(huán)液中的物質(zhì)對(duì)其測(cè)定無干擾，丹參素異丙酯的出峰時(shí)間為11.91 min。

2.1.4線性范圍考察 配制含丹參素異丙酯分別為6.30、12.61、25.22、50.45、100.9、201.8 μg/mL對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。以質(zhì)量濃度（Ⅹ）對(duì)峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=19.67Ⅹ+2.279（r=0.999 1），表明丹參素異丙酯在6.30～201.8μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度和回收率試驗(yàn) 分別于空白鼻循環(huán)液中加入丹參素異丙酯對(duì)照品適量，制成含丹參素異丙酯分別為10.08、52.32、102.2μg/mL的樣品溶液，各5份，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算低、中、高質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度RSD分別為1.2%、1.1%、1.2%，日間精密度RSD分別為1.0%、1.9%、1.7%，回收率分別為96.1%、98.9%、99.2%。

2.1.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取大鼠鼻腔循環(huán)灌流60 min樣品溶液，平行3份，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，記錄丹參素異丙酯的峰面積，結(jié)果RSD為1.9%、1.3%、1.6%。表明循環(huán)液中藥物穩(wěn)定性良好。

吾師所撰詩志，自足千古，序之者不一人，豈假弟一言以為重哉？……倘可附之編末，藏諸名山，則藉師不朽，幸孰甚焉。[3]139

圖2　大鼠鼻腔循環(huán)灌流液中丹參素異丙酯的HPLC圖譜Fig.2　HPLC chromatogram s of IDHP

2.2大鼠在體鼻腔循環(huán)灌流法考察IDHP的鼻腔吸收

2.2.1灌流體積流量的確定 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)過程中循環(huán)液體積基本不變，鼻腔的分泌和吸收對(duì)溶液體積的影響可以忽略不計(jì)。灌流液中藥物以一級(jí)速度消除，按公式1n C=-Kt+1n C0擬合處理，選取相關(guān)系數(shù)相對(duì)較大的K值。其中C（μg/mL）為t時(shí)灌流液質(zhì)量濃度，K為吸收速度常數(shù)，K值的大小可反映鼻黏膜對(duì)藥物的吸收情況。

t時(shí)灌流液質(zhì)量濃度（C）的計(jì)算：

式中，Cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物質(zhì)量濃度（μg/mL），Cb為補(bǔ)加的循環(huán)灌流液（母液）的質(zhì)量濃度（μg/mL），0.2為取樣體積（mL），10為灌流液體積（mL）。

配制400μg/mL丹參素異丙酯循環(huán)灌流液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法，分別以1.5、2.0、2.5 mL/min體積流量進(jìn)行大鼠鼻腔循環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)，考察體積流量對(duì)鼻腔吸收的影響。結(jié)果采用單因素方差分析，在設(shè)定的灌流體積流量條件下丹參素異丙酯的吸收體積流量常數(shù)無顯著差異（P＞0.05），見表1。因灌流體積流量過慢不利于藥物的充分吸收，而過快可能導(dǎo)致鼻腔黏膜的損傷，故確定灌流體積流量為2.0 mL/min。

表1　灌流體積流量的考察結(jié)果（n=3）Tab.1 IDHP constant for absorption rate at different perfusion speed（n=3）

2.2.2丹參素異丙酯的鼻腔吸收試驗(yàn) 精密稱取丹參素異丙酯原料藥100 mg，制成1 mg/mL丹參素異丙酯灌流母液，依次稀釋制得100、200、400、600、800、1 000μg/mL丹參素異丙酯循環(huán)灌流溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行大鼠鼻腔在體循環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)，考察藥物的鼻腔吸收。結(jié)果顯示，灌流液質(zhì)量濃度在100～1 000μg/mL范圍內(nèi)，未出現(xiàn)吸收飽和現(xiàn)象，鼻腔吸收速度常數(shù)無顯著性差異（P＞0.05），見表2。

表2　丹參素異丙酯的鼻腔吸收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.2 IDHP constant for absorption through nasaIdeIivery（n=3）

2.3.1溶液pH對(duì)丹參素異丙酯鼻腔吸收的影響

前期研究表明，丹參素異丙酯在pH為4.5～6.5的磷酸鹽緩沖液中穩(wěn)定，考慮到正常人鼻腔黏液pH一般為5.5～7.5，故配制pH為5.5、5.8、6.5的磷酸鹽緩沖溶液［8］，分別加入適量氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓，作為鼻腔循環(huán)灌流液溶劑，配制400 μg/mL丹參素異丙酯循環(huán)灌流溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行大鼠鼻腔在體循環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，溶液pH對(duì)丹參素異丙酯鼻腔吸收速度常數(shù)無顯著性影響（P＞0.05），但溶液pH為5.8時(shí)，藥物的鼻腔吸收速度常數(shù)相對(duì)較高，見表3。

表3　溶液pH對(duì)IDHP鼻腔吸收的影響（n=3）Tab.3 Effect of different pH vaIues of the soIution on nasaI IDHP absorption（n=3）

2.3.2吸收促進(jìn)劑對(duì)丹參素異丙酯鼻腔吸收的影響 取400μg/mL丹參素異丙酯循環(huán)灌流溶液，分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的去氧膽酸鈉、β-環(huán)糊精、泊洛沙姆188、吐溫-80，按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行大鼠鼻腔在體循環(huán)實(shí)驗(yàn)，考察去氧膽酸鈉、β-環(huán)糊精、泊洛沙姆188、吐溫-80對(duì)藥物鼻腔吸收的影響。結(jié)果采用t檢驗(yàn)分析差異，0.50%、1.00%β-環(huán)糊精和2.00%泊洛沙姆能顯著提高鼻腔吸收（P＜0.05），其他促進(jìn)劑對(duì)丹參素異丙酯的鼻腔吸收無明顯影響，見表4。

表4　吸收促進(jìn)劑對(duì)丹參素異丙酯鼻腔吸收的影響（n=4）Tab.4 Effects of absorption enhancers on nasaI IDHP absorp tion（n=4）

2.3.3P-gp抑制劑對(duì)鼻腔吸收的影響 選取維拉帕米作為P-gp抑制劑，分別配制含維拉帕米0.02%、0.05%、0.10%的丹參素異丙酯循環(huán)灌流液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行大鼠鼻腔在體循環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)，考察P-gp抑制劑對(duì)鼻腔吸收的影響。結(jié)果顯示，加入0.10%的維拉帕米可以顯著提高丹參素異丙酯經(jīng)鼻腔吸收（P＜0.05），而0.02%、0.05%維拉帕米無顯著影響（P＞0.05），見表5。

表5　維拉帕米對(duì)丹參素異丙酯鼻腔吸收的影響（n=4）Tab.5 Effects of Verapam iI on nasaI IDHP absorption（n=4）

3　討論

曾測(cè)定丹參素異丙酯的油水分配系數(shù)為6.89，具有一定親脂性。本研究顯示，丹參素異丙酯能夠通過被動(dòng)擴(kuò)散方式跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，實(shí)現(xiàn)藥物的鼻腔吸收。吸收促進(jìn)劑能提高丹參素異丙酯的鼻腔吸收，以β-環(huán)糊精的促透作用為優(yōu)，其促進(jìn)吸收的機(jī)理可能與下列因素有關(guān)［9-10］：①包合提取細(xì)胞膜的脂溶性成分，使膜通透性增大；②改變細(xì)胞間緊密連接蛋白的分布，打開細(xì)胞間屏障層，提高鼻黏膜通透性。此外，鼻黏膜中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如多藥耐藥蛋白、P-gp）對(duì)某些藥物的外排會(huì)使藥物難以被鼻黏膜吸收［11］。本研究P-gp抑制劑維拉帕米抑制鼻腔黏膜對(duì)IDHP的外排，是提高其鼻腔吸收的另一個(gè)途徑。但丹參素異丙酯吸收與P-gp相關(guān)性的確證，以及P-gp抑制劑和吸收促進(jìn)劑的相互作用等問題，有待進(jìn)一步研究。

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InfIuencing factors in nasaI absorption of isopropyI 3-（3，4-dihydroxyphenyI）-2-hydroxypropanoate

HAN Jiao-jiao1， QU Qin2， LüZhuo3， WANG Yue-yue1， ZHENG Xiao-hui1， ZHANG Ya-jun1
（1.College of Life Sciences，Northwest University，Ⅹi'an 710069，China；2.Shaanxi Pharmaceutical Development Center，Ⅹi'an 710075，China；3.Shaanxi Institute for Food and Drug Control，Ⅹi'an 710061，China）

AIM To exp1ore the characteristics of isopropy1 3-（3，4-dihydroxypheny1）-2-hydroxypropanoate（IDHP）for nasa1absorption and its inf1uencing factors.METHODS The rat nasa1cavity recircu1ating perfusion method was emp1oyed to regu1ate IDHP nasa1absorption.And the inf1uence given to the nasa1mucosa for the absorption by pH va1ue，the enhancer and P-gp inhibitors were examined.RESULTS In a concentration range of 100-1 000μg/mL，the 1argest nasa1 absorption rate constant of IDHP was 5.2×10-3min-1.The pH va1ue of IDHP so1utionmade no change to the absorption.β-cyc1odextrin（0.50%and 1.00%）and po1oxamer（2.00%）marked1y improved nasa1absorption rate（P＜0.05），but sodium deoxycho1ate（0.25%-1.00%）and tween-80（0.5%-2.00%）were unaffected.In addition，0.10%verapami1 increased the constant for absorption rate. CONCLUSION IDHP can be absorbed through the nasa1mucosa，and suitab1eβ-cyc1odextrin and verapami1can he1p to increase the constant va1ue for nasa1 IDHP absorption rate.

nasa1 cavity recircu1ating perfusion method；isopropy1 3-（3，4-dihydroxypheny1）-2-hydroxypropanoate（IDHP）；constant for nasa1absorption rate；inf1uencing factors；β-cyc1odextrin；verapami1

R969.1

A

1001-1528（2015）01-0074-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.015

2014-06-09

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃（2013KTCQ03-15）；陜西省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃（2013JK0812）

韓姣姣（1988—），女，碩士生，主要從事中藥新制劑開發(fā)研究。E-mai1：447357789@qq.com

張亞軍，副教授，從事中藥制劑及其體內(nèi)過程研究。Te1：（029）88302686，E-mai1：zyj1jy@163.com