鐵皮石斛多糖對小鼠胚胎干細胞生長的影響

劉亞娟，　吳江林，　王詩豪，　張 銘，　華允芬

（1.浙江工業(yè)大學藥學院，浙江　杭州　310012；2.浙江省農(nóng)藥檢定管理所，浙江　杭州　310020；3.浙江大學生命科學學院，浙江　杭州　310058）

鐵皮石斛多糖對小鼠胚胎干細胞生長的影響

劉亞娟1，3，吳江林2，王詩豪3，張 銘3，華允芬1*

（1.浙江工業(yè)大學藥學院，浙江杭州310012；2.浙江省農(nóng)藥檢定管理所，浙江杭州310020；3.浙江大學生命科學學院，浙江杭州310058）

目的 研究鐵皮石斛多糖對小鼠胚胎干細胞生長的影響。方法 采用水提醇沉法對鐵皮石斛進行初步提取，體外培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞，通過克隆形成率試驗、MTT試驗及實時定量PCR的方法研究鐵皮石斛提取多糖對小鼠胚胎干細胞的增殖及多能性維持的作用。結(jié)果 鐵皮石斛多糖處理組細胞（50～200μg/m L）的克隆形成率、MTT吸光度值均高于空白對照組，同時其干性相關基因的表達量與對照組相比無顯著差異。結(jié)論 鐵皮石斛多糖可以顯著促進小鼠胚胎干細胞的增殖、提高其克隆形成率，同時又不影響其多潛能性的維持。

鐵皮石斛；多糖；小鼠胚胎干細胞；增殖

鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo.系蘭科石斛屬多年生草本植物，別名“黑節(jié)草”，是我國傳統(tǒng)名貴中藥，因其滋陰清熱、益胃生津等功效而享有“民間仙草、植物黃金”的美譽［1］。自1932年以來，國內(nèi)外學者對石斛屬多種植物進行了化學成分研究，從中分離鑒定出生物堿類、多糖類、倍半萜類、菲醌類、聯(lián)芐類、芴酮類、甾體類、酚類及揮發(fā)油等多種活性成分［2-3］。胚胎干細胞是人體及其各種組織細胞的最初來源，具有高度自我復制、高度增殖和多向分化的潛能［4］。胚胎干細胞研究正在向現(xiàn)代生命科學和醫(yī)學的各個領域交叉滲透，具有廣泛的應用前景，如：用于組織移植、器官修復［5］；細胞治療、基因治療［6］及藥物篩選和開發(fā)［7］等。目前對植物多糖的生物活性和功能已有較多研究，如免疫調(diào)節(jié)［8-9］、抗氧化［10］、抗衰老［11］、抗癌［12-13］、抗菌［14］、降血糖［15］等，但鐵皮石斛多糖對小鼠胚胎干細胞的作用藥效在國內(nèi)外尚未見其相關報道，本實驗對此進行了相關的探索研究。

1　材料

1.1儀器 PRISM?7900HT熒光定量PCR儀（ABI公司）；SynergyTMH1全能酶標儀（Bio Tek公司）；核酸蛋白測定儀（Eppendorf公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo Forma公司）；ECLIPSETS100倒置相差顯微鏡（Nikon公司）；YJ-1450醫(yī)用凈化工作臺（蘇州金燕凈化設備廠公司）；HIMAC高速離心機（Hitachi公司）；冷凍干燥機（FD-1A-50，Bi1on公司）；Cryo 1℃程序細胞凍存盒（Na1gene Labware公司）。

1.2細胞株 小鼠胚胎成纖維細胞（Mouse embryo fibrob1asts，MEF）取自妊娠13.5 d的ICR小鼠，所用小鼠購于浙江省醫(yī)學科學院；小鼠胚胎干細胞（Mouse embryonic stem ce11s，MES）細胞系D3由中科院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物研究所惠贈。

1.3試藥 鐵皮石斛全草購于浙江臺州鐵皮石斛種植基地，經(jīng)浙江大學生命科學學院張銘教授鑒定為鐵皮石斛Dendrobium officinale。

噻唑藍（MTT）、絲裂霉素C、二甲基亞砜（DMSO）、乙二胺四乙酸二鈉鈣（EDTA）、明膠、堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒均購自Sigma公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司，胎牛血清購于杭州四季青生物公司；胰蛋白酶購于Hyc1one公司，Trizo1購于Invitrogen公司；REVER Tra Ace?qPCR RT Kit和THUNDERBIRD SYBR? qPCR Mix購于TOYOBO公司。

2　方法

2.1鐵皮石斛多糖的提取 取新鮮的鐵皮石斛全草適量，清水洗滌除去雜質(zhì)，100℃殺青后于60℃烘箱中烘干、粉碎，過60目篩，取其干燥粉末。用傳統(tǒng)水提醇沉法［16］提取鐵皮石斛粗多糖。所提粗多糖用Sevage法脫蛋白：加入1/5倍體積三氯甲烷-正丁醇（4∶1）混合液劇烈振搖20～30 min，3 000 r/min離心5 min，分去水層和溶液層交界處的變性蛋白質(zhì)，重復4～5次；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮、醇析、冷凍干燥得鐵皮石斛多糖。

2.2鐵皮石斛多糖對小鼠胚胎干細胞克隆形成率的影響 絲裂霉素C處理后的MEF按5.0×104個/孔的密度接種到24孔板中作為飼養(yǎng)層；取對數(shù)生長期的D3細胞，用含0.02%EDTA的0.05%胰酶消化，以每孔500個細胞的密度種到飼養(yǎng)層上，加入終質(zhì)量濃度分別為0（對照）、25、50、100、200、400μg/mL的鐵皮石斛多糖完全培養(yǎng)液，每個質(zhì)量濃度做4個重復，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)3～4 d后用堿性磷酸酶試劑盒按說明書步驟進行ALP染色，在相差顯微鏡下觀察D3細胞克隆染色情況并計數(shù)分析。

2.3鐵皮石斛多糖對小鼠胚胎干細胞增殖的影響

將對數(shù)生長期的D3細胞消化計數(shù)后，以4.0×103個/孔的細胞密度接種到0.5%明膠包被的96孔板中。培養(yǎng)24 h后更換成含鐵皮石斛多糖質(zhì)量濃度分別為0（對照）、25、50、100、200、400 μg/mL的完全培養(yǎng)液，每個多糖質(zhì)量濃度做4個重復，并做只加培養(yǎng)液的空白孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后的細胞按已報道方法［17］進行MTT染色，在490 nm下用酶標儀測定各孔吸光值。以各個樣品組的吸光度值減去空白對照孔的吸光度值作為各組真實的吸光度值以反映細胞的增殖水平。

2.4鐵皮石斛多糖對小鼠胚胎干細胞多潛能性的影響 絲裂霉素C處理后的MEF按4.0×105個/孔的密度接種到6孔板中作為飼養(yǎng)層；按2.0× 104個/孔的細胞量接種對數(shù)生長期的D3細胞到飼養(yǎng)層上，培養(yǎng)24 h后換成含鐵皮石斛多糖的培養(yǎng)液（終質(zhì)量濃度分別為0、50、100、200、400 μg/mL）。每個質(zhì)量濃度做3個重復，每天換液。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，收集細胞，用Trizo1提取RNA后用REVER Tra Ace?qPCR RT Kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后以β-actin為內(nèi)參，實時熒光定量PCR（qPCR）檢測小鼠胚胎干細胞干性相關基因Nanog、Oct4、Sox2、K1f4、Lin28、Rex1和Aire［18］的相對表達量。

2.5統(tǒng)計學處理 應用SPSS 20軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，各變量均以實驗組±s表示，組間比較采用t檢驗，應用Origin 8.0軟件對實驗結(jié)果進行繪圖分析。

3　結(jié)果

3.1鐵皮石斛多糖對小鼠胚胎干細胞克隆形成率的影響 克隆形成率試驗結(jié)果顯示，鐵皮石斛多糖的質(zhì)量濃度在50～200μg/mL時可以提高小鼠胚胎干細胞克隆形成率，并且當質(zhì)量濃度為100μg/mL時作用最為顯著，結(jié)果見表1。

表1　不同質(zhì)量濃度鐵皮石斛多糖對m ES克隆形成率的影響（±s，n=3）Tab.1 CIonogenic assay ofm ES ceIIs treated w ith poIysaccharides from Dendrobium officinale（±s，n=3）

表1　不同質(zhì)量濃度鐵皮石斛多糖對m ES克隆形成率的影響（±s，n=3）Tab.1 CIonogenic assay ofm ES ceIIs treated w ith poIysaccharides from Dendrobium officinale（±s，n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

質(zhì)量濃度/（μg·mL-1）克隆數(shù)/個增長率/% 0 310±6.56—25 315±6.03 0.93 50 353±8.74**7.6 100 378±8.62**13.67 200 327±6.66*3.33 400 305±6.24-0.93

3.2鐵皮石斛多糖對mES增殖的影響 不同質(zhì)量濃度的鐵皮石斛多糖對mES作用不同時間的實驗結(jié)果顯示，鐵皮石斛多糖質(zhì)量濃度在50～200 μg/mL時，作用24、48和72 h對mES的增殖均有顯著的促進作用，如圖1；同一作用時間時，曲線均在鐵皮石斛多糖質(zhì)量濃度為100μg/mL時達到最高點，說明質(zhì)量濃度為100μg/mL時促進作用最為顯著，為促進mES增殖的最適宜濃度。

圖1　不同質(zhì)量濃度鐵皮石斛多糖對m ES增殖的影響（±s，n=4）Fig.1　Effect of poIysaccharides from Dendrobium officinale on proIiferation ofmES ceIIs（±s，n=4）

3.3鐵皮石斛多糖對mES多潛能性的影響 qRTPCR結(jié)果顯示，實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（50～400 μg/mL）鐵皮石斛多糖對小鼠胚胎干細胞D3干性相關基因Oct4、Aire、Lin28的表達量無顯著影響；50μg/mL的質(zhì)量濃度可以提高Nanog、Sox2、K1f4的表達量，100μg/mL有利于Nanog、Rex表達量的提高，如圖2。這些結(jié)果說明鐵皮石斛多糖在促進mES的增殖的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（50～200 μg/mL）并不影響其干性相關基因的表達，甚至有些質(zhì)量濃度（如50，100μg/mL）還可以促進某些干性基因（如Nanog，Sox2，K1f4和Rex）的上調(diào)，因此鐵皮石斛多糖在一定程度上有利于mES的自我更新及多潛能性的維持。

4　討論

近年來，天然多糖的研究逐漸受到人們重視，多糖類作為一類信息物質(zhì)參與機體分子和細胞識別，在受精、發(fā)生、發(fā)育、分化、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)衡態(tài)的維持等方面起著重要作用［19］。石斛多糖是天然多糖中重要的一員，是鐵皮石斛中重要的活性成分，關于石斛多糖的研究亦已有不少報道［8-12，14］，然而對其細胞藥效學的研究較少，本實驗研究了鐵皮石斛多糖對小鼠胚胎干細胞的影響。胚胎干細胞具有自我更新的特性及分化為機體三個胚層來源的所有約220種成體細胞類型的潛能［20］，是研究早期胚胎發(fā)生、細胞組織分化、基因表達調(diào)控等發(fā)育生物學事件的一個理想模型，更重要的是人ES細胞可為臨床上細胞移植、組織替代和器官克隆提供新的細胞來源［5-6］，為多種難治性疾病的治療帶來希望，具有重要的理論價值和廣泛的醫(yī)學臨床應用前景。

圖2　鐵皮石斛多糖對m ES干性相關基因表達量的影響（±s，n=3）Fig.2　Effect of po Iysaccharides from Dendrobium officinale on the expression of m ES-marker genes（±s，n=3）

本實驗從克隆形成率、增殖速率及多潛能性等方面初步研究了鐵皮石斛多糖對小鼠胚胎干細胞的作用，對于更好地理解和調(diào)控胚胎干細胞在體外培養(yǎng)中的行為、誘導胚胎干細胞的定向分化、以及了解胚胎發(fā)育過程的機制等有重要的意義。然而鐵皮石斛粗多糖作用于小鼠胚胎干細胞的具體機制尚需要進一步的探討，此外，對于人的胚胎干細胞及其他類型的干細胞如骨髓干細胞、神經(jīng)干細胞等是否有不同藥效也需進一步的探索研究。

致謝

本實驗在浙江大學生命科學學院張銘教授的實驗室進行，向趙小立老師及實驗室的所有同學表示由衷的感謝。

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Effect of poIysaccharides from Dendrobium officinale on mouse embryonic stem ceIIs

LIU Ya-juan1，3， WU Jiang-1in2， WANG Shi-hao3， ZHANG Ming3， HUA Yun-fen1*
（1.Pharmaceutical College，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310012，China；2.Pesticide Verification Management of Zhejiang Province，Hangzhou 310020，China；3.College of Life Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

AIM To study the effect of po1ysaccharides from Dendrobium officinale on mouse embryonic stem ce11s.METHODS Po1ysaccharides from Dendrobium officinale were pre1iminari1y extracted in water and precipi-tated in ethy1a1coho1and purified by removing proteins，then app1ied tomouse embryonic stem ce11s（mES）which were cu1tured in vitro for 24、48 and 72 hours at different concentrations.C1onogenic assay and MTTmethodswere used to determine ce11activity and pro1iferation and qRT-PCRmethod was used to detect the re1evant expression of mES-marker genes.RESULTS The resu1ts showed that the c1oning efficiency and MTT absorbance in po1ysaccharides from Dendrobium officinale（50-200μg/mL）group were higher than that of the contro1 group，meanwhi1e，there was not significant difference in the re1evant expression ofmES-marker genes between the two groups. CONCLUSION Po1ysaccharides from Dendrobium officinale can marked1y promote the pro1iferation and c1oning efficiency ofmES ce11swith unchanged p1uripotency.

Dendrobium officinale；po1ysaccharides；mouse embryonic stem ce11s（mES）；pro1iferation

R285.5

A

1001-1528（2015）01-0012-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.003

2014-03-12

浙江省自然科學基金（LQ12C02003）

劉亞娟（1987—），女，碩士生，主要從事研究藥物分析及胚胎干細胞方向的研究。Te1：15868840442，E-mai1：1iu_yajuan @126.com

華允芬，男，副教授，主要從事天然活性多糖的化學成分及藥理藥效學研究。Te1：13173696879，E-mai1：huayfyxwd@ hotmai1.com